Metaboromikusu ni yoru nihonshu seibun no morateki kaiseki

Title Sub Title Author Publisher Publication year Jtitle Abstract. Notes Genre URL. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org). メ夕ボロミクスによる日本酒成分の網羅的解析 亀崎, 圭太 慶應義塾大学湘南藤沢学会 2013 生命と情報 No.20 (2013. ) ,p.95- 106 日本酒は酒米と酵母から醸造される日本の伝統的な酒である。酒は世界各地で醸造され様々な製 造法が存在するが, 日本酒は特に酵母と麹の酵素による発酵が同時に行われる並行複発酵と呼ばれ る反応による豊かな味わいが特徴である。日本酒の醸造過程には酒米や酵母といった原材料の選 択から醸造環境など多くの要素が存在する。しかし従来の測定法では同時に多数の成分を測定す る事ができなかった為, 前述の要素がどのような影響を日本酒に与えているのか未だ研究は進んでいなかった。近年では, 慶應義塾先端生命科学研究所が開発したキャピラリー電気泳動質量分析法をはじめとした新規技 術の開発によって, サンプル中に含まれる成分についての網羅的な解析を行う事が可能になり, 今後の研究が期待されている。 そこで, 本研究では日本酒中に含まれる代謝物を明らかにし, 原材料の差異や熟成期間の違いによ ってどのような代謝物の変化が現れるのか明らかにする事を目的とし, 日本酒成分の網羅的解析を行った。研究の結果, 長期熟成を行う事でSuccinateやMalate, Citrateなどの有機酸濃度が上昇する事が明らかにした。 慶應義塾大学湘南藤沢キャンパス先端生命科学研究会 2013年度学生論文集 卒業論文ダイジェスト Technical Report http://koara.lib.keio.ac.jp/xoonips/modules/xoonips/detail.php?koara_id=KO92001004-00000020 -0095.

卒業論文ダイジェスト. メ夕ボロミクスによる日本酒成分の網羅的解析 環境情報学部4年 亀崎圭太 日 本 酒 は 酒 米 と 酵 母 か ら 醸 造 さ れ る 日 本 の 伝 統 的 な 酒 で あ る .酒 は 世 界 各 地 で 醸 造 さ れ 様 々 な 製 造 法 が 存 在 す る が ，日 本 酒 は 特 に 酵 母 と 麹 の 酵 素 に よ る 発 酵 が 同 時 に 行 わ れ る 並 行 複 発 酵 と 呼 ば れ る 反 応 に よ る 豊 か な 味 わ い が 特 徴 で あ る .日 本 酒 の 醸 造 過 程 に は 酒 米 や 酵 母 と い っ た 原 材 料 の 選 択 か ら 醸 造 環 境 な ど 多 く の 要 素 が 存 在 す る .し か し 従 来 の 測 定 法 で は 同 時 に 多 数 の 成 分 を 測 定 す る 事 が で き な か っ た 為 ,前 述 の 要 素 が ど の よ う な 影 響 を 日 本 酒 に 与 え て い る の か 未 だ 研 究 は 進 ん で い な か っ た . 近 年 で は ,慶 應 義 塾 先 端 生 命 科 学 研 究 所 が 開 発 し た キ ャ ピ ラ リ ー 電 気 泳 動 質 量 分 析 法 を は じ め と し た 新 規 技 術 の 開 発 に よ っ て ，サンプノレ中 に 含 ま れ る 成 分 に つ い て の 網 羅 的 な 解 析 を 行 う 事 が 可 能 に な り ，今 後 の 研 究 が 期 待 さ れ て い る . そこで , 本 研 究 で は 日 本 酒 中 に 含 ま れ る 代 謝 物 を 明 ら か に し ，原 材 料 の 差 異 や 熟 成 期 間 の 違 い に よ っ て ど の よ う な 代 謝 物 の 変 化 が 現 れ る の か 明 ら か に す る 事 を 目 的 と し ，日 本 酒 成 分 の 網 羅 的 解 析 を 行 っ た . 研 究 の 結 果 , 長 期 熟 成 を 行 う 事 で Succinate や M ala te ，C itra te な ど の 有 機 酸 濃 度 が 上 昇 す る 事が明らかにした. K e y w o rd s : 日本酒，メ 夕 ボ ロ ミ ク ス ，長 期 熟 成 ,有 機 酸. 95.

