VALIDASI METODE PENETAPAN KADAR
PENTAGAMAVUNON-1 DALAM DARAH SECARA
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
Anita Dwi Juwita Ningrum, Siluh Made Yuni Astini, dan Arief Rahman Hakim Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Sekip Utara, Yogyakarta 55281
Korespondensi: [email protected]
ABSTRACT
Pentagamavunon-1 (PGV-1) is curcumin’s analogue that reported as analgesic, antioxidant, antiinflamatory, and has antiproliferation activity to breast cancer. The aim of this study is to develop and validate the method for determinating PGV-1’s concentration in blood by reverse phase HPLC. Analytical method validation include system suitability test, determination of LOD and LOQ, linearity test, accuracy and precision’s determination, stability test of PGV-1 in blood and acetonitrile. Concentration of PGV-1 in blood is measured by HPLC using LiChrosphere® 100 Cartridge RP C18 (125 x 4 mm i.d., 5 μm), mixed mobile phase methanol : buffer acetate 0,05 M pH 3,7 (80:20 v/v), flow rate 0,5 ml/minute, detector Vis-416 nm, and injection volume 80 μl. System suitability tests suggest that separation condition is suitable to analyze PGV-1’s concentration in blood. The recomended method up to standard selectivity, linearity (corelation coefficient = 0,9999), accuracy, and precision. Value of LOD and LOQ is 4,93 ng/ml and 16,42 ng/ml, respectively. PGV-1 in blood is stable for the first hour. In acetonitrile at room temperature, PGV-1 is stable for 3 hours while storage at 5°C, PGV-1 is stable for 3 days. Therefore, the recomended analytic method is applicable to determine PGV-1’s concentration in blood.
Keywords: PGV-1, Validation method, HPLC
ABSTRAK
Pentagamavunon-1 (PGV-1) merupakan analog kurkumin yang telah terbukti berkhasiat sebagai antioksidan, antiinflamasi, dan mempunyai aktivitas antiproliferasi terhadap sel kanker payudara. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan dan memvalidasi metode penetapan kadar PGV-1 dalam darah secara KCKT fase terbalik. Validasi metode analisis meliputi uji kesesuaian sistem, penentuan LOD dan LOQ, uji linearitas, penentuan akurasi dan presisi, uji stabilitas PGV-1 dalam darah dan asetonitril. Kadar PGV-1 dalam darah ditetapkan menggunakan KCKT dengan kondisi kolom
LiChrosphere® 100 Cartridge RP C18 (125 x 4 mm i.d., 5 μm), fase gerak campuran metanol : bufer asetat 0,05 M pH 3,7 (80:20 v/v), kecepatan alir 0,5 ml/menit, detektor Vis-416 nm, dan volume injeksi 80 μl. Uji kesesuaian sistem menunjukkan bahwa kondisi pemisahan sesuai untuk analisis PGV-1 dalam darah. Metode yang diusulkan memenuhi syarat selektivitas, linieritas (rhitung = 0,9999), akurasi dan presisi. Nilai batas deteksi dan
kuantitasi yang didapat masing-masing sebesar 4,93 ng/ml dan 16,42 ng/ml. PGV-1 dalam darah stabil hingga jam pertama. Dalam asetonitril pada penyimpanan suhu kamar, PGV-1 stabil selama 3 jam sedangkan pada penyimpanan suhu 5°C, PGV-1 stabil selama 3 hari. Dengan demikian, metode analisis yang diusulkan dapat diaplikasikan untuk menetapkan kadar PGV-1 dalam darah.
PENDAHULUAN
Penelitian mengenai kurkumin dan senyawa analognya terus ditingkatkan dalam rangka penemuan dan pengembangan obat baru. Pengembangan obat baru dilakukan untuk menggantikan obat-obat lama yang memiliki efikasi rendah atau memberikan efek samping yang merugikan. Oleh karena itu, banyak dilakukan penelitian-penelitian yang mendukung penemuan obat baru serta uji-uji baik praklinik maupun klinik.
