III. MATERI DAN METODE
A. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian 1. Materi Penelitian
Bahan yang digunakan adalah ikan Senggaringan (Mystus nigriceps) dari DAS Serayu di wilayah Banyumas, alkohol 96% PA, Chelex® 5%, DTT (dithiotritol) 0,1 mM, Proteinase-K, TAE (tris Borid Acid EDTA) 10x, agarosa, etidium bromide, loading dye, DNA marka 1 kb, buffer PCR 10x, dNTP 10, Taq DNA polimerase, H2O/ddH2O, kertas parafilm danurutan primer/ kit RAPD yang digunakan ialah:
No Nama Primer Urutan Basa
1 OPA-07 (5'- G A A A C G G G T G -3')
2 OPA-09 (5' -G G G T A A C G C C - 3') 3 OPA-11 (5' - C A A T C G C C G T - 3') 4 OPA-20 (5' - G T T G C G A T C C - 3')
5 OPAC-14 (5' - G T C G G T T G T C - 3') 6 OPAH-01 (5' - T C C G C A A C C A - 3')
7 OPAH-02 (5' - C A C T T C C G C T - 3') 8 OPAH-04 (5' - C T C C C C A G A C - 3') 9 OPAH-08 (5' - T T C C C G T G C C -3')
10 OPAH-09 (5' - A G A A C C G A G G - 3')
Alat-alat yang digunakan adalah eppendorf 1,5 ml dan 0,2 ml, micropipets dan tips (10µl, 200 µl, dan 1000 µl), thermomixer, microcentrifuge, electric stove, erlenmeyer, timbangan analitik, electroporesis tray, electrophoresis chamber, power supply, UV transiluminator, nanophotometer, thermocycler, gloves dan camera digital.
2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitiaan dilaksanakan di Laboratorium Taksonomi Hewan Fakultas Biologi dan Laboratorium Riset Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto selama 6 bulan mulai dari Oktober 2013 hingga Februari 2014.
8 B. Metode Penelitian
1. Metode dan Teknik Pengambilan Sampel
Metode yang digunakan adalah survey dengan teknik pengambilan sampel secara purposive random sampling, yaitu pengambilan sampel secara acak pada daerah sungai Serayu telah ditentukan.
2. Variabel yang diamati
Variabel yang diamati yaitu pola pita dan jumlah fragmen DNA dari hasil amflifikasi PCR.
3. Cara Kerja
a. Pengambilan Sampel Jaringan
Jaringan insang M. nigriceps dipotong dari masing-masing sampel dengan ukuran kurang lebih 5 mm. Sampel jaringan sirip selanjutnya diawetkan dalam alkohol 96% PA kemudian disimpan pada temperatur 4oC hingga analisis DNA dilakukan.
b. Isolasi DNA Genom
DNA diisolasi menggunakan metode Chelex® 5%. Jaringan ikan yang telah dipotong dimasukkan kedalam tabung mikrosentrifuga 1,5 mL yang telah berisi 100 µL chelex 5%, 5 µL ditiothreitol, 4 µL Proteinase-K dan 2 µL RNAse. Jaringan insang tersebut kemudian diinkubasi menggunakan thermomixer pada temperatur 540C selama 6 jam pada kecepatan 1000 rpm. Sampel yang telah diinkubasi kemudian disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 13000 rpm. Supernatant kemudian ditransfer ke dalam tabung mixrosentrifuga baru dan diinkubasi kembali pada temperatur 940C selama 10 menit.
c. Uji Hasil Isolasi DNA Genom c.1. Pembuatan Gel Agarosa
Gel agarosa 1,2 % dibuat dengan mencampurkan 1,2 gram agarosa dan 100 ml TAE. Larutan agarosa kemudian dipanaskan pada hotplate sampai mendidih. Gel agarosa dibiarkan sampai temperatur kurang lebih 600C dan ditambahkan etBr dengan perbandingan 30 µL etBr dalam 30 mL agarosa atau sekitar 5 µl sebelum dituang kedalam baki elektroforesis. Kedua ujung baki diberi lakban untuk mencegah gel keluar dan sisir elektroforesis dipasang kemudain gel agarosa dituang. Sisir diangkat setelah gel dingin sehingga terbentuk sumuran.