1 序章 1 . 1 背景. 日 本 で は 古 来 よ り 日 本 酒 ，焼 酎 と い っ た 伝 統 的 な 酒 類 が 飲 用 さ れ て き た .一 方 で 江 戸 時 代 の 開 国 以 降 他 国 の 酒 類 が 流 入 し 日 本 の 伝 統 的 な 酒 類 が 市 場 に 占 め る 割 合 は 減 少 の 一 途 を 迪 っ て き た .2 0 1 0 年 度 で は 日 本 の 伝 統 的 な 酒 類 が 市 場 に 占 め る 割 合 は 20% に 満 た な く な っ て い る . 焼 酎 が 発 泡 酒 の 材 料や， カクテルの材料として消費量が微増させている一方で，清酒の国内消費量は減少の一途を迪 つ て い る . そ こ で ，日 本 酒 業 界 は 日 本 食 ブ ー ム を 活 用 す べ く 海 外 販 路 の 拡 大 を 目 指 し て い る . 日本酒の競合対象としてワインが挙げられるが， ワインはポリフエノールをはじめとした含有代 謝 物 の 研 究 や ，そ の 健 康 効 果 の 研 究 を 通 し て 支 持 を 集 め 世 界 各 地 の 市 場 を 支 配 し て い る .ワ イ ン は 世 界 各 国 で 醸 造 さ れ 各 国 毎 の 特 色 を 出 す 事 で 商 品 価 値 を 高 め る と 同 時 に ，一 方 で 産 地 や 製 造 法 ，原 材 料を厳しく定義することでブランド管理を行っている.. また， 注 目 を 集 め 易 い ポ リ フ ヱ ノ ー ル 等 の. 健 康 成 分 を 多 く 含 む ワ イ ン は そ れ らの含有データを基に市場戦略を構築しているなど，成 分 •分 析 手 法 な ど の 研 究 開 発 が 酒 類 の な か で も 進 ん で い る .ワ イ ン は 熟 成 と 呼 ば れ る 過 程 を 非 常 に 重 視 し て お り ，長 期 熟 成 に よ る 化 学 的 変 化 を 明 ら か に し た 研 究 例 も 存 在 す る （ F a n g F ， , 以 乂 2 0 0 7, G . Fiechter,, 以 a/.. 2 0 1 1 ) • こ れ は ワ イ ン に 限 定 さ れ る 話 し で は な く ，ウ イ ス キ ー や ラ ム 酒 な ど 他 国 の 酒 類 に お い て も 同 じ で あ る .ワ イ ン や ウ ィ ス キ ー は オ ー ク 樽 の 中 で 熟 成 さ せ る 事 で 刺 激 が 弱 く 芳 醇 な 味 わ い に な る と さ れ て お り ，適 切 な 環 境 で 長 期 間 熟 成 さ せ た も の は 非 常 に 貴 重 な も の と し て 珍 重 さ れ て い る . 日本酒にも長期熟成させた古酒が存在するが，これまでの日本酒業界では新酒が最も良いものとさ れ，何 年 も 熟 成 さ れ た 古 酒 は 「 雑 味 が 多 い 」 ， 「味 が 重 い 」 等 と し て 敬 遠 さ れ て き た 慣 習 が 存 在 す る.. こ れ は 初 物 を 縁 起 物 と し て 扱 う 日 本 の 文 化 に 由 来 す る と こ ろ が 大 き い .日 本 国 内 市 場 で の 長 期. 熟成スタイルが定着していない事から，各酒造メーカーは保管費用や販売不振の影響を鑑みて古酒 の 販 売 を 積 極 的 に 近 年 迄 行 っ て こ な か っ た . しかし，海 外 販 路 の 拡 大 を 目 指 す に あ た り ，熟成させる 事 で ブ ラ ン ド 価 値 を 高 め る 必 要 性 が 生 じ ，熟 成 を 行 う 事 に 注 目 が 集 っ て い る .. 1 . 2 従来の研究手法における問題点 日 本 酒 の 醸 造 に 関 わ っ て い る 酵 母 や 麹 と い っ た 微 生 物 や 日 本 酒 の 劣 化 の 原 因 と な る Lacto b a cillu s m c tiv o m n s 等 の 微 生 物 に 関 し て 非 常 に 多 く の 研 究 が 既 に 行 わ れ て い る .