Struktur kurkumin dimodifikasi menjadi beberapa analog dengan tetap mempertahankan aktivitas antiinflamasinya, salah satu diantaranya adalah penta-gamavunon-1 [2,5-bis -(4'-hidroksi-3',5'-dimetilbenzilidin)-siklopentanon atau PGV-1]. Senyawa ini memiliki aktivitas sebagai antiinflamasi yang lebih poten dibanding kurkumin meskipun lebih rendah dibanding aspirin dan indometasin (1). Aktivitas antiinflamasi tersebut melalui penghambatan biosintesis prostaglandin jalur siklooksigenase (2). Efek farmakologi lain yang dimiliki PGV-1 adalah sebagai antioksidan (3) dan aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker payudara (4).
Telah banyak penelitian yang dilakukan untuk mengetahui aktivitas farmakologis PGV-1. Senyawa ini merupakan senyawa baru yang diharapkan dikemudian hari bisa dikembangkan menjadi obat baru. Hingga saat ini belum pernah dilakukan penelitian mengenai metode penetapan kadar PGV-1 dalam darah.
METODOLOGI PENELITIAN Bahan
Bahan penelitian yang digunakan yaitu senyawa PGV-1 (Laboratorium Molekul Nasional UGM, Yogyakarta)
memiliki jarak lebur 269-270oC dan Rf 0,83 pada sistem KLT yang menggunakan fase diam silika gel GF254 dengan fase gerak campuran
etil asetat : CCl4 (1:1), Heparin (Leo,
Denmark), natrium asetat, asam asetat, metanol dan asetonitril (pro HPLC, Merck, Damstradt, Germany), dan aquabidestilata steril (PT. Ikapharmindo Putramas, Indonesia). Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain alat pemusing (Kokusan H-100 BC, Tokyo), vortex (CAT.M. Zippear GmbH.Etzenbach, W. Germany), neraca analitik elektrik (Chyo Jupiter C3-100 MD), alat-alat gelas, pH meter tipe PHM82 (Radiometer, Copenhagen), penyaring bufer dengan pori 0,45 μm, seperangkat HPLC Prominence (Shimadzu) yang terdiri dari LC Solution software, LC Workstation manual injector, system controller CBM-20A/20A lite Prominence, solvent delivery module LC-20AD Prominence, detektor UV-Vis SPD-20A/SPD-20AV Prominence dan injektor syringe perfection 5-500 μl.Kolom HPLC LiChrosphere® 100 LC-Catridge Reverse Phase C18
(Merck, Germany) dengan panjang kolom 125 mm, diameter dalam kolom 4 mm, dan ukuran partikel kolom 5 μm, micro tube (Brand), blue-tip dan yellow-tip (Brand), pipet mikro Transferpette (Brand), dan almari pendingin.
Cara kerja
Scanning λ (panjang gelombang) maksimum PGV-1: Scanning λ maksimum larutan PGV-1 kadar 10 μg/ml kemudian dilakukan menggunakan spektrofotometer Genesis 10 pada λ 350-450 nm.
Uji kesesuaian sistem: Larutan PGV-1 dalam fase gerak dengan konsentrasi 100 μg/ml diambil 20 μl, dimasukkan dalam 200 μl darah sehingga diperoleh kadar 10 μg/ml PGV-1 dalam darah, divortex selama 30 detik, kemudian ditambah 600 μl asetonitril, dan divortex kembali selama 1 menit. Campuran yang diperoleh disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu 4ºC selama 10 menit kemudian ambil supernatan. Supernatan diinjeksikan dalam sistem KCKT sebanyak 80 μl kemudian di-running pada λ maksimum selama 10 menit, dilakukan lima replikasi. Uji kesesuaian sistem yang dilakukan meliputi penentuan waktu retensi, luas area puncak, tinggi puncak, capacity factor, tailling factor, number of theoritical plates, resolution dan dihitung rata-rata dan simpangan baku relatif masing-masing parameter.
