III BAHAN DAN METODE
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan dari bulan Maret 2006 sampai Maret 2007. Penelitian bertempat di laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas MIPA, Institut Pertanian Bogor dan di laboratorium Biokimia Mikroba, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, LIPI, Bogor.
3.2 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan untuk penelitian yaitu : autoklaf, UV-VIS spektrofotometer (Shimadzu UV-1700), sentrifusa (Kubota 6500), shaker, laminar
air flow, penangas air, pipet mikro (Gilson), piranti elektroforesis (Mini Protean 3,
Biorad), kolom kromatografi, fraction collector (Biorad model 2110), timbangan analitik (AND GR-200), pH meter (Schott), pengaduk bermagnet, vorteks, cawan petri, gelas piala, labu ukur, gelas ukur, tabung reaksi, pipet serologis, dan erlenmeyer. Bahan-bahan yang digunakan yaitu : isolat Streptomyces sp SKK1-8 (koleksi Dr. Ir. Yulin Lestari, Departemen Biologi, FMIPA, IPB), substrat birchwood xilan (Fluka), sukrosa, ekstrak khamir, agar-agar, DNS, KNa tartrat, NaOH, Na2SO3,
Coomassie brilliant blue G-250, etanol 95%, asam fosfor 85%, aseton, Na2HPO4, NaH2PO4, asam sitrat, Tris, HCl, Sephadex G-100 (Sigma), DEAE-Sephadex A50 (Sigma), NaCl, sodium dedosil sulfat (SDS), poliakrilamida, bis akrilamida, N,N,N,N-Tetrametiletilendiamina (TEMED), amonium persulfat, bromophenol blue, glisin, protein penanda dengan berat molekul rendah, p-nitrofenol dan berbagai substrat turunannya (β-D-xilanopiranosida, α-L-arabinofuranosida, p-NP-α-D-glukopiranosida dan p-NP-α-D-galaktopiranosida, p-NP-asetat) dari Amersham, dan akuades. Bahan kimia tersebut dari Merck (kecuali yang disebutkan) dan berkualitas pro analisa.
3.3 Metode Penelitian
3.3.1 Preparasi Larutan Xilanase
Streptomyces sp. SKK1-8 diremajakan pada cawan petri berisi media
agar-agar xilan (mengandung 1 % ekstrak khamir, 10.3 % sukrosa dan 0.5 % birchwood xilan), diinkubasi pada suhu kamar selama 4 hari sampai terbentuk spora (sporulasi). Sebanyak 3 cockborer kultur padat Streptomyces sp SKK1-8 tersebut diinokulasikan ke dalam erlenmeyer yang berisi 100 ml media cair xilan, diinkubasikan pada suhu kamar selama 10 hari dengan pengocokan (150 rpm). Kultur cair disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 oC. Filtrat yang diperoleh dipisahkan dari endapan dan digunakan sebagai ekstrak kasar xilanase.
3.3.2 Pengujian Aktivitas Xilanase
Aktivitas xilanase diukur dengan mendeteksi gula pereduksi sebagai produk hidrolisa xilan oleh xilanase menggunakan metode Miller (Miller 1959). Sebanyak 100µl larutan enzim ditambahkan pada campuran 1 ml substrat (0.5% birchwood xilan dalam 100 mM bufer fosfat pH 6.0) dan 0.9 ml larutan bufer fosfat (100 mM, pH 6.0), diinkubasikan pada suhu 50 oC selama 30 menit. Reaksi enzimatis diakhiri dengan penambahan 2 ml reagen DNS (asam dinitrosalisilat) dan dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit. Campuran reaksi didinginkan dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Kontrol dibuat dengan cara yang sama seperti pengujian aktivitas xilanase akan tetapi larutan enzim ditambahkan setelah penambahan reagen DNS. Blanko dibuat dengan cara yang sama akan tetapi larutan enzim diganti dengan 100µl akuades. Xilosa digunakan sebagai standar untuk penghitungan aktivitas xilanase. Satu unit aktivitas xilanase dinyatakan sebagai banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol gula xilosa dari substrat birchwood xilan permenit pada kondisi seperti tersebut di atas (suhu 50 oC, pH 6.0).