ま た 酵 素 の 劣 化 条 件 や 食 品. の 保 存 条 件 の 検 討 と い っ た 研 究 例 も 数 多 く 報 告 さ れ て い る . 一 方 で ，日 本 酒 の 醸 造 工 程 の 条 件 設 定 の 根 拠 や 成 分 へ の 変 動 に 関 す る 研 究 は 行 わ れ て い な い .そ の 一 因 と し て 複 数 の 代 謝 物 を 網 羅 的 に 解 析する技術が近年 迄 開 発 さ れ て い な か っ た 事 が 挙 げ ら れ る. この事から日本酒の_ 造は職人による 経 験 則 と 感 覚 に よ っ て 行 わ れ て い る . 特 に 日 本 酒 は ,並 行 複 発 酵 を 行 う た め 他 の 酒 類 よ り も 成 分 が 複 雑 と な る . 更 に 日 本 に 存 在 す る 酒 類 （日本酒 , 焼 酎 （こ類，甲 類 ） ，泡 盛 ） の 中 で 日 本 酒 だ け は 蒸 留 の 過 程 を 経 な い .蒸 留 と は 一 度 蒸 発 さ せ た 後 に 再 度 凝 集 さ せ る こ と で 沸 点 の 異 な る 成 分 を 分 離 す る こ と を 指 し ，こ の 工 程 に よ っ て ア ル コ ー ル 度 数 が 上 昇 す る 一 方 で 揮 発 性 の 成 分 以 外 は 減 少 す る . そのため複数回蒸留を行う泡盛や甲類焼酎に関してはガス化クロマトグラフ（ G C -M S ) による分 析 で 事 足 り る と さ れ て い る . 一 方 で ，日 本 酒 は 蒸 留 の 過 程 を 経 て い な い 為 ，様 々 な 成 分 が 存 在 し て お り 味 に 大 き な 影 響 を 与 え て い る . そ の 結 果 ,他 の 酒 類 と 比 較 し て 日 本 酒 の 含 有 成 分 に 関 す る 研 究 は 大きく遅れている.. 96.

1.3 CE-TOF/MS 従 来 の 研 究 手 法 で は 複 数 の 代 謝 物 を 同 時 に 測 定 す る 事 が 出 来 な か っ た 為 ，研 究 に 制 限 が 生 じ て い た . しかし，現 在 で は 多 数 の 代 謝 物 を 同 時 に 測 定 す る 技 術 で あ る メ 夕 ボ ロ ー ム 解 析 技 術 が 確 立 さ れ つ つ あ り ，食 品 分 野 で も 様 々 な 研 究 が 行 わ れ る よ う に な っ た （ F e i S h e n „ が 虬 2 0 11 ，I S O G A I ， A „ e/a/. 2005 ) . メ タ ボ ロ ー ム 解 析 技 術 に は 様 々 な 手 法 が あ る が ,本 研 究 で は 先 端 生 命 科 学 研 究 所 が 開 発 し. た キ ャ ピ ラ リ ー 電 気 泳 動 法 ( C E ) と 飛 行 時 間 型 質 量 分 析 計 ( T O F / M S ) を 組 み 合 わ せ た C E - T O F / M S を用 い て イ オ ン 性 の 低 分 子 化 合 物 の 測 定 を 行 っ た . C E -T O F / M S は イ オ ン 性 低 分 子 化 合 物 を 非 常 に 高 い 分 離 能 と 精 度 で 一 斉 に 測 定 出 来 る こ と か ら 注 目 を 浴 び て い る 技 術 で あ る .本 技 術 の 登 場 に よ っ て 一 度 の測定でサンプルに含まれる成分について網羅的に解析した研究を行う事が可能になった. 更に， C E - T O F / M S を 用 い て 測 定 を 行 う 事 に よ り 従 来 の 手 法 に 比 べ ，サ ン プ ル の 劣 化 を 抑 え て 測 定 す る 事 が. で き る . 