Penentuan selektivitas: Penentuan selektivitas metode dilakukan dengan membandingkan kromatogram PGV-1 dalam darah (spike ) dan blanko. Penentuan LOD dan LOQ: Dibuat larutan PGV-1 dalam darah kadar 10, 20, 40, 80, dan 100 ng/ml. Supernatan didapat dengan cara kerja sesuai dengan poin b dan diinjeksikan 80 µl ke sistem KCKT. Selanjutnya dibuat regresi linear hubungan antara luas area kromatogram terhadap kadar PGV-1. LOD dan LOQ dihitung secara statistik melalui garis regresi linier. Penentuan linearitas: Dibuat larutan PGV-1 dalam darah kadar 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 5; 10; 20; 40; 80; dan 100 µg/ml. Supernatan diperoleh dengan cara kerja b dan 80 µl diinjeksikan ke sistem KCKT kemudian dibuat kurva persamaan garis lurus antara kadar
PGV-1 terhadap luas area kromatogram dan dihitung nilai koefisien korelasinya. Koefisien korelasi dapat diteria jika nilainya lebih besar atau sama dengan 0,999 (5).
Penentuan nilai perolehan kembali (recovery) dan kesalahan acak: Dibuat larutan PGV-1 dalam darah kadar 20, 50, 80 ng/ml. Lakukan cara kerja b untuk mendapatkan supernatan kemudian diinjeksikan 80 μl dalam sistem KCKT. Kadar PGV-1 masing-masing dihitung dengan menggunakan persamaan kurva baku PGV-1 dalam darah kemudian dihitung kadar rata-ratanya, nilai recovery (perolehan kembali), dan kesalahan acak.
Uji stabilitas PGV-1 dalam darah: Dari larutan stok 1 mg/ml dibuat larutan PGV-1 360 μg/ml dengan mengencerkan 360 μl larutan stok dengan 640 μl fase gerak. Darah tanpa perlakuan diambil sebanyak 1,8 ml kemudian tambahkan sebanyak 100 μl larutan PGV-1 kadar 360 μg/ml sehingga diperoleh 20 μg/ml PGV-1 dalam darah lalu divorteks selama 30 detik dan diamkan pada suhu kamar. Ambil 200 μl campuran darah dan larutan PGV-1 pada jam ke-0, 1, dan 2, masing-masing 3 tabung. Supernatan diperoleh sesuai cara kerja poin b dan diinjeksikan ke KCKT sebanyak 80 μl. Kadar PGV-1 dihitung menggunakan persamaan kurva baku dalam darah dan dianalisis persentase obat yang terdegradasi.
Uji stabilitas PGV-1 dalam asetonitril: Uji stabilitas dalam asetonitril dilakukan dalam suhu kamar (25-300C) dan pada suhu penyimpanan (50C). Dari larutan stok 1 mg/ml PGV-1 diencerkan dengan asetonitril hingga diperoleh kadar 20 μg/ml
kemudian disimpan sampai waktu pengujian. Pengujian dilakukan pada jam ke-0, 1, 2, 3 untuk penyimpanan pada suhu kamar, serta pada hari ke-0, 1, 2, 3 untuk penyimpanan pada suhu 50C . Pengujian dilakukan dengan menginjeksikan 80 μl larutan dalam sistem KCKT dan masing-masing dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Kadar PGV-1 diperoleh dengan menggunakan persamaan kurva baku PGV-1 dalam asetonitril dan dihitung persentase obat yang terdegradasi. Penetapan kadar PGV-1 dalam darah: Tikus putih jantan Wistar diberi PGV-1 secara intravena dengan dosis 20 mg/kgBB selanjutnya darah di sampling melalui vena lateralis ekor tikus pada menit ke-2, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 120, 240, dan 360. Darah ditampung dalam microtube yang berisi heparin. Sampel 200 µl ditambah asetonitril 620 µl lalu divortex selama 1 menit. Campuran tersebut kemudian disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu 4°C. Supernatan diambil kemudian disuntikkan ke dalam sistem KCKT 80 µl.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Scanning panjang gelombang (λ) maksimum
Hasil scanning panjang gelombang maksimum PGV-1 dalam fase gerak (campuran bufer asetat pH 3,7 : metanol (20:80) menggunakan spektrofotometer Genesis 10 pada panjang gelombang 350-450 nm menunjukan bahwa PGV-1 memiliki serapan maksimum pada 416 nm sehingga pembacaan serapan PGV-1 dilakukan pada panjang gelombang 416 nm. Pengukuran kadar PGV-1 harus dilakukan pada panjang gelombamg maksimal (λmaks) karena pada panjang gelombang maksimal akan memberikan kepekaan
(sensitivitas) yang tinggi dan kesalahan paling kecil.
