V. Hasil Percobaan V. Hasil Percobaan Isolat Isolat DNA DNA Konsentrasi A Konsentrasi A260260/A/A280280 AA260260/A/A230230 AA230230 AA260260 AA280280 AA340340 DNA DNA mamalia mamalia I I 1 1 µL µL 2,02 2,02 0,48 0,48 0,040 0,040 0,025 0,025 0,019 0,019 0,0120,012 DNA DNA mamalia mamalia II II 1 1 µL µL 1,171 1,171 0,84 0,84 0,025 0,025 0,021 0,021 0,012 0,012 0,0000,000 DNA DNA mamalia mamalia III III 2 2 µL µL 1,85 1,85 1,34 1,34 0,031 0,031 0,041 0,041 0,023 0,023 0,0030,003 DNA DNA mamalia mamalia IV IV 1 1 µL µL 1,76 1,76 0,87 0,87 0,022 0,022 0,019 0,019 0,011 0,011 0,0000,000 DNA DNA bakteri I bakteri I 4 4 µL µL 2,04 2,04 1,45 1,45 0,059 0,059 0,086 0,086 0,042 0,042 0,0000,000 DNA DNA bakteri bakteri II II 4 4 µL µL 1,83 1,83 1,54 1,54 0,052 0,052 0,079 0,079 0,044 0,044 0,0020,002 VI. Pembahasan VI. Pembahasan
Pada percobaan analisis DNA hasil isolasi dengan biofotometer ini bertujuan untuk Pada percobaan analisis DNA hasil isolasi dengan biofotometer ini bertujuan untuk dapat melakukan analisis kuantitatif dan kualitatif terhadap sampel DNA menggunakan dapat melakukan analisis kuantitatif dan kualitatif terhadap sampel DNA menggunakan biophotometer.
biophotometer. Biophotometer Biophotometer adalah adalah alat alat yang yang digunakan digunakan untuk untuk menganalisis menganalisis ssDNA,ssDNA, dsDNA, RNA, dan protein. Alat ini memiliki prinsip yang sama dengan spektrofotometer dsDNA, RNA, dan protein. Alat ini memiliki prinsip yang sama dengan spektrofotometer UV-Vis pada umumnya, yaitu berdasarkan interaksi yang terjadi antara energi yang berupa UV-Vis pada umumnya, yaitu berdasarkan interaksi yang terjadi antara energi yang berupa sinar monokromatis dari sumber sinar dengan materi yang berupa molekul. Besar energi yang sinar monokromatis dari sumber sinar dengan materi yang berupa molekul. Besar energi yang diserap tertentu dan menyebabkan elektron tereksitasi dari keadaan dasar ke keadaan diserap tertentu dan menyebabkan elektron tereksitasi dari keadaan dasar ke keadaan tereksitasi yang memiliki energi lebih tinggi (Day dan Underwood, 2002). DNA dapat dilihat tereksitasi yang memiliki energi lebih tinggi (Day dan Underwood, 2002). DNA dapat dilihat menggunakan biophotometer karena memiliki ikatan rangkap yang terkonjugasi.
menggunakan biophotometer karena memiliki ikatan rangkap yang terkonjugasi.
