Setelah itu labu destruksi didinginkan dan larutan dimasukkan ke dalam labu penyuling dan diencerkan dengan 300 ml air. Selanjutnya ditambah beberapa butir batu didih dan larutan dijadikan basa dengan menambahkan kira- kira 100 ml NaOH 33%, labu dipasang dengan cepat ke alat penyuling. Sulingan (NH3 dan air) ditangkap dalam satu labu erlenmeyer yang terlebih dahulu telah diberi sejumlah H2SO4 dengan titrasi tetentu (misalnya 0,3 N) yang jumlahnya tergantung pada banyaknya N yang terikat dan 2 tetes indikator campuran.
Penyulingan diteruskan, hingga semua N dari cairan tertangkap oleh H2SO4 yang ada dalam labu erlenmeyer (bila 2/3 dari cairan dalam labu penyuling telah menguap). Labu erlenmeyer berisi sulingan diambil dan dititar kembali dengan standar NaOH dengan titar tertentu (0,1 N) = Z ml. Perubahan warna dari biru ke hijau menandakan titik akhir. Selanjutnya nilai titar dibandingkan dengan titar blanko = Y ml.
( Y – Z ) x titar x 0,014 x 6.25 x 100%
Z
6) Analisis Serapan N pada Anak Ayam
Analisis serapan N pada anak ayam dilakukan dengan metode makro- kjeldahl (Sudarmadji et al. 1984). Sebelumnya ayam dipuasakan selama 12 jam.
Pakan yang akan diberikan ditimbang dahulu. Pakan ini diberikan untuk konsumsi selama 24 jam. Selama 24 jam tersebut fesesnya ditampung, kemudian ditimbang. Dilakukan pengeringan dengan oven, kemudian digerus.
Jumlah N yang terdapat dalam feses tersebut dianalisis seperti cara di atas.
%N Pakan - % N Feses x 100%
% N Pakan
7) Analisis Kadar Lemak pada Bubuk Teripang
Analisis kadar lemak dilakukan dengan metode yang dilaporkan oleh Sudarmadji et al. (1984). Labu penyari dengan beberapa butir batu didih di dalamnya, dikeringkan dalam alat pengering pada suhu 105-110ºC selama 1 jam. Selanjutnya labu penyari didinginkan dalam eksikator, kemudian ditimbang
= a gram. Ditimbang sebanyak 5 gram contoh = X gram (banyak sedikitnya contoh yang ditimbang tergantung pada kadar lemak bahannya) lalu dimasukkan
Kadar N =
Serapan N =
ke dalam selongsong penyari (dapat juga digunakan kertas saring yang dibuat seperti kantong yang ditutup dengan kapas yang tidak berlemak).
Selongsong penyari dimasukkan ke dalam alat soxhlet dan diekstrak dengan eter minyak tanah, etil eter atau kloroform di atas penangas air (water bath). Setelah ekstraksi selesai (24-48 jam sampai eter minyak tanah di dalam soxhlet jernih) labu penyari dibuka dan dikeringkan untuk menghilangkan eter minyak tanah secepat mungkin. Kemudian labu penyari dikeringkan dalam alat pengering pada suhu 105-1100C selama 1 jam.
Selanjutnya labu penyari didinginkan dalam eksikator dan ditimbang.
Pekerjaan mengeringkan dan menimbang diulangi, hingga tercapai bobot yang tetap (b gram).
b - a X
8) Karakterisasi Senyawa Steroid dari Ekstrak Teripang
Karakteristik ekstrak steroid dari teripang yang diamati adalah warna, derajat keasaman (pH), kelarutan, stabilitas, antibakteri dan antifungi. Warna ekstrak diamati secara visual dan pH diukur dengan menggunakan pH-meter.
Kelarutan ekstrak steroid diamati dengan menggunakan pelarut aseton, etil asetat, kloroform, metanol dan air.
Pengujian stabilitas ekstrak steroid dari teripang dilakukan berdasarkan aktivitas antibakterinya setelah penyimpanan selama 10 bulan pada temperatur + 10oC. Pengujian aktivitas antibakteri dan antifungi dijelaskan seperti di bawah ini sebagaimana metode yang digunakan oleh Institute of Marine Biotechnology, Greifswald-Jerman.
a. Antibakteri
Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar (agar diffusion assay). Biakan bakteri uji diambil sebanyak dua ose kemudian
disuspensikan pada larutan buffer sebanyak 2 ml. Sebanyak 200 µl dari suspensi bakteri uji tersebut dimasukkan ke dalam 20 ml media agar yang masih cair lalu digoyang secara perlahan agar homogen. Selanjutnya media agar tersebut dituangkan ke dalam cawan petri yang steril dan dibiarkan pada suhu kamar dalam keadaan aseptik sampai media agar membeku. Setelah agar membeku, diletakkan di atasnya paper disc yang telah ditetesi ekstrak steroid. Paper disc yang digunakan berdiameter 6 mm.
Perhitungan kadar lemak = x 100%
b. Antifungi (antikapang)
Fungus (kapang) yang digunakan dalam uji aktivitas antikapang adalah Candida maltosa. Pengujian aktivitas antikapang dilakukan sebagaimana pengujian aktivitas antibakteri, hanya saja inkubasi dilakukan pada posisi tidak terbalik.
