III. METODE PENELITIAN
A. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian
1. Materi penelitian
Materi yang diteliti adalah kelenjar mammae induk mencit (M. musculus L.) Strain Balb/c sejak kehamilan hari ke-0 hingga hari ke-18 sebanyak 40 ekor umur 2 bulan dengan berat berkisar 30 ± 2 g dan mencit (M. musculus L.) jantan yang dipelihara di animal house Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto.
Bahan-bahan yang digunakan meliputi daun pare (M. charantia L.), etanol 96%, pellet komersial, air, NaCl 0,9%, Methilen Blue 1%. Larutan yang digunakan untuk pemrosesan jaringan kelenjar mammae adalah Neutral Buffered Formalin (NBF), parafin, alkohol 70%, 80%, 90% dan 100%, akuades, xylol, gelatin 1%, pewarna hematoxylin dan eosin 1% serta entelan new.
Alat-alat yang digunakan meliputi:
a. Pembuatan ekstrak etanol daun pare (M. charantia L.): oven inkubator, loyang, erlenmeyer, cawan petri, gelas ukur, saringan, blender, alumunium foil, timbangan digital dengan tingkat ketelitian 0,01 g, plastik obat, lemari pendingin, pensil dan label.
b. Pembuatan apus vagina: object glass, cover glass, mikroskop, bak preparat, kapas, cotton bud dan pipet tetes.
c. Persiapan kandang dan pemeliharaan mencit: kandang, sekam padi, tempat minum mencit.
d. Pembuatan Sediaan histologis: alat bedah, botol sampel, beaker glass, oven inkubator dengan thermostat, hot plate, cetakan dari kertas karton, blok kayu sebagai holder, mikrotom putar, kuas dan mangkuk air hangat, alumunium foil, object glass, cover glass, staining jar, mikroskop, kamera, pensil dan label.
2. Lokasi dan Waktu Penelitian
B. Metode Penelitian
1. Rancangan Percobaan
Penelitian ini menggunakan metode eksperimental dengan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 4 perlakuan. Perlakuan yang dicobakan yaitu pemberian ekstrak etanol daun pare (M. charantia L.) dengan dosis yang berbeda yaitu: 0 mg.kg-1 bb , 750 mg.kg-1 bb, 1000 mg.kg-1 bb dan 1250 mg.kg-1 bb. Perlakuan diberikan setiap hari sekali sejak kehamilan hari ke-0 hingga hari ke-18. Setiap perlakuan diulang 10 kali, sehingga dibutuhkan jumlah mencit betina sebanyak 40 ekor dan mencit jantan sebanyak 8 ekor. 2. Variabel Penelitian
Variabel yang diamati adalah perkembangan kelenjar mammae mencit pada kehamilan hari ke-6, ke-12 dan hari ke-18.
3. Parameter Penelitian
Parameter yang diamati meliputi volume dan gambaran histologis kelenjar mammae induk mencit.
C. Diagram Alir Penelitian
Persiapan kandang
Pembuatan ekstrak etanol daun pare
Penentuan dosis
Persiapan mencit
Pengamatan siklus estrus dan pengawinan mencit
Pemberian perlakuan dan pemeliharaan
Pembuatan sediaan histologi Pengambilan data
Evaluasi struktur mikroskopis kelenjar
mammae
Evaluasi struktur kelenjar mammae
Pengukuran volume kelenjar mammae (Cavalieri principle)
D. Cara Kerja
1. Persiapan Kandang
Kandang disiapkan sebanyak 8 buah, masing-masing kandang diisi dengan 5 ekor mencit betina. Kandang terbuat dari plastik yang berukuran 34,5 x 27 x 15 cm3 dengan menggunakan kawat sebagai penutup pada bagian atas kandang. Agar mencit dapat hidup dengan nyaman, disediakan pula sekam padi dan ditempatkan pada dasar kandang. Sekam berguna untuk menyerap urine mencit. Kandang dibersihkan dengan mengganti sekam setiap 3 hari sekali.
2. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Pare (BPOM, 2004; dimodifikasi di Laboratorium Struktur dan Perkembangan Hewan, Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman)
Daun pare yang digunakan untuk membuat ekstrak, diambil dari bagian intermediet atau tengah tanaman, yaitu daun ke empat sampai daun ke enam dari ujung sulur. Hal tersebut untuk mengoptimalkan perolehan zat aktif. Stok ekstrak etanol daun pare dipersiapkan menurut Agustini et al. (2007), dengan modifikasi menggunakan etanol sebesar 96%. Pertimbangan ini dilakukan berdasarkan prosedur pembuatan ekstrak etanol daun pare untuk keperluan pembuatan obat tradisional. Daun pare diperoleh dari perkebunan di Kelurahan Arcawinangun, Purwokerto Utara (penguatan rekomendasi taksonomi dilakukan oleh identifikator Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto).
Ekstrak stok dibuat dengan cara daun pare segar ditimbang menggunakan timbangan digital dengan tingkat ketelitian 0,01 g. Daun pare tersebut dicuci dalam air mengalir, ditiriskan kemudian dikeringkan dalam oven inkubator pada temperatur 60oC selama ± 48 jam. Daun pare yang telah dikeringkan kemudian ditimbang kembali, dihaluskan menggunakan blender
hingga hancur. Daun pare yang telah hancur dicampurkan dengan etanol 96% dengan perbandingan volume 1:5, satu untuk serbuk daun pare dan lima untuk etanol 96%. Campuran tersebut diaduk hingga homogen ditutup dengan alumunium foil kemudian didiamkan dalam temperatur ruang selama 4 hari. Larutan kemudian disaring menggunakan kertas saring dan filtrat ditampung dalam labu Erlenmeyer. Ampas hasil saringan kemudian ditambah etanol
96% dengan jumlah perbandingan yang sama, kemudian didiamkan kembali selama 4 hari. Larutan kemudian disaring kembali menggunakan kertas saring, dan filtrat ditampung dalam labu Erlenmeyer. Setelah didapatkan larutan yang telah disaring, larutan tersebut dituang ke cawan petri, dimasukkan ke dalam inkubator dan dikeringkan pada temperatur 60oC selama ± 24 jam hingga ekstrak didapat ekstrak kering. Ekstrak kering kemudian dikemas di dalam plastik dan timbang lalu disimpan di dalam lemari es (4-8°C) untuk digunakan pada pengujian berikutnya.
3. Penentuan Dosis
Dosis ekstrak daun pare yang diuji yaitu 0 mg.kg-1 bb, 750 mg.kg-1 bb, 1000 mg.kg-1 bb dan 1250 mg.kg-1 bb. Berat rata-rata mencit yang digunakan yaitu berkisar 30 ± 2 g, maka perlakuan ditentukan berdasarkan perhitungan sebagai berikut.
a) Untuk perlakuan dengan dosis 0 mg.kg-1 bb 30/1000 x 0 = 0 mg ekstrak etanol daun pare b) Untuk perlakuan dengan dosis 750 mg.kg-1 bb
30/1000 x 750 = 22.5 mg ekstrak etanol daun pare c) Untuk perlakuan dengan dosis 1000 mg.kg-1 bb
30/1000 x 1000 = 30 mg ekstrak etanol daun pare d) Untuk perlakuan dengan dosis 1250 mg.kg-1 bb
30/1000 x 1250 = 37.5 mg ekstrak etanol daun pare 4. Persiapan Mencit
Disiapkan empat puluh ekor mencit (M. musculus L.) betina dengan usia matang kelamin yaitu berusia sekitar 2 bulan dan berat yang sama berkisar 30 ± 2 g. Disediakan pula 8 ekor pejantan untuk mengawini betinanya. Mencit dipastikan dalam keadaan sehat dan normal, hal tersebut dapat dilihat dari keadaan mencit yang tidak cacat, aktif bergerak dan nafsu makannya baik. Seluruh mencit diperoleh dari animal house Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman.
larutan NaCl 0,9% kemudian secara perlahan dimasukkan kedalam vagina mencit sedalam ± 5 mm dan diputar searah secara perlahan-lahan dua hingga tiga kali. Object glass dibersihkan dengan alkohol 70% dan dikeringudarakan. Ujung cotton bud yang sudah dioleskan pada vagina tersebut dioleskan memanjang dua atau tiga baris olesan dengan arah yang sama pada object glass. Olesan vagina dikeringudarakan kemudian ditetesi dengan larutan methylen blue 1% sambil sesekali dimiringkan agar pewarnaan merata pada permukaan ulasan dan ditunggu selama ± 5 menit. Pewarna yang berlebihan dibersihkan dengan dibilas menggunakan akuades atau air mengalir kemudian dikeringudarakan dan ditutup dengan cover glass. Preparat diamati dengan mikroskop pada perbesaran 100x dan diidentifikasi tipe serta proporsi sel dalam preparat apus untuk menentukan fase estrusnya (Rough, 1962).
