124
ANTIBAKTERI DARI EKSTRAK KASAR DAUN GAMBIR
(
Uncaria gambir
var Cubadak) METODE
MICROWAVE-ASSISTED EXTRACTION
TERHADAP BAKTERI PATOGEN
Antibacterial from Gambier Leaves Crude Extract
(
Uncaria gambir
var
Cubadak) Microwave-Assisted Extraction Method against Bacterial Pathogens
Novi Vensia Magdalena1*, Joni Kusnadi1
1) Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, FTP Universitas Brawijaya Malang Jl. Veteran, Malang 65145
*Penulis Korespondensi, Email: novi_vensia_magdalena@yahoo.com
ABSTRAK
Gambir (Uncaria gambir) varietas Cubadak merupakan tanaman perdu yang memiliki kadar polifenol tinggi, yaitu katekin dan tanin yang bersifat sebagai antibakteri. Metode ekstraksi yang digunakan adalah MAE (Microwave-Assisted Extraction). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh daya microwave dan rasio bahan:pelarut (b/v) terhadap perlakuan analisis. Metode penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan 2 faktor, yaitu daya microwave (320, 560 dan 800 Watt) dan rasio bahan:pelarut (1:25, 1;35 dan 1:45 (b/v)). Hasil terbaik diperoleh dari perlakuan daya microwave 560 Watt dan rasio bahan:pelarut 1:35 (b/v) dengan hasil rendemen 63.29%, total fenol 5581.58 ppm, aktivitas antibakteri Escherichia coli ATCC 25922 12.07 mm, Salmonella typhimurium 12.57 mm, Staphylococcus aureus ATCC 29213 13.99 mm dan Bacillus cereus 14.38 mm. KHM untuk Escherichia coli ATCC 25922 100%, Salmonella typhimurium 90%, Staphylococus aureus ATCC 29213 90% dan Bacillus cereus 80%, sedangkan KBM belum dapat diketahui.
Kata kunci: Aktivitas Antibakteri, Bakteri Patogen, Daun Gambir Cubadak, Microwave Assisted Extraction
ABSTRACT
Gambier (Uncaria gambir) Cubadak variety is a shrub plant which has high levels of polyphenols, those are catechins and tannins can be used as antibacterial. The extraction method which is used is MAE (Microwave-Assisted Extraction). Objectives of this research were to find out the effect of microwave power and material: solvent ratio (w/v) against analysis treatment using Randomized Block Design (RBD) by two factors, those are microwave power (320, 560 and 800 Watt) and material:solvent ratio (1:25, 1:35 and 1:45 (w/v)). The best result was obtained from microwave power 560 Watt and material:solvent ratio 1:35 (w/v) with the result of yield 63.285%, total phenol 5581.581 ppm, antibacterial activity of Escherichia coli ATCC 25922 12.07 mm, Salmonella typhimurium 12.57 mm, Staphylococcus aureus ATCC 29213 13.99 mm and Bacillus cereus 14.38 mm. MIC of Escherichia coli ATCC 25922 100%, Salmonella typhimurium 90%, Staphylococus aureus ATCC 29213 90% and Bacillus cereus 80%, while MBC could not be known.
Keywords: Antibacterial Activity, Bacterial Pathogens, Cubadak Gambier Leaves, Microwave Assisted Extraction
PENDAHULUAN
125 [1]. Secara tradisional, tanaman ini dimanfaatkan sebagai bahan penyamak kulit dan pewarna, sebagai bahan campuran dalam menyirih dan telah banyak digunakan sebagai obat tradisional, diantaranya untuk obat luka bakar, obat diare dan disentri serta obat kumur-kumur pada sakit kerongkongan [2].
Pemanfaatan gambir pada produk pangan selama ini masih terbatas sehingga menyebabkan gambir belum dimanfaatkan secara optimal serta kurangnya pengetahuan masyarakat dalam metode mengekstraksi gambir. Varietas gambir yang paling banyak ditanam petani dan memiliki kadar polifenol yang tinggi adalah tipe gambir Cubadak [3].
Komponen fitokimia terbanyak pada daun gambir ialah flavonoid dengan komponen utamanya katekin sebesar 75%, yang mengindikasikan bahwa tanaman gambir diduga memiliki aktivitas sebagai antibakteri [4]. Oleh karena itu, dibutuhkan senyawa antibakteri yang mampu menghambat atau membunuh pertumbuhan bakteri patogen penyebab kerusakan pangan, seperti Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus ATCC 29213 dan Bacillus cereus.
Pemilihan dan penggunaan metode ekstraksi yang tepat diperlukan agar mendapatkan ekstrak daun gambir dengan konsentrasi senyawa fenolik yang tinggi. Pemilihan metode ekstraksi sangat penting dilakukan karena hasil ekstraksi akan mencerminkan tingkat keberhasilan metode tersebut dalam mengeluarkan senyawa fenol dari matriks bahan ke dalam pelarut [5].