近 年 の 測 定 技 術 の 進 歩 に よ っ て 味 覚 の 研 究 が 進 み ，従 来 の 研 究 と 比 較 し て ア ミ ノ 酸 や 有 機 酸 と い っ た 低 分 子 化 合 物 が 強 力 に 味 に 作 用 し て い る こ と が 示 さ れ た （ S u g im o to M „ e/ a/. 2 0 1 0 ) ことに より，本 研 究 に お い て C E - T O F / M S を 用 い る こ と は 従 来 の 研 究 と 比 較 し て 大 き な 利 点 を 持 つ .. 1 .4 本 研 究 の 目 的 五 感 に 代 表 さ れ る 人 間 の 感 覚 を 用 い て 行 う 検 査 を 官 能 試 験 と 呼 び ，食 品 な ど の 嗜 好 性 の も の に つ い て の 検 査 は 理 化 学 的 測 定 よ り も 人 間 の 感 覚 を 用 い た 検 査 の 方 が 適 し て い る と さ れ る お り ，官能 試 験 の デ ー タ は 一 定 の 正 確 さ を 持 つ と さ れ て い る .一 方 で 近 年 で は 急 速 に 成 分 分 析 技 術 が 発 達 し て お り，嗜 好 性 に 関 す る 評 価 を 理 イ 匕 学 的 測 定 に よ っ て 行 う 事 を 目 指 し た 研 究 が 急 速 に 増 加 し て い る .日 本 酒 に お い て も 官 能 試 験 に よ っ て ，原 材 料 の 違 い が 日 本 酒 に 現 れ て い る 事 が 既 に 示 さ れ て い る .し か し，前 述 の 通 り こ れ 迄 の 成 分 分 析 技 術 で は 同 時 に 多 数 の 成 分 を 分 析 す る 事 が 難 し い 事 か ら ，それら の違いがどのような成分によるものなのかについては研究が進んでこなかった. 本 研 究 の 目 的 は 日 本 酒 の 成 分 分 析 を 通 し て ，日 本 酒 中 に 含 ま れ る 代 謝 物 を 明 ら か に し ，原材料 の 差 異 や 熟 成 期 間 の 違 い に よ っ て ど の よ う な 代 謝 物 の 変 化 が 現 れ る の か 明 ら か に す る 事 で あ る .本 研 究 で は C E - T O F / M S とL C - M S / M S を 用 い た メ 夕 ボ ロ ー ム 解 析 技 術 を 用 い た .こ れ ら の 装 置 を 組 み 合 わ せ た 食 品 研 究 の 例 は 未 だ 少 な く ，本 研 究 で 得 ら れ た デ ー タ か ら は こ れ 迄 で は わ か ら な か っ た 新 し い 事象に迫る事が出来ると期待される.. 2 対象と手法. 2.1 対象とした日本酒 本 研 究 で 用 い た サ ン プ ル は 全 て 市 販 品 で あ り ，酒 造 会 社 の 協 力 に よ り 使 用 し て い る 酒 米 や 酵 母 に ついてヒアリングすることができた. しかし酒米や酵母が明らかに出来なかったサンプルもあり， 特に古酒については使用されている酵母の情報が全サンプルにおいて不明だった.. 2011年度サンプル 2011 年 11 月 1 9 日 に 東 京 国 際 フ ォ ー ラ ム で 慶 應 義 塾 大 学 三 田 会 と 早 稲 田 大 学 校 友 の 両 組 織 に よ っ. て 開 催 さ れ た 日 本 酒 美 酒 早 慶 戦 に て サ ン プ リ ン グ し た も の を 使 用 し た . 審 査 用 の 45 本 と パ ー テ ィ ー 用 の 2本 の 計 4 7 本 を サ ン プ リ ン グ し た . サ ン プ ル は 開 栓 直 後 の 瓶 か ら 直 接 5 m lの ガ ラ ス ス ポ イ ト で サ ン プ リ ン グ し ，ガ ラ ス 瓶 に 封 入 し た . そ の 後 速 や か に 先 端 生 命 科 学 研 究 所 に 冷 蔵 輸 送 し 冷 蔵 庫 f4°C ). 97.

