1 DESKRIPSI PATEN
PROSES PEMURNIAN SOYBEAN MOSAIC VIRUS Bidang Teknik Invensi
5
Invensi ini berhubungan dengan suatu proses pemurnian Soybean mosaic virus(SMV).Lebihkhusus,invensi ini menggunakan isolat Yogyakarta dari bahan perbanyakan pada tanaman kedelai varietas Wilis dengan pembekuan jaringan sebelum homogenisasi,konsentrasi Polyethylene glycol (PEG) 6000 untuk 10
presipitasi dan penambahan senyawa aditif pada bufer untuk resuspensi serta sentrifugasi diferensial dilakukan dua kali sebelum ke tahap sentrifugasi dalam gradien sukrosa untuk pengambilan zona virus tersebut.
15
Latar Belakang Invensi
Salah satu penyakit mosaik pada kedelai disebabkan oleh SMV. Penyakit ini dijumpai di semua daerah penghasil kedelai dan merupakan penyakit penting karena dapat menurunkan produksi antara 40-60%. Penyebab penyakit termasuk anggota 20
kelompok Potyvirus. Deteksi dini pada benih kedelai merupakan langkah awal untuk mengelola penyakit karena SMV. Kebutuhan sediaan SMV murni dengan infektifitas yang tinggi diperlukan untuk pembuatan antiserum SMV.Antiserum ini dapat diperoleh di pasaran,namun dengan harga yang sangat tinggi karena harus 25
impor.Sedangkan kendala proses pemurnian SMV sering mengalami kegagalan.Agregasi partikel SMV yang berbentuk batang lentur (flexous) sering menyebabkan virion hilang pada proses homogenisasi dan presipitasi serta sentrifugasi diferensial.
Proses untuk mengisolasi dan pemurnian SMV isolat 30
Yogyakarta pada invensi ini merupakan perbaikan dari metode yang telah ada dalam Ross(Phytopathology 57:465-467(1967);
2 Iwai dan Wakimoto(Reprinted from Ann Phytopath Society of Japan 51(4):465-474(1985). Invensi ini merupakan proses pemurnian untuk menghindari agregasi partikel SMV. Oleh karena berdasarkan pengukuran tingkat kemurnian virus dengan 5
spektrofotometer dan elektroforesis protein dengan Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) dari metode yang telah ada tidak diperoleh partikel SMV isolat Yogyakarta. Metode Iwai dan Wakimoto menyebutkan isolasi bercak tunggal menggunakan Phaseolus vulgaris atau 10
French bean culivar Pinto 111 dan sentrifugasi diferensial dengan kecepatan tinggi menggunakan pelet hasil sentrifugasi kecepatan rendah(8.500 x g selama 10 menit) serta zona virus tidak direkomendasikan waktu inkubasi untuk dialisis sebelum sentrifugasi kecepatan tinggi. Meskipun berdasarkan Nisbah 15
A 280/A 260 antara 0,66 sampai 0,80 dengan rata-rata 0.76 dan 1,07 dan A maks/A min antara 1,071-1,21 dengan rata-rata 1,10 serta nilai koefisien ekstinsi pada 260 nm untuk 1 ng/ml = 2,4 memperoleh hasil pemurnian sekitar 4.0 mg per 1kg daun terinfeksi SMV.
20
Stephen A. Johnson dan rekan memperoleh hak paten bernomer US 5532142A pada tanggal 2 Juli 1996 dengan judul Method of isolation and purification of fusion polypeptides.
Metode ini diaplikasikan untuk pemurnian Tobaccoetc Virus.
Paten ini mengklaim proses isolasi dengan transformasi sel 25
inang. Transformasi ini dilakukan dengan vektor bakteri genus Escherichia, Klebsiella, Erwinia, Salmonella, Serratia.
Stephen J.Garger dan rekan memperoleh hak paten bernomor US 6033895 pada tanggal 7 Maret 2000 dengan judul:Process for isolating and purifying viruses,soluble protein and peptides 30
from plant viruses.Metode ini diaplikasikan untuk Tobacco mosaic virus (TMV). Paten ini mengklaim bahwa supernatan dari
3 proses homogenisasi memerlukan pemanasan pada temperatur 45- 50 oC selama 1 menit. Selanjutnya supernatan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan tinggi untuk mempertahankan komponen virus. Presipitasi PEG dilakukan pada supernatan 5
hasil sentrifugasi ke dua dengan kecepatan tinggi. Paten ini tidak diklaim konsentrasi PEG untuk mengendapkan virus dan kecepatan tinggi pada sentrifugasi yang digunakan.