MAE adalah metode ekstraksi yang memanfaatkan radiasi gelombang mikro untuk mempercepat ekstraksi selektif melalui pemanasan pelarut secara cepat dan efisien [6]. Ekstraksi berbantu gelombang mikro memiliki kelebihan dibandingkan esktraksi dengan pemanasan konvensional. Kelebihan tersebut diantaranya, waktu ekstraksi yang lebih cepat, kebutuhan pelarut lebih sedikit dan rendemen ekstraksi yang lebih tinggi.
Selama ini belum dilakukan penelitian mengenai pengaruh daya microwave dan rasio bahan:pelarut terhadap proses ekstraksi daun gambir Cubadak menggunakan MAE (Microwave Assisted Extraction). Daya microwave dan rasio bahan:pelarut merupakan dua faktor yang mempengaruhi satu sama lain untuk hasil ektraksi yang baik. Volume pelarut dan daya ekstraksi merupakan faktor kristis dalam MAE [7].
BAHAN DAN METODE
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun gambir Cubadak segar yang dipasok dari perkebunan gambir di Medan dengan karakteristik meliputi warna daun hijau muda, berada pada ranting urutan ke-4 atau 5 dari ujung dan usia tanaman 1.5-2 tahun. Kultur murni Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 29213 dan Bacillus cereus didapatkan dari laboratorium Mikrobiologi Pangan, Jurusan Teknologi Hasil pertanian, Universitas Brawijaya. Sedangkan kultur murni Salmonella typhimurium diperoleh melalui hasil isolasi dari pasien penderita demam typhoid yang didapat dari Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Brawijaya. Bahan kimia meliputi asam galat standar 1000 μg/L, akuades, reagen Folin-Ciocalteau (diencerkan 1:10 dengan akuades) dan larutan NaCO3 75 g/L.
Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi pengering kabinet, neraca analitik (Mettle denver AA 200), ayakan 60 mesh (W.S Tyler), blender kering (Quantum), microwave oven (Metrowealth MW 1125B, daya maksimum 850 W), kulkas (Toshiba), spektrofotometer UV-VIS (Unico uv-210), autoklaf (HL-36 AE Hiramaya), mikropipet non-fixed 1000 μl (finnpipette labsystem), laminar air flow, borer 6 mm, kulkas (Toshiba), inkubator (WTB Binder), jangka sorong (Ticle ketelitian 0.05 mm)
Desain Penelitian
126 bahan:pelarut (1:25, 1:35, dan 1:45 (b/v)). Analisis data dilakukan dengan metode Analysis of Varian (ANOVA) untuk mengetahui apakah ada perbedaan atau pengaruh pada tiap perlakuan dan dilanjutkan dengan uji BNT atau DMRT dengan taraf nyata (α=0.05). Pemilihan perlakuan terbaik dengan metode Zeleny.
Tahapan Penelitian
Penelitian dilakukan dalam dua tahap, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian lanjutan. Hasil penelitian pendahuluan berupa jangkauan daya microwave 320 W (power level 4) - 800 W (power level 10), rasio bahan:pelarut 1:25, 1:35 dan 1:45 (b/v), adanya aktivitas antibakteri pada daun gambir dan kurva pertumbuhan 4 bakteri uji. Penelitian lanjutan dilakukan untuk mengetahui pengaruh daya microwave dan rasio bahan:pelarut terhadap rendemen ekstrak kasar, total fenol, aktivitas antibakteri dan KHM (Konsentrasi Hambat Minimal) serta KBM (Konsentrasi Bunuh Minimal) dari perlakuan terbaik.
Metode
Metode yang digunakan untuk perhitungan rendemen ekstrak kasar daun gambir Cubadak adalah metode gravimetri, analisis total fenol menggunakan metode spektrofotometri, pengujian aktivitas antibakteri menggunakan metode difusi sumuran (well diffusion plate assay), serta pengujian KHM dan KBM ekstrak kasar daun gambir Cubadak menggunakan metode dilusi.
Prosedur Analisis
1. Pembuatan Serbuk Daun Gambir Cubadak
Daun gambir Cubadak segar dari perkebunan Gambir di Medan, Sumatera Utara dipanen pukul 08.00 WIB. Pemanenan daun dari tanaman gambir dilakukan pada umur 1.5-2 tahun dengan cara pemangkasan ujung ranting. Daun gambir diterima di Malang keesokan harinya pada pukul 13.00 WIB. Daun segar 1 kg dicuci dan disortasi berdasarkan warna hijau muda, utuh, segar dan posisi daun 4-5 dari ujung ranting. Daun gambir segar dikeringkan dalam pengering kabinet suhu 60°C selama 4 jam. Daun gambir kering dihancurkan dengan blender kering selama 5 menit, lalu diayak 60 mesh [8].
