Prima Nanda Fauziah1*, Ernawati Arifin Giri-Rachman Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Jenderal Achmad Yani Cimahi
1Prodi Analis Kesehatan (D-III)
2Prodi Biologi, Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati, Institut Teknologi Bandung *Email: primanandafauziah@analis-ayani.ac.id
ABSTRAK
MDR-TB (Multidrug-Resistant Tuberculosis) dan XDR-TB (Extensivelydrug-Resistant Tuberculosis) adalah penyakit infeksi akibat resistensi antibiotik yang menjadi pandemik di seluruh dunia. Kemunculan MDR-TB dan XDR-TB menjadi alasan utama dalam pengembangan antituberkular baru yang bersifat multitarget. Obat antituberkular yang tersedia saat ini pada dasarnya hanya menarget satu produk gen untuk satu obat. Oleh karena itu, perlu dicari target obat yang dapat mengganggu beberapa gen di dalam Mycobacterium tuberculosis khususnya gen yang diketahui berperan dalam virulensi.Pengembangan antituberkular baru yang bersifat multitarget dengan menghambat sistem regulasi TCS (Two-component System) M. tuberculosis dapat berperan besar dalam pengobatan kasus resistensi tersebut.Kandidat antituberkularbaru yang akan diuji coba dapat dideteksi karena adanya kegagalan represi promoter. Pada penelitian ini, dilakukan analisis dan karakteristik motif-motif promoter gen zif23sebagai langkah awal dalam pengembangan sistem penapisan antituberkular baru. Promoter zif23 merupakan promoter sintetik dari organisme eukariot (Mus musculusdanSaccharomyces cerevisiae), tetapi mampu dikenali oleh RNA polimerase dan faktor sigma dari organisme prokariot. Motif promoter gen zif23 berukuran 52 pb telah berhasil dianalisis. Hasil penelusuran lebih lanjut menunjukkan bahwa ternyata motif-motif -10 Pribnow box (GATACT), motif -35 box (TTGACA), dan konsensus pengikatan zif23 (CCCACGCGCGTGGGA dan CCCACGCGCGTGGG) terdapat pada urutan DNA komplemen dari urutan DNA zif23 hasil sintesis.Analisis dan karakteristik promoter tersebut diharapkan dapat menjadi bagian dari pengembangan sistem penapisan yang dapat bermanfaat bagi pencarian antituberkular baru di Indonesia.
ABSTRACT
Multi-Drug Resistant Tuberculosis (MDR-TB) and Extensively-Drug Resistant Tuberculosis (XDR-TB) are among the most worrisome elements of the pandemic of antibiotic resistance. The emergence of Multi-Drug and Extensively-Drug Resistant Tuberculosis (MDR and XDR-TB) has revealed the need for the discovery of novel antitubercular drugs. The characteristic of current antitubercular drugs basically one drug which just targeting one gene product, hence we are trying to investigate a drug target which could influence a number of genes in Mycobacterium tuberculosis which are known to have a role in virulence. The development of an antitubercular drug active with multitarget pathways such as two component regulatory system (TCS) of Mycobacterium tuberculosis will potentially give a profound impact on MDR-TB and XDR-TB treatment programmes. The novel antitubercular drug candidates will be detected by the failure of repression at promoter. Zif23 promoter is a synthetic promoter from eukaryotic organism (Mus musculus and Saccharomyces cerevisiae), but recognized by RNA polymerase and sigma factor of prokaryotic organism. In this research we tried to analyze promoter motifs of zif23 synthetic promoter. Promoter motifs of 52 bp of zif23 gene was analyzed. Advance analysis showed that the 10 Pribnow box motif (GATACT), -35 box motif (TTGACA), and consensus binding site of zif23 (CCCACGCGCGTGGGA dan CCCACGCGCGTGGG) were located on the complement of DNA synthesized. It is expected that the construct could be part of high throughput screening system that can be usefull for generating novel drugs against tuberculosis in Indonesia.
Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit infeksi
saluran pernapasan akibat infeksi bakteri
Mycobacterium
tuberculosis
(
Mtb
)
dan
termasuk salah satu penyakit infeksi global
yang menyebabkan kematian di dunia (Barletta
dkk., 2013; Baussano dkk., 2013). Rendahnya
efektifitas obat antituberkular (OAT) yang
beredar saat ini menekankan perlunya
dikembangkan
obat
antituberkular
baru
dengan target yang lebih luas, bekerja cepat,
dan mampu mengeliminasi sifat-sifat virulensi
Mtb
sehingga
Mtb
akan dengan mudah
dihancurkan oleh sistem imun (Dover dkk.,
2008). Salah satu caranya adalah melalui
penghambatan sinyal transduksi yang berperan
dalam mekanisme regulasi transkripsi dari
banyak gen pada
Mtb
, termasuk gen yang
berperan dalam virulensi (Gupta dkk., 2006;
Koul dkk., 2011). Sistem sinyal transduksi
yang sederhana dan umum ditemukan pada
bakteri termasuk pada
Mtb
adalah
two-component system
(TCS) (Ryndak dkk., 2008).
