Inokulasi Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusakan agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini agar menghindari
terjadinya kontaminasi (Dwijoseputro, 1998). Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik penanaman bakteri (inokulasi) yaitu :
1. Menyiapkan ruangan Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril agar tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan .dalam labotarium pembuataan serum vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat dilakukan dalam sebuah kotak kaca (encast) udara yang lewat dalam kotak tersebut dilewatkan saringan melalui suatu jalan agar tekena sinar ultraviolet (Pelczar, 1986).
2. Pemindahan dengan dengan pipet Cara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum atau pada penyelidikan untuk diambil 1 ml contoh yang akan diencerkan oleh air sebanyak 99 ml murni (Pelczar, 1986).
3. Pemindahan dengan kawat inokulasi Ujung kawat inokulasi sebaliknya dari platina atau nikel .ujungnya boleh lurus juga boleh berupa kolongan yang diametrnya 1-3mm. Dalam melakukuan penanaman bakteri kawat ini terlebih dahulu dipijarkan sedangkan sisanya tungkai cukup dilewatkan nyala api saja setelah dingin kembali kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala (Pelczar, 1986).
Inkubasi merupakan suatu teknik perlakuan bagi mikroorganisme yang telah diinokulasikan pada madia (padat atau cair), kemudian di simpan pada suhu tertentu untuk dapat melihat pertumbuhannya. Bila suhu inkubasi tidak sesuai dengan yang diperlukan, biasanya
mikroorganisme tidak dapat tumbuh dengan baik. Media inkubasi digolongkan menjadi 2 jenis :
1. Pada lemari biasa atau suhu kamar,
2. Pada incubator yang suhunya dapat di tentukan
Proses ini bertujuan agar kita dapat melihat pertumbuhan atau perkembangbiakan pada mikroorganisme.
Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.
Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta.
Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta.
Volk , W. A & Wheeler. M. F. 1993. Mikrobiologi Dasar Jilid 1 Edisi ke 5. Erlangga.
Teknik Inokulasi
Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murnimikroorganisme yaitu : 2.3.1 Metode gores
Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapimemerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yangsempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaanmedia agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antaragaris-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuhmenjadi koloni (Winarni, 1997).Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Biladilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadangberbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaiitu untuk membuatgoresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan (Kus Irianto, 2006). Ada beberapa teknik dalam metode goresan, yakni :
a.Goresan T
Goresan kuadranc.
Goresan Radiand.
Goresan T
Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada bagian luar dasar cawan Petri
Inokulasikan daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung
Panaskan ose dan biarkan dingin kembali. Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan teruskan
goresan di daerah II
Pijarkan kembali ose, Prosedur di atas diulangi untuk daerah III
o Goresan kuadran
o Goresan radian
Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan
Pijarkan sengkelir dan dinginkan kembali
Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus dimulai dari bagian pinggir lempengan
Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus di atas goresan sebelumnya
Pijarkan ose
o Goresan sinambung
Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah permukaan lempengan agar
Jangan pijarkan ose,putar lempengan 1800 ,gunakan sisi mata ose yang sama dan gores pada sisa
permukaan lempengan agar
Waluyo, Lud, 1998, Mikrobiologi Umum, MM-Press, Jakarta
http://rosdianabaso.blogspot.com/2013/10/laporan-mikrobiologi-isolasi-dan_7693.html
Metode tebar
Setetes inokolum diletakan dalam sebuah medium agar nutrien dalam cawanpetridish dan dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan steril. Inokulasi itudisebarkan dalam medium batang yang sama dapat digunakan dapat menginokulasikanpinggan kedua untuk dapat menjamin penyebaran bakteri yang merata dengan baik. Padabeberapa pinggan akan muncul koloni koloni yang terpisah-pisah (Winarni, 1997)
Metode tuang
Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukanpengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat hanyaditemukan satu sel di dalam tabung (Winarni, 1997).
Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan ujung jarumose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam media (Winarni,1997)
Macam-Macam Media
Ada beberapa macam media yang digunakan untuk inokulasi yaitu :1.Mixed culture: berisi dua atau lebih spesies mikroorganisme2. Plate culture: media padat dalam petridish3. Slant culture : media padat dalam tabung reaksi
1
3. Stap culture : media padat dalam tabung reaksi, tetapi penanamannya dengan
carapenusukan.5. Liquid culture : media cair dalam tabung reaksi.6. Shake culture: media cair dalam tabung reaksi yang penanamannya dikocok.(Dwijoseputro, 1998)
Inokulasi dengan Metode Gores (Medium Agar Datar)
Disediakansebuah cawan petri steril berisi medium agar padat (medium agar yang sebelumnya telahdipanaskan, dituagkan pada cawan petri steril,
kemudian didiamkan untuk proespendingina). Medium agar datar ini
berwarna kekuningan, berfungsi sebagai tempatmenggoreskan bakteri dan tempat pertumbuhan koloni bakteri. Selanjutnya dipanaskan jarum ose hingga membara, berfungsi untuk mensterilisasi jarum sebelum digunakan darimikroorganisme lain. Sumbat kapas tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk dibuka,kemudian dipanaskan bibir tabung, berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan darimikroorganisme lain. Kemudian dimasukkan jarum ose pada medium biakan induk dimanayang digunakan adalah jarum ose bentuk bulat, pengambilan inokulum
denganmenggoreskan ujung bulat pada jarum ke media biakan induk, memungkinkan bakteri dapat terambil banyak. Dipanaskan mulut tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk,berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme udara lain. Setelahitu tabung reaksi segera ditutup dengan sumbat kapas. Digunakan sumbat kapas disinikarena
Setiapperlakuan diusahakan dilakukan secara aseptis (di dekat api bunsen) berfungsi agar saatinokulasi, tidak ada mikroorganisme kontam. Sebelum inokulasi juga terlebih dahulu harusdiusahakan agar semua alat-alat yang digunakan dan medium benar-benar steril. Hal iniuntuk menghindari
kontaminasi yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan. dapat terambil banyak. Dipanaskan mulut tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk,berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme udara lain. Setelahitu tabung reaksi segera ditutup dengan sumbat kapas. Digunakan sumbat kapas disinikarena sifatnya yang dapat menyerap uap air, yang terjadi ketika masa inkubasi. Setiapperlakuan diusahakan dilakukan secara aseptis (di dekat api bunsen) berfungsi agar saatinokulasi, tidak ada mikroorganisme kontam. Sebelum inokulasi juga terlebih dahulu
harusdiusahakan agar semua alat-alat yang digunakan dan medium benar-benar steril. Hal iniuntuk menghindari kontaminasi yaitu masuknya
mikroorganisme yang tidak diinginkan.