2. Pembuatan Ekstrak Kasar Daun Gambir Cubadak
Serbuk daun gambir Cubadak ditimbang 1 gram, dilarutkan dalam akuades dengan perbandingan rasio bahan dan pelarut adalah 1:25, 1:35, dan 1:45, diradiasi pada 320 W (power level 4) pada gelas beaker 250 ml transparan Pyrex selama 4 menit untuk masing-masing perlakuan. Kemudian diulang dengan waktu dan rasio bahan:pelarut yang sama pada daya yang berbeda, yaitu 560 W (power level 7) dan 800 W (power level 10). Ekstrak kasar disaring dua kali dengan dengan kertas saring halus, ditempatkan pada botol kaca yang telah dilapisi aluminium foil dan disimpan pada lemari pendingin suhu 4°C [8].
3. Analisis Rendemen
Ditimbang massa awal (simplisia+akuades) sebelum diradiasi gelombang mikro, ditimbang massa akhir (ekstrak kasar cair hasil penyaringan dua kali) dan dhitung rendemen (% b/b) dengan persamaan [9]:
rendemen (%b/b) = massa akhir x 100 % massa awal
4. Prosedur Pembuatan Kurva Standar Asam Galat
127 5. Prosedur Analisis Total Fenol
Diukur sampel yang akan diuji dengan volume 1 ml, ditambahkan larutan Na2CO3 75 g/L 4 ml dan reagen Follin-Ciocalteau (diencerkan 1:10) 5 ml, divortex, diinkubasi selama 1 jam di suhu ruang pada kondisi gelap, diambil 2 ml ekstrak diisikan ke dalam kuvet, diukur
absorbansi pada panjang gelombang (λ) 765 nm, dikalibrasikan dengan kurva standar asam
galat untuk didapatkan total fenol dalam μg GAE/ml dan ihitung total fenol dalam μg GAE/g dengan persamaan [10]:
C = CGAE x V G Keterangan:
C = kadar total fenol (μg/g)
CGAE = kadar total fenol dalam bentuk ekuivalen asam galat (μg/ml) V = volume ekstrak yang dihasilkan (ml)
G = massa bahan (g)
6. Pembuatan Kurva Pertumbuhan
Kultur murni E. coli ATCC 25922, S. typhimurium, S. aureus ATCC 29213 dan B. cereus masing-masing diambil 1 koloni dari stok kultur NA miring yang telah diremajakan. Diinokulasi pada NB steril 8 ml secara aseptis, diinkubasi suhu 37°C selama 24 jam dan divortex. Sebanyak 2.5 ml kultur umur 24 jam diambil dan dimasukan ke dalam erlenmeyer 100 ml berisi 97.5 ml media NB steril. Kemudian diinkubasi pada shaker waterbath pada suhu 37ºC dengan kecepatan 125 rpm. Setiap interval waktunya dilakukan pengambilan 2 ml untuk dilakukan pengukuran nilai absorbansi awal menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang (ʎ) 630 nm. Selanjutnya, diambil 1 ml untuk 3 seri pengenceran akhir tertentu dengan larutan pepton, untuk ditumbuhkan pada media NA steril dengan metode pour plate. Diinkubasi di inkubator suhu 37°C dan dilakukan perhitugan jumlah koloni dengan metode SPC [11].
7. Prosedur Analisis Aktivitas Antibakteri
Nutrient agar 20 ml untuk tiap cawan yang telah disterilisasi, didinginkan hingga suhu 37ºC, ditumbuhkan E. coli ATCC 25922 umur 8.7 jam, S. typhimurium 6.7 jam, B. cereus 8.6 jam dan S.aureus ATCC 29213 umur 9.8 jam (dengan memastikan absorbansi sesuai kurva pertumbuhan agar jumlah bakteri 107 CFU/ml) dengan memasukkan 40 μL metode pour plate, diinkubasikan di suhu kamar pada laminar air flow hingga agar memadat, dibuat sumuran (well) dengan borer 6 mm untuk tiap perlakuan, diisi ekstrak sampel tiap perlakuan 60 μL pada sumuran, diberikan waktu penyerapan ekstrak ke dalam media dengan ditempatkan pada lemari pendingin 12 jam, diinkubasi suhu 37ºC selama 24 jam, diukur diameter hambat setiap 1 jam dengan jangka sorong, diameter hambat adalah besarnya diameter pengukuran dikurangi diameter sumuran [12].