に て 保 管 し た . サ ン プ ル に 用 い た 各 酒 の 銘 柄 に つ い て は 共 同 研 究 先 と の 取 り 決 め に 従 い ，非公開と する.. 2012年度サンプル 2012年 9 月 8 日 に コ ー ト ヤ ー ド • マ リ オ ッ ト 銀 座 東 武 ホ テ ル で 開 催 さ れ た 第 2 回 日 本 酒 美 酒 早 慶 戦. に て サ ン プ リ ン グ し た も の を 使 用 し た . 審 査 用 の 51 本 を サ ン プ リ ン グ し た .サ ン プ ル は 開 栓 直 後 の 瓶 か ら 直 接 5 m l の ガ ラ ス ス ポ イ ト で サ ン プ リ ン グ し ，ガ ラ ス 瓶 に 封 入 し た . そ の 後 ,速 や か に 先 端 生 命 科 学 研 究 所 に 冷 蔵 輸 送 し 冷 蔵 庫 (4 ° C )に て 保 管 し た . 測 定 は 報 告 者 自 身 が 行 い , 到 着 か ら 2 週 間 後 に冷凍保存（ -8 0 度 ） さ れ た 後 に 測 定 が 行 わ れ た . L C - M S / M S に よ る 測 定 は 2 0 1 3 年 5 月 に 筆 者 が 自 ら 測 定 を 行 っ た . サ ン プ ル に 用 い た 各 酒 の 銘 柄 に つ い て は 共 同 研 究 先 と の 取 り 決 め に 従 い ,非 公 開 と する.. 古酒サンプル 2 0 1 2 年 度 S F C 政 策 研 究 支 援 機 構 に よ る 助 成 金 プ ロ ジ ヱ ク ト に お い て 購 入 ，測 定 さ れ た 19 サンプ ル. の デ 一 夕 を 使 用 し た . サ ン プ ル は 鶴 岡 市 の 古 酒 を 取 り 扱 っ て い る 業 者 よ り 購 入 し ，熟 成 期 間 は 3 年以 上のものを使用した. 開封後すぐにサンプリングを行い冷凍保存（ -8 0 ° C ) し た 後 に 測 定 が 行 わ れ た . L C - M S / M S に よ る 測 定 は 2 0 1 3 年 5 月 に 筆 者 が 自 ら 測 定 を 行 っ た .サ ン プ ル に 用 い た 各 酒 の 銘 柄 に ついては共同研究先との取り決めに従い, 非公開とする.. 2.2分析手法. CE-TOF/MS測定条件 測 定 は (A g ile n t 1100 isocratic H P L C p u m p , A g ile n t G 1 6 0 3 A C E -M S adapter kit, A g ile n t G 1 6 0 7 A C E — electrospray ionizatio n ( E S I ) - M S sprayer k i t ) を 用 い て 実 施 さ れ た .2 0 1 1 年 サ ン プ ル は 鶴 岡 キ ャ ン パ ス に. て慶應義塾大学先端生命科学研究所の技術員である大沼啓美氏と金子未来氏によって以下の文献 と 同 じ 条 件 で 行 わ れ た . 2012年 サ ン プ ル と 古 酒 サ ン プ ル に つ い て は 同 条 件 で 報 告 者 自 ら が 測 定 を 行 つ た . シ ス テ ム の 制 御 と デ 一 夕 解 析 は ( C E : A g ile n t G 2 2 0 1 A A C h e m S t a t io n s o f t w a r e ,T O F M S : A n a ly s t Q S ) を 用 い て 実 施 し た •測 定 サ ン プ ル は 2 m M の 内 部 標 準 ( I S ) が 入 っ た M i l l i - Q 90 # にサンプル. を 10 4 を 加 え た も の を 用 い た . 