Stephen J.Garger dan rekan memperoleh hak paten bernomor US Patent 6,303,779 BI pada tanggal 16 Oktober 2001 dengan 10
judul: Process for isolating and purifying viruses and sugars from plant sources. Metode ini diaplikasikan untuk pemurnian Tobacco mosaic virus (TMV) dari bahan tiga varietas tembakau (Ky 8959, Tn 86 and MD609) dan Nicotiana benthamiana yang terinfeksi virus tersebut. Paten ini mengklaim bahwa metode 15
ini dapat digunakan antara lain untuk kelompok Potyvirus dan menghasilkan TMV murni 0,859 mg tiap 150 gram pada proses homogenisasi dengan pH 4,2 dari jaringan tanaman yang terinfeksi virus tersebut.Paten ini tidak diklaim konsentrasi PEG yang digunakan untuk menghindari agregasi partikel virus 20
dari kelompok potyvirus,terutama untuk partikel SMV yang berbentuk flexous dan penggunaan bantalan (cushion) sukrosa untuk sentrifugasi terakhir dan pengambilan zona virusnya.
Stephen J.Garger dan rekan memperoleh hak paten bernomor EP 1561758B1 pada tanggal 29 November 2006 dengan judul:
25
Method for isolating and purifying viruses from plant sources.Metode ini diaplikasikan untuk pemurnian Cryptovirus, Reovirus, Caulimovirus, Geminivirus, Commelina Yellow Mottle Virus. Paten ini mengklaim ultrafiltrasi dilakukan sebelum pemberian PEG dan sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan 30
tinggi. Paten tidak diklaim konsentrasi PEG untuk menghindari agregasi partikel virus.
4 Stephen J.Garger dan rekan memperoleh hak paten bernomor US 20060288449 A1 pada tanggal 21 Desember 2006 dengan judul:
Process for purifying target compounds from plant sources using ceramic filtration”. Paten ini mengklaim metode isolasi 5
protein tanaman dari ekstrak tanaman yang terinfeksi Tobacco
mosaic virus dengan filtrasi keramik berdiameter paling kecil 0,1 mikron.
Selanjutnya invensi yang diajukan ini dimaksudkan untuk mengatasi permasalahan agregasi partikel virus. Isolasi 10
bercak tunggal(single lesion)menggunakan tanaman Chenopodium amaranticolor dan propagasi pada tanaman kedelai. Pembekuan jaringan tanaman sebelum homogenisasi digunakan untuk merusak protein tanaman inang tanpa merusak partikel virus, pemilihan konsentrasi PEG 6000 untuk presipitasi partikel virus, 15
penambahan senyawa aditif di dalam bufer fosfat untuk resuspensi,sentrifugasi diferensial, waktu inkubasi untuk dialisis. Selain itu uji infektifitas relatif pada tanaman indikator(Phaseolus vulgaris) digunakan untuk mengevaluasi proses presipitasi partikel virus dalam sap dan pemilihan 20
bahan aditif untuk resuspensi.
Ringkasan Invensi
Sesuai invensi ini disediakan suatu komposisi bahan untuk isolasi dan pemurnian SMV, proses perolehan virus murni 25
dan sediaan atau produk virus murni dengan infektifitas yang tinggi. Komposisi bahan sesuai invensi ini terdiri atas biji kedelai yang terinfeksi SMV dan tanaman Chenopodium amaranticolor untuk isolasi bercak tunggal serta daun kedelai varietas Wilis yang terinfeksi SMV hasil dari perbanyakan.
30
Proses pemurnian sesuai invensi ini terdiri atas:homogenisasi dan klarifikasi sampai diperoleh supernatan dengan
5 infektifitas tinggi;penambahan senyawa aditif di dalam bufer fosfat sampai diperoleh supernatan dengan infektifitas tinggi;sentrifugasi diferensial;sentrifugasi dalam gradien sukrosa;pengambilan zona virus;dialisis untuk mendapatkan 5
pelet yang akan diresuspensi dengan bufer sebagai sediaan SMV murni.Produk sediaan SMV murni dengan infektifitas tinggi yang dihasilkan sebesar 3,0607 mg sampai 3,8913 mg tiap 1 kg daun kedelai yang terinfeksi SMV dan partikel virus berbentuk batang lentur(Flexous)dengan ukuran 670-720 nm serta berat 10
molekul selubung protein 29,71 kD. Proses isolasi dan pemurnian memerlukan waktu selama 13 jam sampai 20 jam.