8. Prosedur uji KHM (Konsentrasi Hambat Minimal)
Disiapkan ekstrak hasil perlakuan terbaik dengan konsentrasi 10-100%, disiapkan NB steril 8.8 ml per tabung per konsentrasi ekstrak yang diuji untuk tiap bakteri, ditambahkan ekstrak pada konsentrasi tertentu sebanyak 1 ml secara aseptis, ditambahkan kultur bakteri E. coli ATCC 25922, S. typhimurium, S. aureus ATCC 29213 dan B. cereus dalam NB (jumlah bakteri 106 CFU/ml) sebanyak 200 μl, divortex agar homogen, diambil 2 ml untuk diukur absorbansi awal λ=630 nm, diinkubasi 18 jam suhu 37°C, divortex, diukur absorbansi akhir λ=630 nm, jika selisih absorbansi akhir dan awal negatif maka dinyatakan sebagai tabung positif. KHM merupakan konsentrasi terendah dari tabung positif [11].
9. Prosedur uji KBM (Konsentrasi Bunuh Minimal) (Sari, 2010)
128 HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Rerata Rendemen Ekstrak Kasar
Daya microwave akan memberikan pengaruh dengan menguapkan pelarut (akuades), sehingga volumenya berkurang. Daya microwave memberikan panas yang menyeluruh dalam sampel, dimana panas tersebut bertindak sebagai kekuatan pendorong untuk menghancurkan matriks bahan sehingga senyawa-senyawa dalam bahan dapat berdifusi keluar dan terurai di dalam pelarut [14]. Rasio bahan:pelarut juga memberikan pengaruh pada rendemen ekstrak kasar yang dihasilkan. Semakin banyak volume pelarut yang digunakan, maka rendemen ekstrak kasar yang dihasilkan semakin banyak pula. Pengaruh daya microwave dan rasio bahan:pelarut pada rendemen ekstrak kasar (% b/b) disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1. Diagram Pengaruh Daya Microwave dan Rasio Bahan:Pelarut terhadap Rerata Rendemen Ekstrak Kasar Daun Gambir Cubadak
Berdasarkan Gambar 1, dapat terlihat bahwa kombinasi tiap perlakuan daya microwave dan rasio bahan:pelarut memberikan hasil rerata rendemen ekstrak kasar yang berbeda-beda. Nilai rerata rendemen ekstrak kasar tertinggi, yaitu sebesar 78.18% terdapat pada perlakuan daya 320 W dan rasio bahan:pelarut 1:45 (b/v). Kombinasi perlakuan daya 320 W dan rasio bahan:pelarut 1:45 (b/v) dapat menghasilkan rerata rendemen ekstrak kasar dengan perolehan yang lebih tinggi dibandingkan dengan kombinasi perlakuan lainnya.
Perolehan rendemen tertinggi pada kombinasi perlakuan daya 320 W dan rasio bahan:pelarut 1:45 (b/v) diduga panas yang dihasilkan dari perlakuan daya rendah hanya menguapkan sedikit pelarut dan pemberian volume pelarut yang lebih tinggi menyebabkan perpindahan panas menjadi lebih sulit. Tingginya jumlah rendemen yang diperoleh akibat perlakuan tersebut adalah rendemen yang diharapkan. Namun, rendemen ekstrak cair yang tinggi akan menghasilkan senyawa target (fenolik) yang rendah. Secara umum dengan meningkatnya daya ekstraksi, maka rendemen senyawa target yang diekstrak meningkat, namun akan menurun karena mengalami degradasi secara termal [15].
Kombinasi perlakuan daya rendah, yaitu sebesar 320 W dan rasio bahan:pelarut 1:45 (b/v) menghasilkan rendemen tertinggi, tetapi pada perlakuan tersebut senyawa fenolik yang diharapkan belum terekstrak dengan baik. Adanya pelarut air yang berlebih mengakibatkan terjadinya pembengkakan berlebih (excessive swelling) pada material yang diekstraksi yang berakibat timbulnya thermal stress yang berlebih yang disebabkan oleh timbulnya panas yang cepat pada larutan akibat dari penyerapan gelombang mikro oleh air. Thermal stress yang berlebih akan berakibat negatif terhadap senyawa-senyawa fitokimia [16].
129 2. Total Fenol
Pengaruh daya microwave dapat dilihat dari seberapa besar energi panas (Joule) per detik yang diberikan pada bahan, sedangkan rasio bahan:pelarut mempengaruhi proses kontak antara partikel dalam bahan dengan banyaknya pelarut yang digunakan. Gelombang mikro berperan sebagai vektor energi kepada bahan yang mampu menyerap energi elektromagnetik dan mengubahnya menjadi panas [6]. Panas tersebut akan membantu proses pemecahan matriks sel daun gambir Cubadak, sehingga senyawa antibakteri (katekin dan tanin) yang diharapkan dapat diekstrak oleh pelarut (akuades) dan dapat terlihat dari total fenol yang diperoleh. Pengujian total fenol pada setiap perlakuan percobaan diperoleh dengan nilai total fenol dalam satuan μg/g (berdasarkan per satu gram bahan) atau ppm (part per million) GAE (Gallic Acid Equivalent). Hasil uji total fenol ekstrak kasar akibat pengaruh perlakuan daya microwave dan rasio bahan:pelarut disajikan pada Gambar 2.