Uji kesesuaian sistem
Uji kesesuaian sistem perlu dilakukan sebelum suatu sistem analisis digunakan dengan tujuan untuk memastikan keefektifan sistem operasional akhir. Pengujian ini didasarkan pada suatu konsep bahwa elektronik, peralatan, zat uji, dan kondisi operasional analisis membentuk satu sistem analitik tunggal yang dapat diuji fungsinya secara keseluruhan (6). Hasil uji kesesuaian sistem yang dapat dilihat pada tabel 1 menunjukkan bahwa parameter-parameter yang diukur memenuhi kriteria untuk dapat diterima menurut Yuwono & Indrayanto (5) yaitu nilai simpangan baku relatif dari waktu retensi kurang dari atau sama dengan 1% (untuk n = 5), k’ (capacity factor) > 2, Tf (tailling factor) < 2, N (number of theoritical plates > 2000 dan Rs (resolusi) > 2 sehingga sistem kromatografi yang digunakan dalam penetapkan kadar PGV-1 dalam darah dapat menghasilkan data dengan kualitas yang dapat diterima. Hasil yang didapat dari lima penyuntikkan tersebut menunjukkan bahwa puncak PGV-1 selalu muncul pada waktu retensi (tR) di sekitar menit ke-8,39
dengan CV 0,29% sehingga puncak yang muncul disekitar menit ke-8,39 ditetapkan sebagai puncak PGV-1. Penentuan selektivitas
Pada penetapan kadar obat dalam cuplikan hayati, selektivitas metode menempati prioritas utama karena harus dapat membedakan obat yang dimaksud dari metabolitnya, obat lain, maupun kandungan endogen cairan hayati. Penentuan selektivitas dilakukan dengan membandingkan kromatogram darah blanko (gambar I) dankromatogram darah yang di-spike
PGV-1 (gambar 2). Pada kromatogram blangko tidak muncul puncak disekitar waktu retensi 8,39 menit yang berarti tidak ada gangguan serapan dari senyawa endogen dalam darah terhadap puncak dari PGV-1 sedangkan pada
kromatogram PGV-1 darah spike dan dalam darah sampel muncul puncak disekitar waktu retensi PGV-1, yaitu 8,39 menit. Hal ini menunjukkan bahwa metode analisis memenuhi syarat selektivitas.
Tabel 1
Data uji kesesuaian sistem Kadar PGV-1 (μg/ml) tR (menit) Luas area Tinggi puncak k' Tf N Rs 5 5 5 5 5 8,379 8,388 8,366 8,394 8,430 136639 7 144197 5 134435 6 137092 1 123233 5 38233 39836 37538 38409 33185 2,86 7 2,97 5 2,80 7 2,81 3 2,97 0 1,38 1 1,37 1 1,34 5 1,33 9 1,55 4 9156,72 9 9010,67 7 9034,76 7 9396,90 1 9872,44 7 3,750 3,699 3,771 3,799 3,882 Rata-rata 8,391 135119 6,8 37440, 2 2,88 6 1,39 8 9294,30 4 3,780 SD 0,024 75887, 6 2521,1 0,1 0,1 357,6 0,1 CV (%) 0,29 5,62 6,73 2,84 6,36 3,85 1,79
Gambar 2. Kromatogram PGV-1 kadar 100 ng/ml dalam darah (spike)
Keterangan untuk gambar 1 dan 2:
Analisis dilakukan dengan HPLC Prominence (Shimadzu)
Kolom HPLC LiChrosphere® 100 LC-Catridge Reversed Phase C18 (Merck,
Germany) dengan panjang kolom 125 mm, diameter dalam kolom 4 mm, dan ukuran partikel kolom 5 μm
Fase gerak metanol : bufer asetat 0,05 M pH 3,7 (80:20 v/v) Kecepatan alir fase gerak 0,5 ml/menit
Detektor Vis-416 nm
Minimum area detection: 1 count AUFS: 0,01
Volume injeksi: 80 μl
Penentuan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ)
LOD dan LOQ merupakan parameter sensitivitas suatu metode. Semakin kecil nilai LOD dan LOQ menunjukkan semakin sensitifnya suatu metode. LOD menunjukkan kadar PGV-1 terkecil yang dapat dideteksi dalam sampel dan masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko dengan nilai S/N = 3. Nilai LOQ menunjukkan kadar PGV-1 terendah yang masih dapat memenuhi persyaratan cermat dan seksama dan ditandai dengan nilai S/N = 10. Namun pada penelitian ini, nilai LOD dan LOQ dianalisis secara statistik melalui garis regresi linier kurva baku PGV-1. Sensitivitas metode ini terlihat dari perolehan nilai LOD = 4,93 ng/ml dan LOQ = 16,42 ng/mg.