Biophotometer dapat digunakan untuk uji kuantitatif, yaitu dapat mengetahui nilai Biophotometer dapat digunakan untuk uji kuantitatif, yaitu dapat mengetahui nilai absorbansi dari sampel dan uji kualitatif pada DNA, yaitu dapat mengetahui tingkat absorbansi dari sampel dan uji kualitatif pada DNA, yaitu dapat mengetahui tingkat kemurnian DNA hasil isolasi untuk mengetahui derajat konaminasi suatu sampel. Basa purin kemurnian DNA hasil isolasi untuk mengetahui derajat konaminasi suatu sampel. Basa purin dan pirimidin memiliki absorbsi maksimal pada panjang gelombang sekita 260 nm (dATP= dan pirimidin memiliki absorbsi maksimal pada panjang gelombang sekita 260 nm (dATP=
259 nm, dCTP= 272 nm, dTTP= 247 nm). Analisis menggunakan biophotometer dapat digunakan untuk menentukan nilai absorbansi pada berbagai macam panjang gelombang, yaitu panjang gelombang 230 nm, 260 nm, 280 nm, dan 340 nm. Masing-masing nilai absorbansi dari panjang gelombang tersebut memiliki makna yang berbeda. Nilai pada panjang gelombang 230 nm menunjukkan nilai absorbansi fenol, panjang gelombang 260 nm menunjukkan nilai absorbansi DNA, panjang gelombang 280 nm menunjukkan nilai absorbansi protein yang masih tersisa, dan panjang gelombang 340 nm menunjukkan correction value, dimana semakin mendekati nol nilainya maka menunjukkan sampel yang dihasilkan semakin baik. Selain itu, terdapat konversi spektrofotometri dari asam nukleat terhadap nilai absorbansi dari panjang gelombang 260 nm DNA untai ganda adalah 50 µg/mL, panjang gelombang 260 nm DNA untai tunggal adalah 33 µg/mL, dan panjang gelombang 260 nm RNA adalah 40 µg/mL. Tingkat kemurnian suatu DNA dapat dianalisis dengan membandingan rasio A260/A280adalah 1,8 – 2 ( Mustafa dkk., 2016). Rumus untuk
menghitung konsentrasi DNA adalah sebagai berikut:
Konsentrasi DNA (µg/mL) = OD260 x 100 (faktor pengenceran) x 50 µg/mL 1000
Sampel yang digunakan dalam percobaan ini yaitu sampel DNA mamalia dan DNA bakteri. DNA mamalia yang digunakan berupa darah dari kambing etawa, sedangkan DNA bakteri yang digunakan berupa DNA Bakteri Escherichia coli. Pengenceran pada sampel DNA yaitu ditambahkan 20μL sampel dan 180μL Aquadest. Pengenceran tersebut berarti pengenceran sebanyak 200x. Pengenceran dilakukan untuk menentukan konsentrasi DNA.
Pada analisis dna hasil isolasi menggunakan biofotometer digunakan larutan blanko berupa aquadest. Alasan digunakan blanko aquadest yaitu karena mempunyai kosentrasi 0 dan inert. Awal dari analisis menggunakan biofotometer yaitu menghitung larutan blanko berisi aquadest sebanyak 200μL. Selanjutnya 20μL aquadest dibuang, lalu ditambahankan sampel DNA sebanyak 20μL dan diresuspensi. Tujuan dari resuspensi yaitu agar sampel DNA dan aquadest dapat bercampur merata, sehingga konsentrasi DNA menunjukkan hasil yang murni.
Rasio A260
A280 adalah suatu angka yang mennujukkan kadar kontaminasi protein pada
sampel DNA. Pada sampel DNA darah mamalia 1 menunukkan rasio 2,02, DNA darah mamalia 2 menunjukkan rasio 1,71, DNA mamalia 3 menunjukkan rasio 1,85, DNA mamalia 4 menunjukkan rasio1,76, DNA bakteri 1 menunjukkan rasio 2,04 dan DNA bakteri 2 menunjukkan rasio 1,83. A230 menunjukkan kemurnian semua sampel DNA sebab menunjukkan nilai absorbansi kurang dari 2. A280 menunjukkan kemurnian DNA sebab nilai absorbansinya juga telah kurang dari 2. Hasil A280 pada sampel menunjukkan angka pada
DNA darah mamalia 1 : 0,019 , DNA darah mamalia 2 : 0,012, DNA mamalia 3 : 0,023, DNA mamalia 4 : 0,011, DNA bakteri 1 : 0,042, dan DNA bakteri 2 : 0.044.