Gambar 2. Diagram Pengaruh Daya Microwave dan Rasio Bahan:Pelarut terhadap Rerata Total Fenol
Berdasarkan Gambar 2, dapat diketahui bahwa nilai rerata total fenol tertinggi diperoleh dari proses ekstraksi dengan perlakuan daya 560 W dan rasio bahan:pelarut 1:35 (b/v), yaitu 5581.581 ppm. Hal ini membuktikan bahwa kombinasi perlakuan tersebut menghasilkan total fenol yang paling tinggi dibandingkan dengan kombinasi perlakuan lainnya. Waktu ekstraksi yang dilakukan selama proses pengekstraksian menggunakan MAE tersebut adalah 4 menit pada setiap perlakuan. Waktu 4 menit adalah waktu terbaik untuk bahan (daun gambir Cubadak) kontak dengan energi panas pada daya 510 W [17].
Perlakuan daya 560 W menjadi perlakuan daya ekstraksi terbaik dibandingkan daya lainnya dan diduga dapat memecah matriks sel daun gambir Cubadak dengan efektif akibat energi panas hasil penyerapan energi elektromagnetik oleh bahan, sehingga pelarut akuades mampu melarutkan maupun mengekstrak senyawa fenolik dalam matriks sel daun gambir Cubadak dengan baik. Peningkatan panas radiasi gelombang mikro memanaskan dan menguapkan air sel bahan. Tekanan pada dinding sel meningkat, menyebabkan peningkatan volume yang akan membuat sel pecah, melepaskan isinya ke dalam fase cairan. Ketika fase cair menyerap gelombang mikro, energi kinetik molekul meningkat, sehingga laju difusi meningkat dan menghasilkan transfer massa yang lebih cepat. Namun, perlakuan daya yang terlalu tinggi dapat mengakibatkan energi panas yang terbentuk menjadi berlebihan, sehingg senyawa fenolik dalam bahan menjadi rusak atau terdegradasi [18].
130 Pelarut yang berlebihan menyebabkan pemanasan microwave menjadi kurang baik, sehingga radiasi microwave diserap oleh pelarut dan penambahan daya dibutuhkan [14].
Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa perlakuan daya microwave, rasio bahan:pelarut, serta interaksi antar perlakuan memberikan pengaruh yang nyata (α=0.05) terhadap rerata total fenol ekstak kasar daun gambir Cubadak yang diperoleh.
3. Aktivitas Antibakteri
Berdasarkan hasil analisis ragam, perlakuan daya microwave, rasio bahan:pelarut dan interaksi antar perlakuan memiliki pengaruh nyata (α=0.05) terhadap rerata diameter hambat yang terbentuk. Daya microwave dan rasio bahan:pelarut merupakan faktor dalam MAE yang mempengaruhi hasil ekstraksi, khususnya total fenol. Terdapat korelasi positif antara total komponen fenol dengan aktivitas antibakteri [19]. Rerata diameter daya hambat bakteri uji tiap perlakuan disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Rerata Diameter Daya Hambat Bakteri Uji pada Tiap Perlakuan Perlakuan Rerata Diameter Daya Hambat (mm)* Rasio
Keterangan : * Angka yang didampingi huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata (α=0.05) pada tiap bakteri
Berdasarkan Tabel 1, dapat dilihat bahwa rerata diameter daya hambat yang paling tinggi pada setiap bakteri uji ditunjukkan pada perlakuan daya 560 W dengan rasio bahan:pelarut 1:35 (b/v). Hal ini membuktikan bahwa proses ekstraksi serbuk daun gambir Cubadak yang dilakukan pada rasio bahan:pelarut 1:35 (b/v) dengan daya sebesar 560 W dapat mengoptimalkan perolehan senyawa fenolik yang bersifat antibakteri (katekin dan tanin), sehingga aktivitas antibakteri yang dihasilkan memiliki pengaruh yang optimal pula.
Daya 560 W diduga merupakan perlakuan daya terbaik yang dapat memecah sel daun gambir, sehingga senyawa antibakteri yang diharapkan dapat diperoleh dengan jumlah yang lebih tinggi. Dalam ekstraksi tanaman, daya microwave yang tinggi dapat menyebabkan hasil ekstraksi yang buruk akibat degradasi senyawa-senyawa yang sensitif terhadap panas. Pada daya microwave yang tinggi, yaitu 1000 W dalam ekstraksi flavonoid dari akar Radix astragali, yield ekstraksi menurun jika suhu ekstraksi lebih tinggi dari 110ºC dikarenakan ketidakstabilan flavonoid pada suhu-suhu tersebut. Paparan gelombang mikro yang berlebihan pada microwave akan menyebabkan hilangnya flavonoid akibat degradasi termal [20].