Uraian Singkat Gambar
Gambar 1 adalah flow chart pemurnian Soybean mosaic 15
virus(SMV).
Uraian Lengkap Invensi
Bahan isolasi dan pemurnian SMV terdiri atas: virus diisolasi dari biji kedelai terinfeksi SMV. Penggunaan biji 20
ini dimaksudkan karena SMV terbawa benih. Biji kedelai ditanam sebagai bahan untuk isolasi dengan metode lesio tunggal(single lesion method) pada tanaman C. amaranticolor.
Tanaman ini dipilih karena kandungan senyawa penghambat yang rendah untuk menghindari inaktivasi dalam proses pemurnian.
25
Isolasi lesio tunggal dilakukan 3 kali,kemudian diperbanyak pada kedelai varietas Wilis.Varietas ini digunakan karena rentan terhadap SMV.
Gambar 1 daun bergejala mosaik dikumpulkan dan disimpan selama 6 jam pada -70oC sebagai bahan pemurnian. Pembekuan 30
jaringan tanaman sebelum homogenisasi dapat merusak protein tanaman inang tanpa merusak partikel virus. Proses pemurnian
6 SMV diawali untuk membatasi terjadinya proses oksidasi dan hilang serta rusaknya partikel virus sesuai dengan invensi ini.Pemurnian SMV seperti invensi yang diusulkan adalah mengkondisikan partikel virus yang berbentuk batang lentur 5
(flexous) untuk dihilangkan komponen inang dan mempertahankan komponen virus semaksimal mungkin.
Penggunaan bufer ekstraksi 0,3 M Na-fosfat pH 7,0 yang menggandung bahan Na-DIECA(Sodium diethyldithiocarmate)dan kloroform serta butanol pada proses ekstraksi untuk 10
memisahkan ribosom dan poliribosom serta protein dari virus.
Sedangkan kloroform dan butanol mempunyai kemampuan untuk mendenaturasi protein dan lemak di dalam mitokondria, kloroplas dan retikulum endoplasmik (1). Kebanyakan protein tanaman tidak dapat mengendap pada sentrifugasi kecepatan 15
tinggi dan masih terdapat di dalam fraksi supernatan. Oleh karena itu digunakan sentrifugasi kecepatan rendah(8500 x g selama 10 menit)(1,2). Agregasi partikel virus dapat dihindari dengan konsentrasi PEG (Poly Ethylene glikol) 6000 yang tepat untuk pemekatan dengan 0,1 M NaCl pada presipitasi 20
partikel virus dalam sap saat pemadatan (2,3). Uji konsentrasi PEG 6000 untuk presipitasi partikel SMV dalam fase cair dari tahap klarifikasi disajikan dalam Tabel 1.
Tabel 1. Konsentrasi PEG 6000 untuk presipitasi SMV 25
Konsentrasi PEG
Infektifitas Persen
4% 7 100
6% 11 157,1
8% 7 100
PEG mempunyai sifat anhydrous dan mampu menyerap air serta mengendapkan partikel virus dengan dehidrasi partikel virus. Pelet yang dihasilkan diuji dengan bioessei.
7 Infektifitas SMV dengan bioessei sesuai dengan Tabel 1 diperoleh pada tahap presipitasi dengan PEG konsentrasi final 6 %. Konsentrasi PEG 4 % dan 8 % mempunyai infektifitas lebih rendah.
5
Pemilihan senyawa aditif ditambahkan pada bufer natrium fosfat untuk resuspensi fase pelet. Senyawa aditif ini digunakan untuk memisahkan ribosom, poliribosom dan protein tumbuhan dari virus serta memperoleh virus dengan infektifitas tinggi (3,4). Hasil uji senyawa aditif dengan 10
komposisi seperti diterangkan di atas ditampilkan uji infektifitasnya pada Tabel 2.
Tabel 2. Senyawa aditif untuk resuspensi fase virus
Suplemen Infektifitas Persen
Mg Cl2 (0,01 M) 21 105
Na-EDTA 0,005 M 28 140
15
Penggunaan Na-EDTA 0,005 M mempunyai kemampuan mencegah agregasi partikel virus dengan mengkelat kation bivalen dan mencegah oksidasi polifenol. Supernatan disentrifugasi dengan kecepatan 78.000 x g selama 90 menit atau ultrasentrifugasi. Hal ini dilakukan untuk menentukan berat 20
molekul polimer dari protein.Selanjutnya dilakukan sentrifugasi diferensial dua kali (4,5). Ultrasentrifugasi preparatif digunakan untuk memisahkan dan mengkonsentrasikan virus.Besarnya kecepatan diketahui dari putaran per menit (rpm). Kecepatan sedimentasi akan meningkat jika:a)perputaran 25
rotor tiap menitnya makin bertambah;b)jarak tabung terhadap poros rotasi makin besar;c)ukuran partikel makin bertambah;d)kerapatan partikel virus makin tinggi;e)suhu larutan di dalam tabung makin tinggi;f) kepekatan berkurang;g)kerapatan zat pelarut makin rendah. Infektifitas 30
8 virus ini mempunyai perbedaan,jika sentrifugasi dilakukan satu kali seperti ditampilkan dalam Tabel 3.