TCS memiliki potensi untuk dijadikan sebagai
target obat antibakteri karena beberapa alasan.
Pertama, TCS sangat penting dalam
mengkoordinasikan ekspresi dari beberapa gen
termasuk faktor-faktor virulensi (gen penginduksi
respon stres pada sel) dan mekanisme
B.
MET
ODE
Pada penelitian ini digunakan metode
in silico
dalam proses analisis dan karakteristik
motif-Bioedit™ dan SnapGene™
.
drug-efflux pumps
. Kedua, proses
signalling
berupa fosforilasi histidin dalam tahap regulasi
pada bakteri berbeda dengan fosforilasi
serin/treonin dan tirosin pada eukariot tingkat
tinggi, termasuk manusia. Terakhir, sistem ini
dapat mengendalikan ekspresi gen-gen secara
simultan, sehingga mengurangi frekuensi
strain yang resisten terhadap obat (Okada dkk.,
2007). TCS dapat dikembangkan dalam suatu
sistem konstruksi gen untuk penapisan/
skrining secara
in vitro
dengan menyisipkan
promoter, repressor, dan gen target (TCS) serta
gen pelapor seperti GFP (
Green Fluorescent
Protein
) atau EmGFP (
Emerald
Green
Fluorescent
Protein
).
Sistem
penapisan/skrining yang akan diuji coba dapat
dideteksi karena adanya kegagalan represi
promoter (Fauziah dkk., 2015).
Promoter zif23 (
zinc finger 2 and 3
)
merupakan promoter sintetik dari organisme
eukariot (
Mus musculus
dan
Saccharomyces
cerevisiae)
, tetapi mampu dikenali oleh RNA
polimerase dan faktor sigma dari organisme
prokariot. Pada penelitian ini, dilakukan
analisis dan karakteristik motif-motif promoter
gen zif23 sebagai langkah awal dalam
pengembangan
sistem
penapisan
Promoter zif23 merupakan promoter sintetik
yang diperoleh dari
parts
iGem (2014)
(
http://parts.igem.org/ Part:BBa_R2002
).
Promoter sintetik ini dirancang oleh
Scot Wolfe dan Ronny Krashinsky dari
UMASS. Hasil penelusuran pada situs
European
Nucleotide
Archive
(ENA)
menunjukkan
bahwa
promoter
zif23
dikategorikan sebagai promoter kuat dan
memiliki afinitas tinggi terhadap RNA
polimerase serta mengekspresikan
C.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Promoter merupakan urutan DNA tempat
menempelnya enzim RNA polimerase dan
diinisiasinya transkripsi suatu gen termasuk gen
penyebab virulensi bakteri. Daerah promoter
terletak di daerah upstream (arah 5’) dari daerah
pengkode gen (coding sequence) (Lodish dkk.,
2004). Berdasarkan strukturnya, promoter
prokariot memiliki elemen dasar yang disebut core
promoter elements yang terdiri dari -10 (pribnow
box) dan -35 box. Kedua elemen tersebut berperan
penting dalam interaksi ikatan dengan enzim RNA
polimerase (Madigan dan Martinko, 2006).
Hasil analisis secara in silico menunjukkan
bahwa promoter zif23 memiliki panjang 52 pb,
serta memiliki elemen dasar (core promoter
elements) yang terdiri dari -10 pribnow box
(GATACT) terletak pada nukleotida 33-38,
sedangkan urutan DNA -35 box (TTGACA)
terletak pada nukleotida 10-15 (Gambar 1). Selisih
nukleotida antara daerah -10 pribnow box dan -35
GFP (
Green Fluorescent Protein
) dalam
jumlah yang besar. Promoter zif23 memiliki
panjang 52 bp dengan urutan basa: AGT-
TTA-
TTC-TTG-ACA-TGG-TCC-CAC-
GCG-CGT-GGG-ATA-CTC-CCA-CGC-GCG-TGG-G.