3.3.3 Pengendapan Xilanase Menggunakan Amonium Sulfat dan Aseton
Xilanase diendapkan pada suhu dingin (diatas penangas es) dengan cara menambahkan amonium sulfat yang telah dihaluskan atau aseton dingin sedikit demi sedikit ke dalam larutan xilanase kasar sambil diaduk perlahan dengan pengaduk bermagnet sampai mencapai kejenuhan tertentu. Pengadukan dilanjutkan selama 15 menit kemudian larutan disimpan dalam lemari pendingin selama semalam. Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan sentrifugasi dan dilarutkan dengan 10 mM bufer fosfat pH 6.0. Penghitungan banyaknya amonium sulfat atau aseton yang ditambahkan ke dalam larutan enzim diperlihatkan dalam lampiran 4.
Guna memperoleh hasil yang optimal maka pengendapan xilanase
Streptomyces sp. SKK1-8 dilakukan secara bertahap, yaitu dengan 50%-80% aseton.
Mula-mula aseton ditambahkan pada larutan enzim kasar sampai mencapai konsentrasi 50%, disentrifugasi pada kecepatan 5.000 rpm dan endapan yang merupakan protein pengotor dibuang. Selanjutnya aseton ditambahkan lagi ke dalam filtrat sampai mencapai konsentrasi 80%, disentrifugasi dan filtratnya dibuang. Endapan dilarutkan dengan 0.05M bufer fosfat pH 6.0, disentrifugasi untuk memisahkan protein tidak larut yang merupakan protein terdenaturasi. Filtrat yang diperoleh dimurnikan lebih lanjut.
3.3.4 Pemisahan Xilanase dengan Polimer Eudragit S100
Preparasi 2% Eudragit S100: 2 gr eudragit S100 ditambah 80 ml akuades, dinaikkan pHnya dengan penambahan 3 M NaOH sampai mencapai pH 11. Selanjutnya pH diturunkan dengan penambahan 3 M HCl sampai mencapai pH 7.0 dan volume ditepatkan menjadi 100 ml. Larutan disimpan dalam lemari pendingin sampai digunakan.
Pemisahan xilanase dengan eudragit S100 dilakukan berdasarkan metode yang digunakan oleh Breccia et al. (1998) yang dimodifikasi. Sebanyak 40 ml ekstrak kasar xilanase ditambahkan pada 20 ml 2% eudragit S100, diaduk dengan magnetik stirer dan diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit. Selanjutnya pH diturunkan dengan penambahan 2 M asam asetat sampai mencapai pH 4.0 dan disentrifugasi
pada kecepatan 5 000 g selama 15 menit. Supernatan disimpan (supernatan 1) dan endapan dicuci dengan 10 mM bufer asetat pH 4.0 dan disentrifugasi. Supernatan disimpan (supernatan 2), endapan dilarutkan dengan 14 ml 0.1 M bufer fosfat pH 7.5 kemudian ditambahkan NaCl dan Triton X-100 dengan konsentrasi akhir berturut-turut 1M dan 0.2%. Larutan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. Ditambahkan 2 M asam asetat sampai pH mencapai 4.0, didiamkan selama 20 menit dan disentrifugasi. Supernatan disimpan (supernatan 3) dan endapan dilarutkan dalam 1.5 ml 0.1 M bufer fosfat pH 7.5 (xilanase terikat eudragit S100). Dilakukan pengujian aktivitas xilanase pada supernatan 1, 2, 3 dan xilanase terikat eudragit S100 (terimobilisasi).
3.3.5 Pemurnian Xilanase
Xilanase dimurnikan dengan menggunakan kromatografi filtrasi gel dan penukar ion. Matrik Sephadex G-100 sebanyak 10 gram dikembangkan dalam 10 mM bufer fosfat pH 6.0, dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 1 jam dan dimasukkan ke dalam lemari pendingin selama semalam. Didekantasi untuk membuang matrik yang tidak mengendap dan ditambahkan 100 ml larutan bufer yang sama. Matrik dituang ke dalam kolom kromatografi dan diseimbangkan dengan 10 mM bufer fosfat pH 6.0. Selanjutnya dibilas dengan bufer yang sama dengan kecepatan alir 0.5 ml/menit. Setiap 3 ml eluen ditampung, diukur kadar proteinnya pada panjang gelombang 280 nm dan diukur aktivitas xilanasenya. Dibuat grafik Profil elusi dimana sumbu X merupakan nomor fraksi sedangkan sumbu Y merupakan nilai kadar protein dan nilai aktivitas xilanase. Fraksi yang mengandung xilanase hasil filtrasi gel digabungkan, dimasukkan ke dalam kantong dialisis (molecular weight cut off 10 000) dan didialisis dengan 10 mM Tris-HCl pH 8.0 dalam lemari pendingin. Selama dialisis bufer diganti sebanyak 2 kali.