Tabel 3. Penambahan suplemen di dalam bufer Na-fosfat 0,05 M 5
dengan pH 7,0 pada sentrifugasi diferensial
Suplemen Infektifitas
Ultrasentrifugasi I Ultrasentrifugasi II
MgCl2 (0,01 M) 23 21
Na-EDTA (0,005 M) 22 28
Uji metode sentrifugasi diferensial dengan ultrasentrifugasi menunjukkan infektifitas virus tertinggi pada hasil sentrifugasi diferensial kedua dengan penambahan 10
suplemen 0,005 M Na-EDTA di dalam bufer Na-fosfat 0,05 M pH 7,0 dari bahan supernatan untuk sentrifugasi diferensial pertama. Pelet hasil sentrifugasi diferensial diresuspensi kembali dengan bufer Na-fosfat yang mengandung 0,005 M Na- EDTA, diaduk selama 30 menit,kemudian disentrifugasi pada 15
8500 x g selama 10 menit (5,6).
Supernatan dituangkan di atas larutan sukrosa dengan konsentrasi yang makin besar ke arah ujung tabung (20%, 30%, 40%, dan 50%) dan disentrifugasi pada kecepatan 47.000 x g selama 3 jam (6,7). Partikel virus di lapisan atas gerakannya 20
akan cepat mengendap bersamaan waktunya dengan yang berada pada lapisan bawah yang gerakannya lambat pada tabung tersebut. Sukrosa dihilangkan dengan pengambilan zona virus dengan pipet dan diencerkan dengan 0,05 M bufer borat dengan volume 10 kali dari volume zona virus serta disimpan selama 25
6 jam di dalam suhu 4 oC. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan tinggi pada 78.0000 x g selama 90 menit (7,8).Pelet diresuspensi dengan bufer borat (8,9) sebagai sediaan virus murni dan disimpan pada -20 oC.
9 Hasil penelitian menunjukkan kurve absorbsi ultraviolet dari sediaan SMV murni dengan Spektrofotometer DU-65.
Kurve menunjukkan absorbsi maksimum pada 260 nm dan minimum pada 248 nm.Nisbah A280/A260 berkisar antara 0,691 sampai 0,780 5
dengan rata-rata 0,734, dan A maks/A min berkisar antara 1,071- 1,199 dengan rata-rata 1,175.Kurve ini mencirikan partikel virus berbentuk batang lentur(flexous). Nilai koefisien ekstensi pada 260 nm untuk 1 ng/ml=2,4 maka hasil pemurnian diperoleh 3,0607 sampai 3,8913 tiap 1 kg daun kedelai yang 10
terinfeksi SMV.
Selubung protein (coat protein) menunjukkan satu jenis protein dengan berat molekul 29,7 kD dengan elektroforesis protein SDS-PAGE dan marker dari BIORAD sebagai kontrol yang terdiri atas Bovine serum albumin 66 kD, Carbonic anhydrase 15
29 kD, Cytochrome C 12,4 kD dan Aprotimin 6,5 kD. Partikel SMV hasil pemurnian dengan mikroskop elektron (JEOL JEM 1400) mempunyai bentuk batang lentur dan berukuran 670-720 nm.
Dari uraian di atas jelas bahwa hasil dari invensi ini dapat memberi manfaat bagi peneliti dan industri perbenihan 20
kedelai sebagai penyedia virus murni untuk pembuatan antiserum SMV. Hal ini karena secara praktis dan efisien proses pemurnian SMV dari isolat Yogyakarta mampu meminimalisir kehilangan virion akibat terjadinya agregasi partikel virus dan mempunyai infektifitas serta hasil yang 25
tinggi dalam waktu 13 sampai 20 jam. Invensi ini benar-benar menyajikan suatu penyempurnaan yang sangat praktis khususnya pada proses pemurnian SMV.