131 pengenceran. Semakin besar perbandingan bahan dengan pelarut maka proses pelarutan semakin baik karena kontak antara partikel dalam bahan pelarut semakin sering, namun jumlah pelarut yang berlebihan tidak akan mengekstrak lebih banyak [21].
Berdasarkan Tabel 1, dapat diketahui pula tingkat kerentanan bakteri uji, dimana rerata diameter daya hambat bakteri Gram negatif (Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium) cenderung lebih kecil daripada rerata diameter daya hambat pada bakteri Gram positif (Staphylococcus aureus ATCC 29213, Bacillus cereus). Nilai rerata diameter daya hambat yang semakin kecil menunjukkan bahwa bakteri uji tersebut memiliki tingkat keresistensian yang lebih tinggi.
Perbedaan aktivitas antibakteri yang terjadi pada bakteri Gram negatif dan bakteri Gram positif kemungkinan disebabkan oleh perbedaan komposisi dan struktur dinding sel pada kedua jenis bakteri tersebut. Struktur dinding sel bakteri gram positif lebih sederhana, yaitu berlapis tunggal dengan kandungan lipid yang rendah (1-4%) sehingga memudahkan bahan bioaktif masuk ke dalam sel. Struktur dinding sel bakteri gram negatif lebih kompleks, berlapis tiga, yaitu lapisan luar lipoprotein, lapisan tengah lipopolisakarida yang berperan sebagai penghalang masuknya bahan bioaktif antibakteri, dan lapisan dalam berupa peptidoglikan dengan kandungan lipid tinggi (11-12%) [22].
Kandungan flavonoid pada ekstrak kasar daun gambir Cubadak sangat efektif untuk menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dibandingkan bakteri Gram negatif. Flavonoid bersifat polar sehingga lebih mudah menembus lapisan peptidoglikan yang juga bersifat polar pada bakteri Gram positif daripada lapisan lipid yang nonpolar pada bakteri Gram negatif. Di samping itu, pada dinding sel Gram positif mengandung polisakarida (asam terikoat) merupakan polimer yang larut dalam air. Sifat larut inilah yang menunjukkan bahwa dinding sel Gram positif bersifat lebih polar [11]. Aktivitas penghambatan senyawa antibakteri pada ekstrak kasar daun Gambir Cubadak terhadap bakteri Gram positif menyebabkan terganggunya fungsi dinding sel sebagai pemberi bentuk sel dan melindungi sel dari lisis osmotik. Dengan terganggunya dinding sel akan menyebabkan lisis pada sel.
4. Konsentrasi Hambat Minimal (KHM)
Pada penelitian ini diperoleh perlakuan terbaik, yaitu daya microwave 560 W dan rasio bahan:pelarut 1:35 (b/v). Pada perlakuan tersebut, dapat dilakukan uji Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) pada hasil proses ekstraksi untuk mengetahui toksisitas selektif bahan aktif antimikroba serta konsentrasi minimal yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji. Pertumbuhan bakteri dapat diketahui dengan mengukur selisih antara absorbansi sebelum dan sesudah inkubasi. Jumlah sel bakteri dapat diukur dengan cara mengetahui kekeruhan (turbiditas) kultur [11]. Hasil pengukuran absorbansi pada uji KHM ekstrak kasar daun gambir Cubadak pada setiap bakteri uji dapat dilihat pada Tabel 2.