Keuntungan penggunaan cawan petri adalah untuk memperoleh biakan dengan jumlah yang banyak dan lebih mudah untuk melihat
morfologibiakan.Medium yang digunakan adalah Nutrient Agar yang
sebelumnya dipanaskan agarbisa membentuk medium. Agar lalu didinginkan dalam tabung reaksi hingga memadat danberwarna kuning muda sehinnga membentuk agar tegak. Medium agar tegak adalahmedium yang dibuat dalam tabung reaksi yang diletakkan tegak pada waktu
pendinginan.Keuntungan dari media agar tegak ini adalah luas permukaan besar sehingga memudahkanuntuk identifkasi sedangkan kerugiannya adalah peluang kontaminasi yang besar karenaluas permukaan yang lebar.
Inokulasi dengan Metode Gores (Medium Agar Miring)
Medium agarmiring berwarna kekuningan berfungsi sebagai tempat menggoreskan jamur dan tempatpertumbuhan koloni jamur. Jarum ose dipanaskan hingga membara berfungsi untuk mensterilisasi jarum sebelum digunakan dari mikroorganisme lain. Sumbat kapas tabungreaksi yang berisi isolat biakan induk dibuka, kemudian bibir tabung dipanaskan
Setiap perlakuan diusahakan dilakukan secara aseptis (di dekat api bunsen)berfungsi agar saat inokulasi, bahan serta alat gelas yang digunakan tetap steril. Inokulumdigoreskan di permukaan media agar miring di dalam tabung reksi yang telah disediakanmenggunakan metode gores mulai dari sisi samping arah zig-zag. Arah zig-zag digunakansupaya memungkinkan koloni yang terbentuk tersebar merata dan tampak jelas serta tidak bertumpuk dari koloni yang akan
terbentuk. Dipanas di sekeliling mulut tabung dansegera ditutup dengan sumbat kapas berfungsi untuk mensterilisasi tabung reaksi danbiakan dari mikroorganisme lain. Inokulum disimpan ke dalam inkubator agar mediumdapat tumbuh pada wadah yang steril dengan menyeting suhu 37 0
C sebagai suhu optimunbakteri untuk tumbuh,
Medium yang digunakan adalah larutan Nutrient Agar yang
sebelumnyadipanaskan agar bisa membentuk medium miring yang
didinginkan hingga memadatdengan memiringkan tabung reaksi sehinnga membentuk agar miring dan berwarna kuningmuda. Medium agar miring adalah medium yang dibuat dalam tabung reaksi yangdiletakkan miring pada waktu pendinginan.Keuntungan media agar miring ini yaitu luas permukaan yang kecil sehinggapeluang kontaminasi rendah dan dapat memperluas bidang untuk digunakan strain murni(indukan murni).
Sedangkan kerugiannya hanya memuat sedikit mikroorganisme.Media agar untuk bakteri digunakan media NA (Nutrien Agar) karenakomposisinya yang terdiri dari ekstrak daging sapi di dalamnya yang mengandung
protein,karbohidrat, vitamin, dan sedikit lemak, juga terdapat adanya faktor pertumbuhan yangtidak mampu disintesis mikroorganisme. Medium NA berfungsi untuk membiakkanberbagai macam mikroorganisme serta kultur bakteri. Medium NA dibuat atau disediakanuntuk medium bagi bakteri. Sedangkan medium NA yang instant merupakan media nonsintetik karena menggunakan bahan yang terdapat di alam biasanya tidak
diketahuikandungannya secara rinci. Struktur protein besar dan relatif insolubel yang mana hanya sebagian kecil bakteri saja yang dapat langsung
menggunakannnya, tetapi enzim yangdisebut pepton dapat mengurai protein menjadi rantai yang lebih kecil yang disebut pepton.Bagian kecil dan solubel ini dapat dicerna oleh sebagian besar bakteri. Medium inimemiliki komposisi kimia tertentu antara lain OXOID CMD003
Nutrient Agar
, typcalformula (g/l) yaitu :Lab-lemco powder 1.0, Yeast extract 2.0 (yang berfungsi sebagaifermentor), Pepton 5.0 (sebagai sumber protein), Sodium Chlorida 5.0 (sebagai sumberunsure S dan sumber garam mineral), Agar 15.0 (sebagai pemadat), Akuades1000 ml, Ekstrak daging sapi : 3 gr, NaCl : 8 gr