9 2. Elektroforesis
DNA hasil isolasi sebanyak 5 µL dicampur dengan 3 µL loading dye dengan menggunakan mikropipet di atas kertas parafilm, kemudian campuran tersebut dimasukkan ke dalam sumuran sesuai urutan sampel. Salah satu sumuran diberi 5 µL DNA marker 1 kb (kilobasa). Elektoforesis dilakukan dengan cara menghubungkan tray pada power supply pada tegangan 100 Volt, 400 A selama 50 menit.
3. Visualisasi dan Dokumentasi
Produk isolasi berupa pita DNA yang telah dimigrasikan diletakkan di atas lampu UV transiluminator dan didokumentasikan.
d. Amplifikasi Fragmen DNA Menggunakan PCR
Proses amplifikasi marka RAPD dilakukan dengan volume total campuran reaksi PCR sebanyak 25 µL. Campuran reaksi PCR terdiri dari 2,5 µL buffer PCR; 1,75 µL primer; 1,5 µL dNTP; 0,2 µL Taq DNA polymerase; 2,5 µL DNA template (DNA hasil isolasi) dan 16,55 µL H2O. Konsentrasi masing-masing reagen
disesuaikan selama proses optimasi kondisi termal PCR. Untuk mengontrol ada tidaknya kontaminasi digunakan control negative berupa campuran reaksi PCR tanpa DNA templat.
Predenaturasi dilakukan selama 3 menit pada temperatur 950C, diikuti dengan 45 siklus yang terdiri atas fase denaturasi pada temperatur 940C selama 15 detik, penempelan primer (annealing) selama 20 detik pada temperatur 450C, dan fase pemanjangan (elongation) pada temperatur 720C selama 1,5 menit. Selanjutnya, tahap pemanjangan akhir (final extension) dilakukan selama 10 menit pada temperatur 720C. Temperatur annelingi dan lama waktu tiap fase dioptimasi untuk medapatkan kondisi terbaik bagi berlangsungnya proses PCR.
e. Visualisai Migrasi marka DNA
Produk PCR dimigrasikan dalam elektroforesis gel agarosa 1,2% dan diwarnai dengan cara merendamnya dalam larutan etidium bromida. Gel hasil pewarnaan diletakan di atas lampu UV transilluminator dan didokumentasikan. Hasil dokumentasi tersebut akan digunakan sebagai dasar dalam analisis produk amplifikasi seperti pita dan jumlah pita. DNA ladder juga dimigrasikan dalam gel agarosa bersama dengan sampel RAPD untuk menentukan ukuran molekul masing-masing pita RAPD yang dihasilkan.
10 C. Metode Analisis
Penentuan primer terseleksi dilakukan secara deskriptif berdasarkan ada tidaknya pita DNA spesifik pada gel agarosa. Keragaman genetik dianalisis secara statistik menggunakkan molecular diversity indices yang terdapat dalam software Arlequin (versi 3.1). Langkah pertama dituliskan data yang digunakan pada aplikasi notepad, dan file atau data disimpan dalam bentuk arp (Arlequin project). Dibuka aplikasi Arlequin, diklik open project. Dipilih data yang telah disimpan sebelumnya. Diklik settings dan pilih molecular diversity indices, diceklist semua yang disarankan. Dipilih Pairwise difference pada kolom molecular distance. Kemudian diklik start, hasil akan terhubung langsung pada aplikasi internet seperti mozilla firefox, opera, google chrome dan pendukung lainnya.
D. Bagan Alir Penelitian
Gambar 3.1. Bagan alir aenelitian Persiapan Alat dan Bahan
Penelitian
Pengambilan Sampel Mystus
nigriceps di DAS Serayu
Pengukuran konsentrasi
DNA dengan
Nanophotometer
Visualisai Migrasi marka DNA
Isolasi DNA genom dengan Metode Chelex 5%
Analisis Data (molecular diversity indices)
RAPD-PCR
HASIL (Lampiran 3) Hasil analisis molecular diversity indeces
