BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian non eksperimental dan eskperimental, dengan menggunakan rancangan penelitian pre test post test control group design. Penelitian non eksperimental meliputi determinasi tanaman pegagan, ekstraksi, uji kualitatif flavonoid dan triterpenoid pegagan, uji kuantitatif flavonoid tanaman pegagan, dan pembuatan sediaan krim. Penelitian eksperimental meliputi uji aktivitas anti aging. Rancangan penelitian dapat digambarkan sebagai berikut:
Gambar 3.1. Bagan rancangan penelitian pre test post test control group design. Hewan uji sejumlah 30 ekor mencit jantan balb/c yang memenuhi kriteria inklusi dikelompokkan secara acak menjadi 5 kelompok. Selanjutnya dilakukan pengukuran parameter anti aging sebelum perlakuan. Proses perlakuan selama 4 minggu. Setelah proses perlakuan, kembali dilakukan pengukuran parameter anti aging.
1. Variabel bebas : Konsentrasi THC dan ekstrak pegagan
2. Variabel tergantung : Sensitivitas kulit, kadar air, kadar kolagen, elastisitas dan besar pori-pori
3. Variabel terkendali : Galur mencit, umur mencit, berat badan mencit, jenis kelamin mencit, luas punggung mencit yang diolesi THC, ekstrak pegagan, dan kombinasi THC-ekstrak pegagan, nutrisi, kandang, jumlah bahan yang dioleskan, dosis penyinaran UVA dan UVB, durasi penyinaran UVA dan UVB
C. Definisi Variabel Operasional 1. Variabel bebas
Tetrahydrocurcumin (THC) diperoleh dari RONGSHENG®. Pegagan segar diambil dari daerah Sumbang, Banyumas. Ekstrak pegagan diperoleh dari remaserasi serbuk herba pegagan kering dengan menggunakan pelarut etanol 70%.
2. Variabel tergantung
1. Sensitivitas adalah jumlah dan luas area kulit hewan uji yang mengalami eritema sebelum dan sesudah perlakuan yang diukur dengan
Skin Analyzer EH 900 U.
2. Kadar air (moisture) adalah persentase jumlah air pada kulit hewan uji sebelum dan sesudah perlakuan yang diukur dengan Skin Analyzer EH 900 U.
3. Kadar kolagen adalah prosentase jumlah kolagen kulit hewan uji sebelum dan sesudah perlakuan yang diukur dengan Skin Analyzer EH 900 U.
4. Elastisitas kulit adalah kekenyalan kulit hewan uji sebelum dan sesudah perlakuan yang diukur dengan Skin Analyzer EH 900 U.
5. Besar pori adalah besarnya pori kulit hewan uji sebelum dan sesudah perlakuan yang diukur dengan Skin Analyzer EH 900 U.
Mencit yang digunakan adalah mencit galur balb/c, berjenis kelamin jantan berumur 6-8 minggu dengan berat 20-25 gram. Luas area punggung mencit yang diolesi bahan adalah 2x2 cm2. Nutrisi untuk mencit berupa konsentrat makanan ayam 30%, jagung giling 40%, dan dedak 30%, diberikan secara ad libitum 12-25 gram/ekor/hari. Kandang mencit berupa kandang pemeliharaan berupa kotak plastik ukuran 25x20x10 cm dengan tutup kawat strimin pada bagian atas, diletakkan pada ruangan yang cukup ventilasi dan pencahayaan. Tiap kelompok perlakuan ditempatkan dalam satu kandang atau 1 kandang berisi 6 ekor mencit. Jumlah bahan yang dioleskan adalah 2 mg/cm2 per hari yang terbagi menjadi 2 kali/hari. Dosis sinar UVA 630 µW/cm2 dan UVB 105 µW /cm2. Durasi penyinaran UVA dan UVB 10 menit setiap hari selama 4 minggu. Penyinaran UVA dan UVB menggunakan lampu Repti Glo 13 W dari Exoterra®.
D. Waktu dan Tempat Penelitian
Waktu penelitian dilakukan dari bulan Oktober 2016 – Juni 2017. Tempat penelitian dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan dan Laboratorium Biologi, Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto. Laboratorium Biologi Farmasi, Laboratorium Teknologi Farmasi, dan Laboratorium Farmakologi Universitas Muhammadiyah Purwokerto.