132
Salmonella typhimurium 10 0.03 0.51 0.48
20 0.04 0.47 0.43
30 0.05 0.49 0.43
40 0.07 0.41 0.34
50 0.11 0.35 0.25
60 0.12 0.29 0.17
70 0.14 0.27 0.13
80 0.20 0.24 0.04
90 0.22 0.22 -0.01
100 0.23 0.22 -0.01
Staphylococcus aureus 10 0.03 0.48 0.45
ATCC 29213 20 0.03 0.41 0.38
30 0.05 0.36 0.31
40 0.06 0.29 0.23
50 0.08 0.32 0.25
60 0.09 0.28 0.18
70 0.12 0.23 0.11
80 0.17 0.21 0.04
90 0.20 0.19 -0.01
100 0.22 0.20 -0.02
Bacillus cereus 10 0.03 0.42 0.39
20 0.04 0.38 0.35
30 0.05 0.36 0.31
40 0.07 0.32 0.25
50 0.09 0.27 0.18
60 0.10 0.22 0.12
70 0.12 0.19 0.07
80 0.16 0.15 -0.01
90 0.20 0.17 -0.03
100 0.22 0.17 -0.04
133 5. Konsentrasi Bunuh Minimal (KBM)
Konsentrasi Bunuh Minimal (KBM) merupakan konsentrasi terendah dari hasil positif uji Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) yang dapat membunuh bakteri uji. Kemampuan daya bunuh yang dimiliki suatu senyawa antibakteri pada ekstrak dapat diketahui dengan adanya uji KBM dengan melihat pada konsentrasi minimal berapakah dari ekstrak perlakuan terbaik yang mampu membunuh bakteri uji. Hasil positif uji KHM diperoleh dari seluruh konsentrasi yang menunjukkan nilai selisih OD adalah 0 atau kurang dari 0 (ΔOD ≤0), sedangkan hasil positif KBM ditunjukkan dengan tidak adanya koloni bakteri yang tumbuh dari konsentrasi ekstrak positif uji KHM pada media agar (Nutrient Agar) setelah inkubasi 18 jam. Berikut dapat dilihat hasil uji Konsentrasi Bunuh Minimal (KBM) dari hasil uji Konsentrasi Hambat Minimal (KHM) pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil Uji Konsentrasi Bunuh Minimal (KBM)
Bakteri Uji Konsentrasi
Positif Hasil Uji KHM (%)
Hasil Uji KBM (Tumbuh/Tidak)
Escherichia coli ATCC 25922 100 Tumbuh
Salmonella typhimurium 90 Tumbuh
100 Tumbuh
Staphylococcus aureus ATCC 29213 90 Tumbuh
100 Tumbuh
Bacillus cereus 80 Tumbuh
90 Tumbuh
100 Tumbuh
Berdasarkan Tabel 3, dapat terlihat bahwa senyawa antibakteri pada ekstrak kasar daun gambir Cubadak dengan konsentrasi ekstrak hasil uji positif KHM belum mampu membunuh masing-masing bakteri uji. Hal ini ditunjukkan dengan masih adanya pertumbuhan bakteri Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus ATCC 29213 dan Bacillus cereus pada seluruh agar cawan, sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak kasar daun gambir Cubadak tidak bersifat membunuh (bakteriosida), tetapi hanya bersifat menghambat (bakteriostatik) pertumbuhan setiap bakteri uji. Senyawa antibakteri tertentu aktivitasnya dapat meningkat dari bakteriostatik menjadi bakteriosida bila kadar senyawa antibakterinya ditingkatkan [24]. Penanaman larutan hasil uji positif KHM pada media pertumbuhan baru (NA) yang tidak terdapat senyawa penghambat menunjukkan hasil pertumbuhan koloni bakteri yang mencapai tingkat TBUD (Terlalu Banyak Untuk Dihitung) pada jam ke-18. Hal ini membuktikan bahwa senyawa fenolik dalam ekstrak kasar daun gambir Cubadak masih belum mampu membunuh setiap pertumbuhan masing-masing bakteri. Kemungkinan konsentrasi total fenol yang lebih tinggi diperlukan, sehingga mampu membunuh bakteri uji.
SIMPULAN
Kombinasi perlakuan daya microwave 560 W dan rasio bahan:pelarut 1:35 (b/v) merupakan perlakuan terbaik berdasarkan hasil uji rendemen, total fenol dan aktivitas antibakteri terhadap bakteri uji Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium,
Staphylococcus aureus ATCC 29213 dan Bacillus cereus, yang dihasilkan dari ekstrak kasar daun gambir Cubadak. Pada perlakuan terbaik tersebut, diperoleh nilai rendemen 63.29%, total fenol 5581.581 ppm, aktivitas antibakteri (diameter daya hambat) terhadap Escherichia coli ATCC 25922 12.07 mm, Salmonella typhimurium 12.57 mm, Staphylococcus aureus ATCC 29213 13.99 mm dan Bacillus cereus 14.38 mm.
134 kemampuan menghambat pada konsentrasi ekstrak 100%, Salmonella typhimurium pada konsentrasi ekstrak 90%, Staphylococus aureus pada konsentrasi ekstrak 90% dan Bacillus cereus pada konsentrasi ekstrak 80%. Sedangkan Konsentrasi Bunuh Minimal (KBM) belum dapat diketahui.