得 ら れ た デ 一 夕 は M a s te r H a n d s 2 を 用 い て 定 量 を 行 っ た . デ ー タ 処 理 方 法 は ，ノイズのフィルタリ ング ，ベース ラ イ ン の 補 正 ,泳 動 時 間 の 補正，ピークの 検 出 ，ア ラ イ メ ン ト で あ る .. LC-MS/MS測定条件 測 定 は (A p p lie d B io system s A P I 3 000 L C / M S / M S ) を 用 い て 実 施 さ れ た . 全 サ ン プ ル は 報 告 者 自 ら が 測 定 を 行 っ た . デ ー タ 解 析 は A n a ly s tQ S を 用 い て 実 施 し た . 測 定 サ ン プ ル は C E - T O F / M S で の 測 定 時 に 使 用 し た サ ン プ ル を a c e to n itrile に よ っ て 5 倍 希 釈 し た も のを使用した.. ヒートマップ. （Heat Map). ヒートマップとは個々の値がもつ特徴を可視イ匕したものを指す本研究ではヒートマップはM ev を 用 い て 作 製 し ，デ 一 夕 は 濃 度 を Z -s c o r e に 変 換 し た も の を 用 い て い る .. 98.

主成分分析(Principal Component Analysis) 主成分分析（ P C A ) と は ピ ア ソ ン に よ っ て 開 発 さ れ た ，多 く の 特 性 を 持 つ 多 次 元 デ ー タ を 低 次 元 デ ー タ へ と 変 換 す る 手 法 の 1つ で あ る . 主 成 分 は ,分 散 共 分 散 行 列 や 相 関 係 数 行 列 に 対 す る 固 有 値 分 解 あ る い は ,分 散 共 分 散 行 列 や 相 関 係 数 行 列 に 対 応 し た 偏 差 行 列 の 特 異 値 分 解 に よ っ て 求 め ら れ て い る . 主 成 分 分 析 で は 幾 つ も の 主 成 分 が 算 出 さ れ る が ,本 研 究 で は そ れ ら の 主 成 分 を 寄 与 率 が 最 も 高 い も の と ，次 に 高 い も の の ス コ ア を x 軸 と y 軸 と し て 用 い て 描 画 し た 二 次 元 プ ロ ッ ト を 示 し て い る . 主 成 分 分 析 の 結 果 と し て 主 成 分 を 基 に 描 画 し た 2 次 元 , 及 び 3 次 元 プ ロ ッ ト と 共 に ，そ れ ぞ れ の 主 成 分 に 寄 与 し た 成 分 を 示 す L o a d in g と 呼 ば れ る 図 を 描 画 す る 事 が 出 来 る . 本 研 究 で 描 画 し て い る 2 次 元 プ ロ ッ ト で は プ ロ ッ ト が サ ン プ ル を 示 す が , L o a d in g で は プ ロ ッ ト は 成 分 を 示 す . P C A はJ M P を用 いて描画した.. 02PLS-DA P a rtia lL e a stS q u a re s. (P L S ) 解 析 と は 主 成 分 分 析 に よ っ て 有 意 な 結 果 が 得 ら れ な か っ た 際 に 行 わ. れ る 教 師 付 き 分 類 の 一 種 で あ る . 本 研 究 で は P L S を 基 に U m e tric s 社 が 開 発 し た 0 2 P L S - D A と呼ばれ る 手 法 を 採 用 し た .本 解 析 は U m e trics 社 の S I M C A を 用 い て 行 っ た .. 99.