E. Sampel Penelitian 1. Kriteria inklusi
Kriteria inklusi untuk sampel adalah mencit jantan sehat, galur balb/c, umur 6-8 minggu, berat badan 20-25 gram, terlihat aktif.
2. Kriteria dropout
Mencit mati saat penelitian berlangsung. 3. Besar sampel
Dalam penelitian ini masing-masing perlakuan PN, PP, P1, P2, dan P3 direplikasi sebanyak 6 kali, sehingga jumlah mencit yang digunakan adalah 30 ekor. Jumlah mencit yang digunakan tidak menggunakan rumus Federer (1977) dan jumlah 30 ekor.
Pada penelitian ini digunakan herba pegagan yang diperoleh dari daerah
Sumbang, Banyumas, Tetrahydrocurcumin (Rongsheng®), quersetin (PT Brataco, Indonesia), HCl pekat, Mg, etanol 96%, AlCl3, metanol, Ethyl
Ascorbyl Ether (PT. Brataco, Indonesia), Natrium benzoat, asam stearat, trietanolamin, gliserin ( PT. Brataco, Indonesia).
2. Alat penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: a. Alat untuk pembuatan simplisia
Lemari pengering, nampan untuk wadah herba. b. Alat untuk pembuatan serbuk simplisia
Grinder, ayakan. c. Alat untuk remaserasi
Alat gelas (Iwaki-pyrex), timbangan analitik, bejana maserasi, cawan porselen, kertas saring, rotary evaporator, waterbath.
d. Alat untuk penetapan kadar flavonoid esktrak pegagan
Alat gelas (Iwaki-pyrex), timbangan analitik, spektrofotometer UV-Vis
( Shimadzu).
e. Alat untuk pembuatan basis krim
Alat gelas (Iwaki – pyrex), timbangan analitik, cawan porselen, waterbath, mortir, stamper, sudip, pot salep.
f. Alat untuk uji anti aging
Lampu UVA dan UVB Repti Glo 13 W dari Exoterra®, kandang mencit, holder, kerokan bulu, Skin Analyzer EH 900 U, dan seperangkat komputer.
G. Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman pegagan
Herba pegagan yang telah disortasi basah dan ditiriskan, kemudian dikeringkan dalam oven suhu 40-500 C, selama 72 jam (Darwati dan Makmun, 2012).
3. Penyerbukan herba pegagan kering
Herba pegagan kering diserbuk dengan grinder, kemudian diayak dengan ayakan ukuran 80 mesh (Sapri et al., 2014).
4. Ekstraksi herba pegagan
Metode ekstraksi yang digunakan adalah remaserasi dengan pelarut etanol 70% yang mengacu pada metode remaserasi yang dilakukan oleh Pratiwi (2010) dengan modifikasi. Remaserasi herba pegagan dengan pelarut etanol 70% dilakukan dengan cara sebanyak 200 gram serbuk herba pegagan kering dimasukkan ke dalam bejana maserasi, kemudian dituangi penyari etanol 70% 2000 ml. Diaduk selama 4-5 jam pertama, lalu direndam hingga 24 jam. Kemudian dilakukan pengadukan kembali selama 4-5 jam dan diamkan lagi hingga 48 jam. Lakukan kembali pengadukan setiap hari selama 4-5 jam kemudian diamkan lagi hingga 24 jam hingga 5 hari. Selanjutnya maserat disaring dengan kain katun. Filtrat dimaserasi kembali dengan 1000 ml etanol 70% selama 3 hari. Maserat disaring dengan kain katun, lalu ditambahkan dengan maserat sebelumnya, selanjutnya diuapkan dengan rotay evaporator suhu 50-600 C kecepatan 100 rpm, dan dipekatkan dengan waterbath suhu 40-500 C hingga diperoleh ekstrak kental.