Menentukan linieritas
Linieritas metode analisis merupakan kemampuan untuk memberikan hasil uji yang proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel baik secara langsung maupun dengan bantuan transformasi matematika tertentu (6). Data konsentrasi PGV-1 dan luas area kromatogramnya dapat dilihat pada tabel 2. Dari plot antara kadar PGV-1 (x) dengan luas puncak (y) diperoleh persamaan regresi linier y = 1,119x - 0,054 (gambar 3) dan koefisien korelasi (rhitung) = 0,9999.
Nilai rhitung yang sudah mencapai
0,999 dapat digunakan sebagai parameter linieritas tanpa harus disertai pembuktian linieritas dengan parameter yang lain misalnya Vxo, Xp,
Mandel-test, pengujian linieritas dengan ANAVA (5).
Berdasarkan nilai rhitung yang
diperoleh, dapat disimpulkan bahwa metode analisis yang digunakan memenuhi syarat linieritas.
Tabel 2
Luas area kromatogram untuk penentuan linearitas PGV-1 Kadar (μg/ml) luas area (x105) 0 0,02 0,04 0,03 0,08 0,08 0,1 0,09 0,2 0,18 0,4 0,36 0,8 0,79 5 5,25 10 11,33 20 22,30
Penentuan akurasi dan presisi metode
Akurasi atau kecermatan merupakan parameter untuk menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit sebenarnya. Akurasi dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (%
recovery) analit. Akurasi hasil analisis sangat tergantung pada sebaran kesalahan sistematik dalam keseluruhan tahapan metode analisis. Menurut Lindholm (7) dalam pengukuran persen recovery untuk bioanalisis, nilai rata-rata persen recovery yang diperbolehkan adalah 85 – 115 %.
Presisi atau keseksamaan diperlukan untuk menunjukkan derajat kesesuaian antar hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari nilai rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran homogen. Presisi diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien variasi) dan dapat dinyatakan sebagai keterulangan (repeatability) atau ketertiruan (reproducibility). Penelitian ini hanya menetapkan keterulangan saja sebagai parameter presisinya.
Keterulangan merupakan
keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh analis sama pada kondisi sama dalam interval waktu pendek. Untuk bioanalisis syarat nilai koefisien variasi (CV) yang diijinkan maksimal 15% (5). y = 1,119x - 0,053 r = 0.9999 -5 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
Kadar PGV-1 dalam darah (μg/ml)
Lu a s a re a k rom a tog ra m P G V -1 (x 1 0 5)
Gambar 3. Kurva hubungan luas area kromatogram versus kadar PGV-1 dalam darah pada penentuan linieritas
Hasil perhitungan menunjukkan bahwa seluruh hasil uji akurasi memiliki nilai perolehan kembali diantara 85% hingga 115% dan semua pengujian presisi memberikan nilai koefisien variasi kurang dari 15%,
sehingga dapat disimpulkan bahwa metode pengukuran PGV-1 ini telah memenuhi syarat akurat dan teliti. Data dan hasil penentuan akurasi dan presisi metode dinyatakan dalam tabel 3.