Mencit betina yang sedang berada dalam fase proestrus maupun estrus, dikandangkan bersama mencit jantan dalam satu kandang agar terjadi perkawinan. Evaluasi keberhasilan perkawinan adalah terbentuknya vaginal plug (Gambar 3.5.) pada mencit betina. Hari terbentuknya sumbat vagina (vaginal plug) ditetapkan sebagai hari ke-0 masa kehamilan. Mencit betina yang telah membentuk vaginal plug dipisahkan dari pejantan dan siap diberi perlakuan.
Gambar 3.5. Vaginal plug pada Mencit Betina (Mus musculus L.)
Keterangan : Tanda panah menunjukan adanya vaginal plug
6. Pemberian Perlakuan dan Pemeliharaan
Ekstrak yang diberikan pada mencit diencerkan dengan menggunakan akuades sebanyak 0,5 ml sesuai dengan dosis perlakuan. Ekstrak etanol daun pare yang telah disiapkan, dimasukkan ke dalam sonde yang dihubungkan
dengan spuit injeksi kemudian sonde tersebut dimasukkan ke dalam kerongkongan sedalam ± 3 cm. Dengan hati-hati ekstrak etanol daun pare tersebut didorong menggunakan spuit injeksi agar dapat masuk ke saluran pencernaan mencit.
Perlakuan diberikan selama 18 hari yang dimulai pada hari ke-1 kehamilan setelah terbentuk vaginal plug dan diberikan setiap hari sekali pada pukul 07.00-08.00 pagi. Mencit dipelihara dalam kondisi pencahayaan alami dalam animal house. Pakan mencit berupa pelet komersial dengan kandungan protein 18% dan minum diberikan setiap hari secara ad libitum. 7. Pengambilan Data
Data penelitian berupa perkembangan kelenjar mammae mencit dievaluasi setiap 6 hari sejak terbentuknya vaginal plug hingga hari ke-18. Pada setiap pengambilan data, bagian ventral mencit diamati dan difoto untuk mengevaluasi morfologi kelenjar mammae mencit. Mencit dimatikan dengan cara cervical dislocation. Kelenjar mammae dengan ukuran 3x3 mm2 diangkat kemudian difiksasi dalam larutan NBF selama 48 jam. Kelenjar mammae selanjutnya diproses untuk pembuatan sediaan histologis menggunakan metode parafin dan dievaluasi perkembangannya.
7.1. Pembuatan Sediaan Histologis Kelenjar Mammae dengan Metode Parafin (Suntoro, 1983; yang telah dimodifikasi oleh Laboratorium Struktur dan Perkembangan Hewan, Fakultas Biologi Unsoed).
Jaringan kelenjar mammae mencit yang telah difiksasi dengan NBF di dalam botol sampel selama 48 jam, diproses lebih lanjut untuk pembuatan sediaan histologis dengan tahapan sebagai berikut.
7.1.1. Dehidrasi: tahap dehidrasi dilakukan dengan sampel direndam di dalam larutan alkohol bertingkat mulai dari 70%, 80%, 90% dan 2x100% masing-masing selama 30 menit.
7.1.2. Clearing: tahap ini dilakukan dengan cara sampel direndam dalam campuran alkohol:xylol (3:1), alkohol:xylol (1:1), alkohol:xylol (1:3), dua kali xylol murni masing-masing selama
xylol:parafin (1:3), dua kali dalam parafin murni masing selama 30 menit.