9) Uji Aktivitas Biologis/Bioassay pada Anak Ayam Jantan (Alwir 2001) Sebelum perlakuan, anak ayam jantan divaksinasi ND (New Castle Disease) secara tetes hidung dan ditimbang bobot badannya kemudian diukur panjang, lebar dan tinggi jengger. Anak ayam jantan diletakkan dalam kandang percobaan yang dilengkapi dengan lampu listrik 25 watt. Sebelum perlakuan, anak ayam jantan dibiarkan beradaptasi di dalam kandang selama seminggu.
Dalam setiap kandang terdapat enam ekor anak ayam jantan yang masing- masing mendapat perlakuan yang sama.
Pemberian perlakuan ekstrak steroid dan kontrol pada anak ayam jantan dilakukan secara oral setiap hari selama 18 hari pengamatan dimulai dari umur 10 hingga 27 hari. Selama beradaptasi dan pemberian pakan, masing-masing anak ayam diberi ransum yang sama dan air minum secara ad libitum (tidak terbatas). Pemberian ransum bebas sterol dan air minum ini dilakukan dengan cara menaruhnya dalam tempat-tempat yang diikatkan dalam kandang.
Setiap hari anak ayam jantan ditimbang bobot badannya dan tiap dua hari sekali diukur panjang, lebar dan tinggi jenggernya. Proses pengukuran jengger hewan percobaan dapat dilihat pada Lampiran 1.
Pada hari ke-28 hingga ke-30 dilakukan pengamatan serapan N, dimana dua ekor anak ayam dari masing-masing perlakuan ditempatkan secara terpisah pada kandang yang dilengkapi dengan alas untuk menampung feses anak ayam tersebut. Pada hari ke-31, anak ayam disembelih dan diambil darahnya dari leher. Selanjutnya anak ayam dibedah dan diambil jengger, hati, limpa, bursa fabrisius dan testisnya, kemudian ditimbang. Serum darah dipersiapkan untuk pengukuran kadar kolesterol dan testosteron. Secara garis besar, kerangka kerja penelitian yang dilakukan diperlihatkan pada Gambar 6 berikut ini.
Pemisahan Bagian- bagian Teripang
Daging Jeroan
Homogenisasi
Ekstraksi I ( suhu 4oC, 24jam)
Sentrifugasi
(5.000 rpm, suhu 4oC, 15 menit)
Supernatan (Diuapkan) Presipitat
Ekstraksi II (suhu 4oC, 24 jam)
Rafinat (Fase atas)
Filtrasi membran NF (1000 Da)
Bioassay TLC/HPLC
Ekstrak (Fase bawah) Aseton
Kloroform, etil asetat, air
(1:1:1)
Teripang
D. Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian yang digunakan pada tahap bioassay adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan enam perlakuan dan enam ulangan, dimana hewan uji yang digunakan adalah 36 ekor anak ayam jantan yang dianggap homogen. Model matematis rancangan percobaan tersebut adalah seperti di bawah ini (Steel dan Torrie 1995).
Yij = µ + Pi + εij
Keterangan:
Yij = Nilai pengamatan (respon) dari faktor perlakuan ke-i dan ulangan ke-j µ = Nilai rata-rata yang sesungguhnya
Pi = Pengaruh perlakuan ke-i
εij = Pengaruh galat pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j
Percobaan dirancang untuk mendapatkan data pengaruh senyawa steroid teripang terhadap bobot badan, serapan N, bobot testis, limpa, hati, kadar kolesterol dan trigliserida darah anak ayam jantan. Perlakuan yang dicobakan dijelaskan seperti di bawah ini (Modifikasi dari Alwir 2001).
1. Pemberian ransum basal tanpa senyawa steroid dan dicekok 0,5 ml minyak jagung sebagai kontrol negatif setiap hari sekali
2. Pemberian ransum basal dan dicekok 0,5 ml senyawa steroid teripang kering (ekstrak kasar) yang konsentrasinya 0,4 g/ml setiap hari sekali
3. Pemberian ransum basal dan dicekok 0,5 ml senyawa steroid teripang basah (ekstrak kasar) yang konsentrasinya 0,4 g/ml setiap hari sekali
4. Pemberian ransum basal dan dicekok 0,5 ml metil testosteron (Argent Laboratories Inc.) dengan konsentrasi 0,4 mg/ml setiap hari sekali sebagai kontrol positif (a)
5. Pemberian ransum basal dan dicekok 0,5 ml aprodisiaka komersial (Levitra) dengan konsentrasi 0,4 mg/ml setiap hari sekali sebagai kontrol positif (b) 6. Pemberian ransum basal dan dicekok 0,5 ml tepung teripang kering yang
konsentrasinya 1 g/ml setiap hari sekali.
Data yang diperoleh dianalisis dengan ANOVA (analysis of variance).
Jika terdapat perbedaan yang nyata dilanjutkan dengan uji beda nyata terkecil, yaitu untuk mengetahui perbedaan masing-masing perlakuan.