Tabel 3
Nilai akurasi dan presisi pengukuran kadar PGV-1 dalam darah Kadar PGV-1 diketahui (ng/ml darah) Kadar PGV-1 terukur (ng/ml darah) Recovery (%) Rata-rata ± SD CV (%) 20 18,40 22,23 21,71 92,00 111,15 108,55 103,85±10,34 9,96 50 46,18 38,51 47,57 92,36 77,02 95,51 88,30 ± 9,89 11,20 80 73,18 79,80 77,50 91,48 99,75 96,04 96,04 ± 4,20 4,37
Penentuan stabilitas PGV-1 dalam darah
Stabilitas obat dalam cairan biologis merupakan fungsi dari kondisi penyimpanan, sifat kimia obat, komponen cairan biologis, dan sistem wadah. Stabilitas PGV-1 dalam matriks darah pada penilitian ini harus dievaluasi untuk membuktikan bahwa tidak terjadi degradasi diantara waktu pengambilan sampel sampai dilakukan penambahan asetonitril ke dalam darah.
Hasil uji stabilitas PGV-1 dalam darah pada jam ke-1 dan 2 dinyatakan sebagai persen degradasi terhadap kadar awal. Dari data yang disajikan pada tabel 4 terlihat bahwa PGV-1 dalam darah masih stabil sampai jam pertama dan mengalami degradasi 11,05 4,85% pada jam kedua sehingga preparasi sampel harus dilakukan sebelum mencapai jam kedua setelah pengambilan.
Tabel 4
Hasil penentuan stabilitas PGV-1 dalam darah pada suhu kamar Waktu
(jam)
Kadar PGV-1 diketahui
(μg/ml darah) Luas area (x105)
Kadar PGV-1 terukur (μg/ml darah) Degrada si (%) Rata-rata ± SD (%) 0 20 25,24 28,79 25,32 19,17 21,76 19,23 - - - - 1 20 27,30 28,75 27,54 20,68 21,73 20,85 0,00 0,00 0,00 0,00 2 20 24,82 23,24 22,17 18,86 17,71 16,93 5,92 11,67 15,57 11,05 4,85
Penentuan stabilitas PGV-1 dalam asetonitril
Penentuan stabilitas PGV-1 dalam asetonitril dilakukan dalam dua kondisi penyimpanan yaitu pada suhu kamar (25 – 30°C) dan suhu 5°C. Hal ini dilakukan untuk memastikan bahwa tidak terjadi degradasi PGV-1 pada kedua kondisi penyimpanan tersebut hingga dilakukan pengukuran kadar. Hasil uji stabilitas PGV-1 dalam asetonitril yang tersaji pada tabel 5 menunjukkan bahwa sampai jam ketiga pengujian kadar PGV-1 masih stabil dan belum mengalami degradasi sehingga memungkinkan PGV-1 dalam asetonitril disimpan pada suhu kamar selama tiga jam sebelum ditetapkan kadarnya menggunakan KCKT.
Pengujian pada kondisi penyimpanan 5°C menunjukkan bahwa PGV-1 cukup stabil hingga hari ketiga pengujian (tabel 6). Hal ini dapat dilihat dari nilai persen
degradasi yang kecil sehingga dalam kondisi penyimpanan ini memunginkan bila dilakukan penyimpanan PGV-1 dalam asetonitril hingga hari ketiga sebelum ditetapkan kadarnya dalam KCKT.
Penentuan kadar PGV-1 dalam darah
Kadar PGV-1 dalam darah yang terdeteksi pada setiap waktu sampling lebih besar dari nilai LOQ. Hal tersebut menunjukkan bahwa kadar PGV-1 dalam darah yang diperoleh dengan metode ini akurat dan presis. Berdasar hasil penelitian yang diperoleh, diketahui bahwa metode analisis yang diusulkan dapat digunakan untuk menetapkan kadar PGV-1 dalam darah setelah pemberian PGV-1 secara intravena pada tikus putih jantan Wistar dengan dosis 20 mg/kgBB. Kurva hubungan kadar PGV-1 dalam darah dan waktu sampling dapat dilihat pada gambar 4.