5. Uji total flavonoid ekstrak pegagan a. Uji kualitatif flavonoid
Ekstrak pegagan sebanyak 1 gram ditambahkan etanol 95%, lalu dipanaskan. Lapisan atas dipipet dan ditambahkan dengan HCL pekat 2 N dan serbuk mg. Adanya flavonoid ditandai dengan munculnya warna merah (Lumbessy et al., 2013).
b. Uji kuantitatif flavonoid
1) Pembuatan kurva baku kuersetin
kemudian ditambahkan etanol 80% hingga 10 ml (B). Selanjutnya dari larutan B diambil
0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45 ml dan masing – masing larutan tersebut ditambah dengan 1 ml AlCl3 2% dan aquabidest hingga 5 ml. Setelah diinkubasi 30 menit pada suhu 250 C, serapannya diukur pada λ 400-800 nm, menggunakan spektrofotometer UV Vis. Kemudian dilihat lamda maksimum hasil spektrofotometri dan dibuat kurva kalibrasi dengan menghubungkan sumbu X sebagai nilai konsentrasi larutan standar dan sumbu Y sebagai nilai serapan (Azizah et al., 2014).
2) Pembuatan larutan uji ekstrak pegagan
Ektrak etanol pegagan ditimbang 10 mg, kemudian dilarutkan dalam etanol 80% hingga 10 ml. Selanjutnya dari larutan tersebut diambil 1 ml ditambah 1 ml AlCl3 2% dan akuabidest hingga 5 ml. Selanjutnya diinkubasi hingga 30 menit pada suhu 250 C, dan dibaca serapannya pada lamda maksimum (Azizah et al., 2014)
3) Penentuan kadar flavonoid
Penentuan kadar flavonoid menggunakan rumus penentuan kadar flavonoid yang dilakukan oleh Azizah et al. (2014) yaitu sebagai berikut:
F = c x V x f x 10-6 x 100% m
Keterangan:
F : Jumlah flavonoid metode AlCl3 c : kesetaraan kuersetin (μm/ml) V : volume total esktrak
f : faktor pengenceran m : berat sampel (g)
6. Uji kualitatif triterpenoid ekstrak pegagan
7. Pembuatan sediaan krim
Sediaan krim sebagai pembawa berupa krim tipe minyak dalam air (o/w). Formulasi krim mengacu kepada formulasi krim ekstrak pegagan yang dibuat oleh Putri (2013).
Tabel 3.1 Formula krim fase air, diaduk dalam mortir hangat hingga dingin. Bahan-bahan untuk masing-masing perlakuan dituang ke mortir lain, lalu ditambahkan basis krim sedikit demi sedikit, sambil diaduk hingga homogen.
b. Kontrol negatif (KN)
Kontrol negatif berupa basis krim 50 gram tanpa penambahan bahan lain.
c. Kontrol positif (KP)
Ethyl ascorbyl ether sebanyak 1,5 gram dicampurkan dengan basis krim hingga 50 gram.
d. Tetrahydrocurcumin (THC)
Tetrahydrocurcumin 1 gram dicampur dengan basis krim hingga 50 gram.
e. Ekstrak pegagan (EP)
Ekstrak kental pegagan 5 gram dicampur dengan basis krim hingga 50 gram.
f. Kombinasi tetrahydrocurcumin dan ekstrak pegagan (THCEP)
8. Uji aktivitas anti aging
a. Pendekatan uji aktivitas anti aging ini adalah Pre Test Post Test Control Group Design, mengacu pada uji anti aging yang dilakukan oleh Herawati (2014) dan Nazliniwaty (2016) dengan modifikasi. b. Mencit yang memenuhi kriteria inklusi dipilih secara acak, lalu
ditimbang berat badannya. Mencit dikelompokkan secara acak menjadi 5, yaitu 6 mencit untuk kontrol negatif, 6 mencit untuk kontrol positif, 6 mencit untuk perlakuan 1, 6 mencit untuk perlakuan 2, dan 6 mencit untuk perlakuan 3.
c. Mencit diletakkan dalam kandang ukuran 25 cm x 20 cm x 10 cm. Suhu ruangan 25-27° C, cahaya berasal dari jendela pada siang hari, kelembaban udara 50-60%, ventilasi silang. Dalam 1 kandang diisi 6 ekor mencit.
d. Kandang mencit dijaga kebersihannya setiap hari. Kotoran dan sisa makanan dibuang. Setiap satu minggu sekali alas kandang berupa sekam kering diganti.
e. Seluruh mencit diaklimatisasi selama selama 7 hari dengan tujuan agar hewan uji mampu beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang akan ditempati selama penelitian berlangsung.
f. Nutrisi untuk mencit berupa konsentrat makanan ayam 30%, jagung giling 40%, dan dedak 30%, diberikan secara ad libitum 12-25 gram/ekor/hari. Air minum berupa air putih matang diberikan ad libitum setiap hari.