3 結果 測 定 を 行 っ た 全 サ ン プ ル の 成 分 濃 度 情 報 を Z-score に 変 換 し た 値 を 用 い て ，階 層 的 ク ラ ス タ リ ン グ を 行 い Heat. M ap に 描 画 し た .そ の 結 果 古 酒 と 新 酒 に ク ラ ス 夕 リ ン グ さ れ た (F ig .1 ). 縦 軸 が 代 謝 物 を ,. 横 軸 が サ ン プ ル を 示 し て お り ，黄 色 く 表 示 さ れ て い る も の は Z -s c o re が 高 い も の を 指 し 濃 度 が 高 い 事 を 示 し て い る . アミノ酸濃度はサンプノレによって違いが有り，長 期 熟 成 過 程 に よ る 影 響 は 明 ら か に な ら な か っ た .一 方 で 有 機 酸 の 濃 度 に つ い て は 古 酒 サ ン プ ル が 非 長 期 熟 成 サ ン プ ル と 比 較 し て 高 い 事がわかる.. Fig.l 全サンプルを対象にクラスタリングを行った結果. 縦軸は成分名を， 横軸はサンプルをそれぞれ示す.濃度が高いも の に つ い て は 黄色く表示されて お り ，低い も の に つ い て は 青く表示されて い る . 古酒サンプルと非長期熟成サンプルに分離する事が示されている.明確な差が示されているのはアミノ酸 類と有機酸類であるが,アミノ酸濃度は同じ群の中でもばらつきがある一方で,有機酸類は古酒において特徴 的に高くなっている. また，主 成 分 分 析 を 行 っ た 結 果 ，長 期 熟 成 過 程 の 有 無 に よ っ て 大 き く 分 か れ る 事 が 明 ら か に な つ. F ig .2 ). 分 離 に 寄 与 し て い る 成 分 に つ い て ，主 成 分 分 析 で 得 ら れ た Loading (Fig.2 b ) デ ー タ か ら ， Succinate とMalate を 始 め と し た 有 機 酸 類 が 分 離 に 寄 与 し て い る 事 が 明 ら か に な っ た . た. （. 100.

II. Fig.2 一 全サンプルから外れ値のサンプルを抜いて行った主成分分析の2次元プロットとそのLoading. 赤が2011年度サンプルを， 青が2012年度サンブル,緑が古酒サンプルをそれぞれ示している.この結果から， 非 長期熟成サンプルと古酒サンプルが分離されていることがわかる. a)古酒と新酒の分離には有機酸が,古酒同士や新酒同士の分離にはアミノ酸が寄与している事が判る.. 101.

4 議論 長 期 熟 成 過 程 を 経 る 事 で サ ン プ ル 中 の 代 謝 物 に 変 化 が 有 る 事 が 示 さ れ た • こ の 原 因 の 1つとして 長 期 間 熟 成 さ せ る 事 で サ ン プ ル 中 の 水 分 が 揮 発 し 濃 度 が 上 昇 す る と い う 事 も 考 え ら れ る •サ ン プ ル 中 に 含 ま れ る 代 謝 物 の 総 量 を 求 め た 所 ,古 酒 サ ン プ ル は 非 長 期 熟 成 サ ン プ ル と 比 較 し て 成 分 濃 度 が 全 体 的 に 高 い 傾 向 を 示 す 事 が わ か っ た . しかし，F ig .3 に 示 し た 通 り 濃 度 変 化 は 全 て の 成 分 に お い て 一 定 で は な く ，長 期 間 熟 成 さ せ る 事 に よ っ て 有 機 酸 と 糖 類 が サ ン プ ル 中 に 占 め る 割 合 が 大 き く 変 化 す る 事 が 示 さ れ た .こ の こ と か ら 長 期 間 熟 成 さ せ る 過 程 で 水 分 の 蒸 発 以 外 の 変 化 が 起 き て い る と 考 え ら れ る . 日 本 酒 の 熟 成 は 瓶 の 中 で 行 わ れ る 事 か ら ，樽 か ら の 侵 出 が あ る ワ イ ン と 異 な り 外 部 か ら の 代 謝 物 混 入 は 考 え ら れ な い .