30
10 Klaim
1.Proses pemurnian SMV dengan langkah-langkah sebagai berikut:
5
a. Propagasi SMV
b. Pembekuan daun dan homogenisasi c. Sentrifugasi
d. Presipitasi dan sentrifugasi e. Resuspensi dan sentrifugasi 10
f. Sentrifugasi diferensial g. Resuspensi dan sentrifugasi h. Sentrifugasi
i. Dialisis dan sentrifugasi j. Resuspensi
15
2.Proses pemurnian SMV seperti klaim 1 dengan propagasi SMV dilakukan secara mekanik pada daun kedelai varietas Wilis.
3.Proses pemurnian SMV seperti klaim 1 dengan pembekuan daun kedelai dilakukan pada −70 oC dan homogenisasi dengan penggerusan untuk diambil supernatannya.
20
4.Proses pemurnian SMV seperti klaim 1 dengan sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 8500 x g selama 10 menit untuk diambil supernatannya.
5.Proses pemurnian SMV seperti klaim 1 dengan presipitasi menggunakan PEG 6000 dan sentrifugasi dilakukan pada 25
kecepatan 8500 x g selama 10 menit untuk diambil peletnya.
6.Proses pemurnian SMV seperti klaim 1 dengan resuspensi menggunakan pelet di dalam bufer fosfat 0,05 M pH 7,0 yang mengandung Na-EDTA dan diaduk selama 30 menit serta disentrifugasi pada kecepatan 8500 x g selama 10 menit 30
untuk diambil supernatannya.
11 7.Proses pemurnian SMV seperti klaim 1 dengan sentrifugasi
diferensial dilakukan dua kali pada kecepatan 78.000 x g selama 90 menit.Sentrifugasi pertama dilakukan pengambilan supernatannya. Sentrifugasi kedua diambil peletnya.
5
8.Proses pemurnian SMV seperti klaim 1 dengan sentrifugasi di dalam gradien sukrosa menggunakan konsentrasi makin besar ke arah ujung tabung(20%, 30%, 40%, 50%)dan dilakukan pada kecepatan 47.000 x g selama 3 jam untuk diambil zona virusnya.
10
9.Proses pemurnian SMV seperti klaim 1 dengan dialisis di dalam bufer pH 8,0 selama 6 jam pada suhu 4 oC dan disentrifugasi pada kecepatan 78.000 x g selama 90 menit untuk diambil peletnya.
10.Proses pemurnian SMV seperti klaim 1 dengan resuspensi di 15
dalam bufer borat untuk diambil sediaan virusnya dan disimpan pada −20 oC.
20
25
12 Abstrak
PROSES PEMURNIAN SOYBEAN MOSAIC VIRUS
Deteksi dini pada benih kedelai merupakan langkah awal 5
untuk mengelola SMV.Kebutuhan sediaan SMV murni dengan infektifitas yang tinggi diperlukan untuk pembuatan antiserum.Kendala utama proses pemurnian SMV sering mengalami kegagalan karena hilangnya virion pada proses homogenisasi dan presipitasi serta sentrifugasi diferensial. Invensi ini 10
dimaksudkan untuk mengatasi permasalahan agregasi partikel virus.Tanaman Chenopodium amaranticolor digunakan untuk isolasi becak tunggal dan propagasi pada tanaman kedelai.
Invensi ini dimaksudkan untuk mengatasi permasalahan agregasi partikel virus. Pembekuan jaringan tanaman sebelum 15
homogenisasi digunakan untuk merusak protein tanaman inang tanpa merusak partikel virus, pemilihan PEG 6000 dengan konsentrasi 6 % untuk presipitasi partikel virus, penambahan senyawa aditif pada bufer fosfat untuk resuspensi, sentrifugasi diferensial dan waktu dialisis selama 6 jam 20
pada suhu 4 oC. Selain itu uji bioessei menggunakan tanaman indikator (Phaseolus vulgaris)untuk mengevaluasi infektifitas relatif pada proses presipitasi partikel virus dalam sap dan pemilihan bahan aditif (Na-EDTA) untuk resuspensi.Produk sediaan SMV murni dengan infektifitas tinggi yang dihasilkan 25
sebesar 3,0607 mg sampai 3,8913 mg tiap 1 kg daun kedelai yang terinfeksi SMV dan partikel virus berbentuk batang lentur(Flexous)dengan ukuran 670-720 nm serta mempunyai berat molekul selubung protein berukuran 29,71 kD. Proses isolasi dan pemurnian memerlukan waktu selama 13 jam sampai 20 jam.
30