Hasil pengukuran dengan biofotometer menunjukkan bahwa konsentrasi DNA darah mamalia 1, 4, dan 2 adalah 1μg/L, DNA mamalia 3 :2 μg/L, DNA bakteri 1 dan 2 konsentrasinya adalah 4 μg/L. Konsentrasi bakteri lebih besar dari pada konsentrasi DNA darah mamalia sebab bakteri memiliki struktur DNA yang lebih murni dari pada mamalia yang cenderung struktur lebih komplek. Pada hasil identifikasi nilai fenol yang disimbolkan dengan A230, menunjukkan hasil DNA mamalia 1 : 0,04, mamalia 2 : 0.025, mamalia 3 : 0.031, DNA bakteri 1 : 0.022, dan bakteri 2 : 0.052.
VII. Kesimpulan
Analisis kualitatif menunjukkan bahwa sampel DNA mamalia 1, 2 dan 4 dikatakan kurang murni karena masih ada rasio sampel DNA yang kurang dari 1,8 dan lebih dari 2, sedangkan pada sampel DNA mamalia 3 dikatakan telah murni karena rentang 1,8 - 2. Serta pada sampel DNA bakteri pada bakteri 1 rasio lebih dari 2 sehingga masih adanya pengotor,sedangkan bakteri 2 hasilnya DNA hasil isolasi telah murni. Analisis kuantitatif menunjukkan bahwa konsentrasi sampel DNA mamalia 1, 2 dan 4 adalah 1μg/L, sedangkan sampel DNA mamalia 3 adalah 2μg/L. Konsentrasi sampel DNA bakteri 1 dan 2 yaitu 4μg/L.
VIII. Daftar Pustaka
Braun, R. D. 1982. Introduction to Chemical Analysis. New York : McGraw-Hill Book. Day, R.A., dan Underwood, A. L. 2000. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi Keenam. Jakarta:
Erlangga.
Ferniah, R. S., dan Pujiyanto, S. 2013. Optimasi Isolasi DNA Cabai (Capsicum annuum L.) Berdasar Perbedaan Kualitas dan Kuantitas Daun serta Teknik Penggerusan. Bioma: Berkala Ilmiah Biologi. 15(1): 14-19.
Harahap, A. S. 2018. UJI KUALITAS DAN KUANTITAS DNA BEBERAPA POPULASI POHON KAPUR SUMATERA. JASA PADI . 2(02): 1-6.
Harjadi, W. 1986. Ilmu Kimia Analitik Dasar . Jakarta: Penerbit Gramedia.
Mustafa, H., Rachmawati, I., & Udin, Y. (2016). Pengukuran Konsentrasi dan Kemurnian DNA Genom Nyamuk Anopheles barbirostris. Jurnal Vektor Penyakit . 10(1): 7-10. Passi, N., Garg, R. K., Yadav, M., Singh, R. S., dan Kharoshah, M. A. 2012. Effect of luminol
and bleaching agent on the serological and DNA analysis from bloodstain. Egyptian Journal of Forensic Sciences. 2(2): 54-61.
Pereira, J.J., Ahilan, B., Marx, K.K., Shakila, R.J., dan Rajagopalsamy, C.B.T., 2014. DNA BARCODE OF INDIAN SPINY LOACH, LEPIDOCEPHALUS THERMALIS
(VALENCIENNES) OF TAMIL NADU. Journal of Aquaculture in the Tropics. 1(7): 165-177.
Restu, M., Mukrimin, M., & Gusmiaty, G. 2012. Optimalisasi Teknik Ekstraksi dan Isolasi DNA Tanaman Suren (Toona Sureni Merr.) untuk Analisis Keragaman Genetik berdasarkan Random Amplified PolymorphicDNA (RAPD). Jurnal Natur Indonesia. 14(2).
Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar.
Sahasrabudhe, A. dan Deodhar, M. 2010. Standartiz ation of DNA Extraction and
Optimization of RAPD – PCR Condition in Garcinia Indica. International Journal of Botany. 6(3): 293-298.
IX. LAMPIRAN 1. Dokumentasi percobaan 2. Abstrak Jurnal 3. Laporan Sementara Mengetahui, Asisten Praktikum ( ) Surakarta, 4 Mei 2018 Praktikan (Kelompok 2 )