7.1.4. Penanaman jaringan di dalam blok parafin dilakukan dengan cara parafin cair dituangkan ke dalam cetakan dari kertas karton berukuran 1,5 x 1,5 cm. Sampel ditanam dalam parafin yang sudah agak memadat pada bagian dasarnya, kemudian diatur posisinya sesuai dengan orientasi pengirisan jaringan yang diinginkan. Parafin cair ditambahkan kedalam cetakan kemudian diletakkan holder dari blok kayu yang telah diberi label. Parafin dibiarkan membeku dalam temperatur ruang.
7.1.5. Pengirisan blok parafin yang berisi jaringan kelenjar mammae menggunakan mikrotom putar dengan ketebalan 5µm secara seri.
7.1.6. Penempelan jaringan ke object glass yang telah dilapisi dengan gelatin 1%
7.1.7. Pewarnaan
a. Jaringan dideparafinisasi dengan mencelupkan sampel kedalam xylol dua kali masing-masing selama 5 menit.
b. Jaringan direhidrasi dengan cara mencelupkan sampel dalam larutan alkohol 2x100%, 90%, 80%, 70%, akuades masing-masing 30 celupan selama 30 detik.
c. Jaringan diwarnai dengan larutan hematoxylin selama 10 menit kemudian dicuci dalam air mengalir selama 1 menit.
d. Jaringan diwarnai dengan eosin selama 2 menit kemudian dicuci dalam air mengalir selama 1 menit kemudian dicelupkan dalam akuades sebanyak 30 celupan.
e. Jaringan didehidrasi dengan cara mencelupkan sampel kedalam larutan alkohol bertingkat mulai dari 70%, 80%, 90% dan 2x100% masing-masing selama 40 celupan.
f. Clearing dalam xylol dua kali masing-masing selama 5 menit. g. Object glass diangkat dari larutan xylol, diletakkan di atas
(entelan new) diteteskan di atas jaringan dan ditutup dengan
cover glass.
7.2. Evaluasi struktur mikroskopis kelenjar mammae
Jaringan yang sudah diproses menjadi irisan histologis dengan metode parafin dan diwarnai dengan hematoxylin-eosin, selanjutnya diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 40x dan 100x. Aspek yang dievaluasi meliputi struktur kelenjar mammae dan volume kelenjar mammae.
7.2.1. Evaluasi struktur kelenjar mammae
Struktur kelenjar mammae dievaluasi pada satu lokasi yang sama yaitu pada bagian inguinal tubuh mencit betina yang dapat mewakili jumlah keseluruhan kelenjar mammae pada mencit.
Gambar 3.7. Posisi Kelenjar Mammae pada Mencit (M. musculus L.)
Keterangan: Tanda panah menunjukan papila mammae mencit
7.2.2. Pengukuran volume kelenjar mammae (Cavalieri principle) (Michel dan Cruz-Orive 1988) dengan modifikasi.
Seluruh irisan histologi pada setiap sampel/ mencit dievaluasi untuk menghitung jumlah irisan yang memiliki kelenjar mammae. Jumlah ini disimbolkan dengan x. Pada setiap sampel dievaluasi sebanyak 10 irisan dengan interval tertentu (y). Interval ditentukan dengan cara y = . Dengan demikian evaluasi dilakukan pada irisan ke y1...y10. Luas kelenjar mammae pada setiap interval
Luas area pada setiap kotak dihitung 1 apabila luas area ≥ kotak dan apabila luas area < dihitung 0, kemudian volume keseluruhannya dihitung menggunakan Cavalieri’s principle
dengan rumus sebagai berikut:
V = t. a (p). j (p) dengan t = interval x ketebalaan irisan Keterangan: V = volume
t = rata-rata ketebalan irisan a(p) = area pada setiap poin
j(p) = jumlah area gratikel yang menutup objek dalam seluruh irisan
Seluruh irisan kelenjar mammae diamati di bawah mikroskop. Seluruh irisan yang mengandung kelenjar mammae dihitung dan didapatkan jumlah x. Nilai x dibagi denngan 10 untuk mendapatkan interval y.
8. Analisis Data
Data kuantitatif berupa volume dianalisis dengan Anova satu arah pada tingkat signifikansi 1% dan 5%. Hasil uji F menunjukan adanya perbedaan signifikan pada p<0,05, maka analisis dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil (BNT) untuk mengetahui berapa dosis yang paling berpengaruh. Data kualitatif berupa gambaran histologis kelenjar mammae dianalisis secara deskriptif.