Matrik DEAE-Sephadex A50 sebanyak 7 gram dikembangkan dengan 10 mM Tris-HCl pH 8.0, dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 1 jam dan disimpan dalam lemari pendingin selama 1 malam. Didekantasi untuk membuang matrik yang tidak mengendap dan ditambahkan 100 larutan bufer yang sama. Matrik
dituang ke dalam kolom kromatografi dan diseimbangkan dengan 10 mM bufer Tris-HCl pH 8.0. Larutan xilanase hasil dialisis dimasukkan ke dalam kolom yang berisi matrik DEAE-Sephadex A50. Protein yang tidak terikat matrik dibilas dengan bufer yang sama, sedangkan protein yang terikat matrik dibilas dengan gradien linier larutan NaCl (0-0.5 M NaCl dalam bufer yang sama) dan 1 M NaCl. Pembilasan dilakukan dengan kecepatan alir 0.5 ml/menit, setiap 3 ml eluen ditampung, diukur kadar protein dan diuji aktivitasnya. Dibuat grafik profil elusi dan dilihat kemurniannya dengan elektroforesis.
Elektroforesis dilakukan pada piranti elektroforesis vertikal Mini Protean 3 (Bio-Rad) pada kondisi protein terdenaturasi (SDS-PAGE) atau tidak terdenaturasi (native PAGE). Larutan xilanase dari setiap tahap pemurnian dilarikan pada gel poliakrilamida (4% akrilamida pada gel penahan dan 10% akrilamida pada gel pemisah). Elektroforesis dilakukan pada tegangan 100 volt, 50 mA sampai pewarna bromofenol biru mencapai sekitar 1 cm dari tepi gel bagian bawah. Hasil elektroforesis diwarnai dengan pewarna Coomasie Brilliant Blue (CBB) atau pewarna perak nitrat. Fraksi filtrasi gel dan fraksi kromatografi penukar anion dipekatkan 40 kali sebelum dilakukan elektroforesis.
3.3.6 Penghitungan Berat Molekul Xilanase
Penghitungan berat molekul xilanase dilakukan dengan cara membandingkan jarak migrasi pita xilanase dengan pita protein penanda yang memiliki berat molekul rendah (low molecular weight marker). Protein penanda yang digunakan yaitu monoalbumin (serum babi, 66 kDa), albumin (telur ayam, 45kDa), karbonik anhidrase (29 kDa) dan α-lactalbumin (14.2 kDa). Persamaan linier protein penanda diperoleh dengan membuat kurva antara Rf dan log berat molekul protein penanda. Perkiraan berat molekul xilanase dihitung dari persamaan linier tersebut.
Rf = jarak migrasi pita protein jarak migrasi bromofenol biru
3.3.7 Pengukuran Kadar Protein
Kadar protein selama pemurnian diukur dengan metode Bradford (Bradford 1976) dan absorbansi pada panjang gelombang 280 nm (untuk pembuatan kromatogram). Pengukuran protein dengan metode Bradford dilakukan dengan cara sebagai berikut : sebanyak 0.4 ml larutan enzim ditambah 4 ml reagen Bradford, dikocok sampai homogen dan diinkubasikan pada suhu kamar selama 15 menit. Diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm.
Bovine Serum Albumine (BSA) digunakan sebagai standar untuk menghitung kadar
protein larutan enzim.
3.3.8 Pengaruh pH dan Suhu Terhadap Aktivitas dan Stabilitas Xilanase
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim diuji dengan cara mereaksikan larutan enzim dengan substrat pada suhu 50 oC selama 30 menit pada berbagai kondisi pH larutan bufer (pH 4.0-9.0 dengan selang 0.5 unit). Gula pereduksi yang terbentuk diukur dengan metode Miller (1959). Stabilitas enzim terhadap pH diuji dengan menginkubasikan larutan enzim dalam 10 mM larutan bufer berbagai pH (3.0-9.0 dengan selang 0.5 unit) selama 1 jam. Setelah inkubasi selesai, dengan cepat diuji aktivitas enzim tersisanya pada kondisi optimum reaksi enzim xilanase dengan konsentrasi larutan bufer sebesar 0.1 M. Nilai aktivitas enzim tersisa dinyatakan dalam persentase dibandingkan dengan kontrol (enzim tanpa perlakuan). Bufer yang digunakan yaitu bufer asetat (pH 4.0-6.0), bufer fosfat (pH 6.0-8.0) dan bufer Tris-HCl (pH 7.0-9.0).