DAFTAR PUSTAKA
1) Isnawati, A. 2010. Analisis Kualitatif dan Kuantitatif Senyawa Katekin dan Kuersetin pada 3 Mutu Ekstrak Gambir. Pusat Penelitian dan Pengembangan Biomedis dan Farmasi Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Departemen Kesehatan RI. Jakarta
2) Nazir, M. 2000. Gambir: Budidaya, Pengolahan dan Prospek Diversifikasinya. Yayasan Hutanku. Padang
3) Murti, K. 2004. Analisis Status Hara N, P, K dalam Hubungannya dengan Hasil Tanaman Gambir (Uncaria gambir. Roxb) di Siguntur Pesisir Selatan, Sumatera Barat. Stigma XIII, 177-180
4) Hidayani, R. 2010. Pengaruh Penggunaan Pelarut Etanol dan Etil Asetat pada Ekstraksi Daun Gambir (Uncaria gambir Roxb.) Terhadap Aktivitas Antibakteri Patogen Pangan. Skripsi. Universitas Andalas. Padang
5) Salas, P.G., Aranzazu M.-S., Antonio S.-C., and Alberto F.-G. 2010. Phenolic-Compound-Extraction Systems for Fruit and Vegetable Samples. Molecules, 15, pp. 8813-8826
6) Jain, T., Jain V., Pandey R., Vyas A., and Shukla S.S. 2009. Microwave Assisted Extraction for Phytoconstituents–An Overview. Asian Journal Research Chemistry 1(2): 19-25
7) Dhobi, M., Mandal V., and Hemalatha S. 2009. Optimization of Microwave Assisted Extraction of Bioactive Flavonolignan-Silybinin. Journal of Chemical Metrology 1(3): 13-23
8) Rao, K., Aradhana R., Banjii D., Chaitanya R., and Kumar A.A. 2011. In-Vitro Anti-Oxidant and Free Radical Scavenging Activity of Various Extracts of Tectona grandis Linn Leaves. Journal of Pharmacy Research 2(4): 440-442
9) Widyawati, S.P., Wijaya C.H., Hardjosworo P.S., dan Sajuthi D. 2005. Evaluasi Aktivitas Antioksidatif Ekstrak Daun Beluntas (Pluchea indica Less) Berdasarkan Perbedaan Ruas Daun. Institut Pertanian Bogor. Bogor
10) Sharma, G.N. 2011. Phytochemical Screening and Estimation of Total Phenolic Content in Aegle marmelos Seeds. International Journal of Pharmaceutical and Clinical Research 2(3): 27-29
11) Dewi, F.K. 2010. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Buah Mengkudu (Morinda citrifolia, Linnaeus) terhadap Bakteri Pembusuk Daging Segar. Skripsi. Universitas Sebelas Maret. Surakarta
12) Jagessar, R., Mars A., and Gomes G. 2008. Selective Antimicrobial Properties of Phyllanthus acidus Leaf Extract Against Candida albicans, Escherichia coli and Staphylococcus aureus Using Stokes Disc Diffusion, Well Diffusion, Streak Plate and a Dilution Method. Nature and Science 2(6): 24-38
13) Sari, N. 2010. Daya Antibakteri Ekstrak Tumbuhan Majapahit (Crescentia cujete L.) terhadap Bakteri Aeromonas hydrophila. Skripsi. Institut Teknologi Sepuluh November. Surabaya
14) Chan, C.-H., Rozita Y., Gek-Cheng N., and Fabian W.-L.K. 2011. Microwave-Assisted Extractions of Active Ingredients from Plants. Journal of Chromatography A, 1218: 6213-6225
135 16) Wang, Y.L., Xi G.S., Zheng Y.C., and Miao F.S. 2010. Microwave Assisted Extraction of Flavonoids from Chinese Herb Radix puerariae (Ge Gen). Journal of Medicinal Plant Research 4(4): 304-308
17) Ferdiyan, Y. 2013. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kasar Daun Gambir Cubadak (Uncaria gambir var Cubadak) Metode Microwave-Assisted Extraction (Kajian Daya Microwave dan Waktu Ekstraksi). Skripsi. Universitas Brawijaya. Malang
18) Calinescu, I., Ciuculescu C., Popescu M., Bajenaru S., and Epure G. 2001. Microwave Assisted Extraction of Active Principles from Vegetal Material. Romanian International Conference on Chemistry and Chemical Engineering, 12: 1-6
19) Inna, M., Atmania N., dan Prismasari S. 2010. Potential Use of Cinnamomum burmanii Essential Oil-based Chewing Gum as Oral Antibiofilm Agent. Journal of Dentistry Indonesia 17(3): 80-86
20) Xiao, W., Lujia H., and Bo S. 2008. Microwave-Assisted Extraction of Flavonoids from Radix Astragali. Separation and Purification Technology, 62: 614–618
21) Setiawan, C. 2012. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Kasar Daun Jati Mas (Tectona grandis) Metode Microwave-Assisted Extraction terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus (Kajian Waktu Ekstraksi dan Rasio Pelarut:Bahan). Skripsi. Universitas Brawijaya. Malang
22) Salni, Hanifa M., dan Ratna W.M. 2011. Isolasi Senyawa Antibakteri dari Daun Jengkol (Pithecolobium lobatum Benth) dan Penentuan Nilai KHM-nya. Jurnal Penelitian Sains 14(1): 38-41
23) Haniah, M. 2008. Isolasi Jamur Endofit dari Daun Sirih (Piper Betle L.) Sebagai Antimikroba terhadap Escherichia coli, Staphylococcus aureus dan Candida albicans. Skripsi. Universitas Islam Negeri. Malang