g. Seluruh kelompok mencit dicukur bulunya pada bagian punggung belakang seluas 2x2 cm2 menggunkaan alat cukur bulu elektrik dan alat cukur bulu manual.
h. Pengukuran kondisi hewan uji sebelum perlakuan dengan Skin Analyzer EH 900 U meliputi sensitivitas kulit, kadar air, kadar kolagen, elastisitas, dan besar pori-pori.
j. Pengaplikasian bahan anti aging dengan cara kelompok kontrol negatif diolesi KN, kelompok kontrol positif diolesi KP, kelompok perlakuan 1, 2, 3 diolesi THC, EP, dan THCEP. Bahan dioleskan 2 kali per hari, yaitu 2 jam sebelum penyinaran UV, dan 15 menit setelah penyinaran UV dengan dosis 2 mg/cm2 selama 4 minggu (Ashawat et al., 2007). k. Pengontrolan berat badan dan kesehatan hewan uji dilakukan dengan
cara berat badan mencit dikontrol dengan cara ditimbang setiap 2 minggu selama penelitian berlangsung, untuk memastikan bahwa berat badan mencit tidak naik ataupun berkurang terlalu jauh dari rentang berat badan yang sudah ditentukan. Kesehatan mencit juga selalu dipantau dengan mengamati keaktifan bergerak dan nafsu makan mencit.
l. Pengukuran parameter aktivitas anti aging pada kulit hewan uji setelah perlakuan yaitu setelah 4 minggu dengan Skin Analyzer EH 900 U
meliputi sensitivitas kulit, kadar air, kadar kolagen, elastisitas, dan besar pori. Evaluasi anti aging dengan Skin Analyzer EH 900 U mengacu kepada Aramo (2012) dan Susana (2013). Evaluasi dilakukan kepada hewan uji dalam keadaan aktif, karena penggunaan skin analyzer tidak menyakiti kulit dan tidak bersifat invasif.
(1) Sensitivitas
Kamera diletakkan di permukaan kulit dorsal hewan uji. Pilih menu sensitivity, shooting, dan freeze. Daerah berwarna kemerahan yang menunjukkan sensitivitas pada foto, ditandai dengan menu tool yang tersedia untuk menentukan jumlah dan luas area kulit yang mengalami sensitivitas. Selanjutnya pilih menu analysis.
(2) Kadar air
Kamera diletakkan pada permukaan kulit dorsal hewan uji. Selanjutnya pilih menu moisture, shooting, freeze, dan analysis.
(3) Kadar kolagen
menu freeze untuk memfoto. Setelah kulit terfoto, pilih menu
analysis. Hasil analisis berupa persentase kadar kolagen akan ditampilkan pada layar komputer.
(4) Elastisitas
Kamera diletakkan pada permukaan kulit dorsal hewan uji. Selanjutnya dipilih secara berurutan menu elasticity, shooting, freeze, dan analysis. Kondisi elastisitas kulit berupa persentase ditampilkan pada layar komputer.
(5) Besar Pori
Kamera diletakkan pada permukaan kulit dorsal hewan uji. Pilih menu pore, shooting, freeze. Selanjutnya dengan menggunakan tool bergambar pensil, ditentukan diameter pori yang terfoto. Terakhir, pilih menu analysis.
m. Penggantian hewan uji
Apabila dijumpai adanya hewan uji yang mati sebelum penelitian berakhir, maka hewan uji tersebut diganti dengan hewan uji baru dengan kriteria inklusi yang sama, dan selanjutnya diberi perlakuan sesuai alur protokol penelitian.
n. Pemulihan kondisi hewan uji
Pada akhir penelitian, kemungkinan pada bagian kulit hewan uji yang dicukur bulunya akan mengalami penuaan dini. Hewan uji dipulihkan kondisinya dengan dibiarkan beraktivitas normal, diberi nutrisi dan air minum yang cukup, bagian kulit yang mendapat perlakuan selama penelitian diolesi etil ascorbyl ether 3% setiap hari selama 1 minggu.
H. Analisis Data
Data aktivitas anti aging THC, ekstrak pegagan, kombinasi THC ekstrak pegagan, dianalisis dengan program SPSS 17. Data diuji normalitasnya dengan