Pengaruh suhu terhadap aktivitas xilanase diuji dengan cara mereaksikan larutan enzim dengan substrat selama 30 menit pada berbagai suhu (40-80 oC dengan selang 5 oC). Aktivitas xilanase dihitung dengan mengukur gula pereduksi yang terbentuk. Stabilitas enzim terhadap suhu diuji dengan menginkubasikan larutan enzim pada berbagai suhu (40-80 oC dengan selang 10 oC) selama 1 jam. Setelah inkubasi selesai larutan enzim dengan cepat didinginkan di dalam penangas es. Selanjutnya aktivitas enzim tersisa diuji pada kondisi standar reaksi enzimatis
xilanase. Nilai aktivitas enzim tersisa dinyatakan dalam persentase dibandingkan dengan kontrol (enzim tanpa perlakuan)
3.3.9 Pengaruh Kation Terhadap Aktivitas Xilanase
Pengaruh kation terhadap aktivitas xilanase diuji dengan cara menambahkan kation (konsentrasi akhir 1 mM) ke dalam campuran substrat-bufer-enzim, dan diinkubasikan pada kondisi optimal reaksi enzimatis. Penghambatan atau peningkatan aktivitas xilanase oleh kation dinyatakan dalam persentase aktivitas xilanase dibandingkan dengan kontrolnya (tanpa penambahan kation logam). Kation ditambahkan dalam bentuk larutan garam klorida, yaitu KCl, NaCl, BaCl2, CaCl2, CoCl2, CuCl2, NiCl2, SrCl2, ZnCl2, FeCl3. Selain itu juga diuji pengaruh EDTA terhadap aktivitas xilanase.
3.3.10 Studi Kinetika Xilanase
Studi kinetika dilakukan dengan membuat grafik Lineweaver-Burk (double
reciprocal) untuk menentukan nilai Km dan Vmax reaksi enzimatis dari xilanase
Streptomyces sp SKK1-8. Persamaan Lineweaver-Burk : 1 = Km 1 + 1
V Vmax [S] Vmax transformasi linier dari persamaan Michaelis Menten. Grafik double reciprocal diperoleh dari hubungan antara 1/[S] sebagai sumbu X dan 1/v sebagai sumbu Y. Kecepatan reaksi (v) diukur sebagai kecepatan pembentukan produk (xilosa) persatuan waktu.
Sebanyak 0.2 ml larutan enzim ditambahkan ke dalam campuran 2 ml substrat birchwood xilan berbagai konsentrasi dan 1.8 ml 50 mM larutan bufer pH optimum, diinkubasikan selama 40 menit pada suhu optimum reaksi enzimatis. Setiap 5 menit sekali diambil 0.3 ml dan ditambahkan 0.6 ml larutan DNS, dimasukkan ke dalam penangas air yang mendidih selama 15 menit kemudian didinginkan dalam air. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm dan kadar gula pereduksi dihitung dengan persamaan kurva standar xilosa. Dibuat grafik hubungan antara
waktu (sumbu X) dan kadar xilosa (sumbu Y) dari berbagai konsentrasi substrat awal dimana nilai kecepatan reaksi (v) merupakan nilai kemiringan grafik tersebut. Selanjutnya dibuat grafik double reciprocal dan didilakukan penentuan nilai Km dan Vmaxnya.
3.3.11 Hidrolisis Substrat Spesifik
Pengujian hidrolisis substrat spesifik dilakukan dengan cara mereaksikan larutan enzim dengan berbagai substrat spesifik yang merupakan turunan p-nitrofenol, yaitu : α-L-arabinosida (substrat untuk α-L-arabinosidase), xilanopiranosida (substrat untuk xilanopiranosidase), p-nitrofenol-β-D-glukopiranosida (substrat untuk β-D-p-nitrofenol-β-D-glukopiranosidase), p-nitrofenol-α-D-galaktopiranosida (substrat untuk α-D-p-nitrofenol-α-D-galaktopiranosidase) dan p-nitrofenol-asetat (substrat untuk asetil xilan esterase). Sebanyak 100 µl larutan enzim ditambahkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 900 µl substrat spesifik dalam 50 mM bufer pada pH optimal, kemudian diinkubasi pada suhu optimal selama 30 menit. Reaksi enzimatis dihentikan dengan penambahan 100 µl Na2CO3 0.4M dan banyaknya p-nitrofenol yang terbentuk dideteksi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 405 nm. Satu unit aktivitas enzim dinyatakan sebagai banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol p-nitrofenol dari substrat spesifik permenit pada kondisi seperti tersebut di atas.