Tabel 5
Hasil penentuan stabilitas PGV-1 dalam asetonitril pada suhu kamar Waktu (jam) Kadar PGV-1 diketahui (μg/ml) Luas area (x106) Kadar PGV-1 terukur (µg/ml) Degradasi (%) Rata-rata ± SD (%) 0 20 8,23 8,07 7,81 18,85 18,49 17,90 - - 1 20 8,99 8,82 8,71 20,57 20,19 19,95 0,00 0,00 0,00 0,00 2 20 8,95 8,99 8,97 20,49 20,58 20,54 0,00 0,00 0,00 0,00 3 20 9,05 9,02 8,95 20,70 20,65 20,48 0,00 0,00 0,00 0,00
Tabel 6
Hasil penentuan stabilitas PGV-1 dalam asetonitril pada suhu 5ºC Waktu (hari) Kadar PGV-1 diketahui (μg/ml) Luas area (x106) Kadar PGV-1 dalam darah (µg/ml) Degradas i (%) Rata-rata ± SD (%) 0 20 8,29 8,18 8,28 21,83 21,53 21,80 - - 1 20 8,24 8,29 8,27 21,70 21,82 21,69 0,11 0,00 0,15 0,09 0,08 2 20 8,47 8,07 8,38 22,29 21,25 22,06 0,00 2,17 0,00 0,72 1,25 3 20 8,35 8,51 8,29 21,97 22,39 21,82 0,00 0,00 0,00 0,00 1 10 100 1000 10000 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Waktu (menit) Lo g k a da r P G V -1 da la m pl a s m a da ra h (ng /m l)
Gambar 4. Kurva hubungan kadar PGV-1 dalam darah dan waktu pada tikus putih setelah pemberian PGV-1 secara intravena dosis 20 mg/kgBB
KESIMPULAN
Uji kesesuaian sistem menunjukkan bahwa kondisi pemisahan sesuai untuk analisis PGV-1 dalam darah. Metode yang diusulkan memenuhi syarat selektivitas, linieritas (rhitung = 0,9999),
akurasi dan presisi. Nilai batas deteksi dan kuantitasi yang didapat masing-masing sebesar 4,93 ng/ml dan 16,42 ng/mg. PGV-1 dalam darah stabil
hingga jam pertama. Dalam asetonitril pada penyimpanan suhu kamar, PGV-1 stabil selama 3 jam sedangkan pada penyimpanan suhu 5°C, PGV-1 stabil selama 3 hari. Dengan demikian, metode analisis yang diusulkan dapat diaplikasikan untuk menetapkan kadar PGV-1 dalam darah.
UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terima kasih disampaikan kepada Fakultas Farmasi UGM 2007 yang telah membiayai penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA
1. Sardjiman. Synthesis of some new series of curcumin analogues, anti-oxidative, anti-inflammatory, antibacterial activities and qualitative structure-activity relationship (dissertation). Yogyakarta: Gadjah Mada University; 2000.
2. Nurrochmad A. Penghambatan Biosintesis Prostaglandin Melalui Jalur Siklooksigenase oleh Siklovalon dan Tiga Senyawa Analognya (skripsi) Yogyakarta: Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada; 1997.
3. Da’i M. Pengaruh Gugus β-Diketon Terhadap Daya Mereduksi Kurkumin dan Turunannya Pada Ion Ferri (skripsi) Yogyakarta: Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada; 1998.
4. Melannisa R. Pengaruh PGV-1 pada Sel Kanker Payudara T47D yang Diinduksi 17-β-Estradiol: Kajian Antiploriferasi, Pemacuan Apoptosis, dan Antiangiogenesis (thesis). Yogyakarta: Program Pascasarjana Universitas Gadjah Mada; 2004. 5. Yuwono M dan Indrayanto G.
Validation of Chromatographic Methods of Analysis, Profiles of Drug Substances Excipiens and Related Methodology. Bandung: 2005. p. 243-258.
6. The United States Pharmacopeia Twenty-Eighth Revision and The National Formulary Twenty-Third Edition, 2389, 2748-2751. United State Pharmacopeial Convention, Rockville, 2005.
7. Lindholm J. Development and Validation of HPLC Method for Analytical and Preparative Purposes (dissertation) Uppsala: Universitatis Upsaliensis; 2004.