box sejumlah 18 pb yang diduga memiliki efisiensi
transkripsi yang tinggi karena berdasarkan
penelitian Madigan dan Martinko (2006) diketahui
bahwa efisiensi transkripsi tertinggi didapatkan
jika selisih nukleotida 17~1 pb. Wolfe dkk. (2003)
mengembangkan promoter zif23 sebagai salah satu
upaya melengkapi konstruksi setelah lebih dulu
dilakukan pengembangan protein fusi
zif23-GCN4. Promoter zif23 ini dapat mengekspresikan
GFP ketika dikonstruk ke dalam plasmid pET21D
pada sistem Escherichia coli BL21(DE3)pLyss
(Wolfe dkk., 2000a; Wolfe dkk., 2003). Daerah
downstream dari promoter zif23 memiliki urutan
DNA konsensus pengikatan zif23 yang sangat
lestari seperti yang ditunjukkan Gambar 1. Adanya
urutan DNA konsensus pengikatan zif23 pada
urutan 20 pb promoter zif23 menguatkan dugaan
bahwa protein repressor zif23 menempel pada
daerah ini untuk merepresi transkripsi gen zif23
Gambar IV.1 Analisis motif-motif promoter zif23 secara in silico. : daerah pengikatan repressor zif23 (operator).
(http://parts.igem.org/Part:BBa_R2002)
Banyak faktor transkripsi yang bekerja
dengan
melakukan
dimerisasi
untuk
meningkatkan
afinitas
dan
spesifisitas.
Heterodimerisasi
digunakan
untuk
meningkatkan kontrol dari faktor transkripsi.
Pada prinsipnya, dimerisasi
zinc finger
pada
DNA memberikan keuntungan karena dapat
menambah situs pengenalan dan pengikatan
terhadap
DNA
(Wolfe
dkk.,
2000b).
Dimerisasi
zif23
mampu
memodulasi
spesifisitas DNA.
Dimerisasi protein
zinc finger
ini dapat
menjadi alternatif yang dapat dikembangkan
untuk pembuatan suatu konstruksi yang
digunakan
untuk
terapi
gen
atau
pengembangan
sistem
penapisan
antituberkular (Wolfe dkk., 2003; Meng dkk.,
2007).
DAFTAR PUSTAKA
Barletta, F., Otero, L., Jimena, C., Belisa, A., Bouke, C.D.J., Carlos, S., Leen, R. (2013): Genetic variability of Mycobacterium tuberculosis complex in patients with no known risk factors for MDR-TB in the North-eastern part of Lima, Peru. BMC Infectious Disease. Vol. 13: 1-7.
Baussano, L., Mercadante, S., Manish, P., Ajit, L., Massimiliano, B. (2013): High rates of Mycobacterium tuberculosis among socially marginalized immigrants in low-incidence area, 1991-2010, Italy. Emerging Infectious Diseases. Vol. 19(9):1437-45.
Dover, L.G., Bhatt, A., Bhowruth, V., Willcox, B.E., dan Besra, G.S. (2008): New Drugs and Vaccines for Drug-Resistant Mycobacterium tuberculosis infections, Expert Rev.Vaccines, 7(4): 481-497.
Fauziah, P.N., Suhandono, S., Ernawati, A.G. (2015): Molecular Cloning, Characterization, Promoter Analysis of the Zinc Finger 23 (Zif23) Gene to Develop A Novel High Throughput Screening System for New Antitubercular by Targetting phoR of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. [Abstract]. PIT PERMI Conference. Semarang.
Gupta, S., Sinha, A., dan Sarkar, D. (2006) : Transcriptional Autoregulation by Mycobacterium tuberculosis PhoP Involves Recognition of Novel Direct Repeat Sequences in the Regulatory Region of the Promoter, Elsevier, 580: 5328-5338.
Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., dan Andries, K. (2011) : The Challenge of New Drug Discovery for Tuberculosis, Nature, 469: 483-490.
Madigan, M.T., dan Martinko, J.M. (2006) : Brock : Biology of Microorganism 11th edition. New Jersey : Pearson Prentice Hall.
Meng, X., Thibodeau-Beganny, S., Tao, J., J. Keith, J., Scot, A.W. (2007) : Profiling the DNA-binding specificities of engineered CysHis2 zinc finger domains using a rapid cell-based method. Nucleic Acids Research. Vol. 35(11):1-9.
Okada, A., Gotoh, Y., Watanabe, T., Furuta. E., Yamamoto, K., Utsumi, R. (2007). Targetting Two Component Signal Trasduction : A Novel Drug Discovery System, Methods in Enzymology, Vol. 422(19): 386-395.
Ryndak, M., Wang, S., dan Issar, S. (2008) : PhoP, a Key Player in Mycobacterium tuberculosis Virulence, Trends Microbiol., 16(11): 528-534.
Wolfe, S.A., Ramm, E.I., Carl, O.P. (2000a) : Combining structure-based design with phage display to create new Cys2His2 zinc finger dimers. Research Article Elsevier Science. Vol.8:739-750.
Wolfe, S.A., Grant, R.A., Ramm, E.I., Carl, O.P.
(2000b) : Beyond the “Recognition Code”:
Structures of Two Cys2His2 Zinc Finger/TATA Box Complexes. Structure, Vol. 9, 717–723.