ま た 一 般 的 に 醸 造 の 最 後 の 過 程 で 行 わ れ る 火 入 れ と 呼 ば れ る 過 程 に よって日本酒中に含まれる酵素は完全に失活するとされており（ 谷 本 昌 太 , ，以 a/. 2 0 04 ) , 酵素によ る 反 応 で は な い と 考 え ら れ る . ま た ,本 研 究 で 用 い ら れ た サ ン プ ル は 遮 光 環 境 下 で 低 温 長 期 熟 成 さ れ て おり得られた結果は劣化によるものではない.. F ig .3 非長期熟成サンブルと古酒サンプルで検出された全代謝物を， 有機酸，糖類，アミノ酸類，その他に分類. しそれぞれが全体の中で占める割合を各群の全サンブルの平均値から示した . その結果，熟成過程を経る事で糖類が占める割合が減少する一方で,有機酸が占める割合が増加する事が 示された .. F ig .4 は 外 れ 値 を 除 い た サ ン プ ル で 描 画 し た 主 成 分 分 析 の 2 次 元 プ ロ ッ ト を 酒 米 の 違 い で 色 分 け. し た も の で あ る . 古 酒 は 市 場 が 大 き く 無 い 事 か ら も 十 分 な サ ン プ ル 数 を 集 め る 事 が 難 し く ，本 研 究 で は 山 田 錦 を 用 い た サ ン プ ル が 全 体 に 占 め る 割 合 が 多 い . しかし，山 田 錦 を 用 い た サ ン プ ル は 長 期 熟 成 後 も 似 た 特 徴 を も つ 一 方 で ,亀 の 尾 を 用 い た サ ン プ ル は 熟 成 す る 事 で 異 な る 特 徴 を 示 す 事 が 明 ら か に な っ た . 一 方 で , 酵 母 に よ る 熟 成 に よ る 明 確 な 影 響 に つ い て は ，古 酒 サ ン プ ル で 用 い ら れ て い る酵母が明らかでない事から確認する事が出来なかった.. 102.

0. IP. mm. 響 松. illi幷 #. •亀 ©纖 #. mmm. •伽 儀 .. 難長期*成. m 聲錄働. *1#-. mm _翻 議 暑. *""7©. 1# P C K 1 3 .4 % }. F ig .4 使用酒米が判明しているサンプルを対象とした主成分分析の結果.. 赤が山田錦を， 緑が松山三井，ピンクが亀の尾,青が雄町米，そして黒がその他の酒米を醸造に用いた日本酒で ある事を示している.山田錦とそれ以外に熟成を経る事によって分離していく事が示された.. 本研究では官能試験デ一夕を得る事が出来なかったが,熟成によって増加する事が示された代謝 物の一部に,既に先行研究によって食品の味に大きな影響を与える事が明らかになっているものが 確認された(Fig.5). MalateとCitrateは酸味を示す味覚成分である事が先行研究で明らかになってお り，また非長期熟成サンプルと古酒サンプノレの分離に大きく寄与しているSuccinateは旨味を示す.一 般的に古酒は非長期熟成酒と比較して旨味が強く芳醇な味わいであると表現される事からこれら の傾向とも一致している.. 103.

门 r n. 300 250. 200 _ _ 漏_ 細. 150 n. 100. i. m o. Citrate. 圖 咖. SucdmiB M O#. 酸味. F ig .5非 長 期 熟 成 サ ン プ ル と 古 酒 サ ン プ ル と の 間 で 有 意 差 が 岛 っ た 代 謝 物 . M alate ， Citrate ， Succinate は 非 長 期 熟 成 サ ン プ ル と 比 較 し て 古 酒 サ ン プ ル に お い て 有 意 に 高 濃 度 で 観 測 さ れ た . これら3 つ の 代 謝 物 は マ ン ホ イ ッ ト ニ ー の U 検 定 を 用 い て 有 意 差 の 確 認 を 行 っ た .そ の 結 果 こ れ ら の 代 謝 物 は 全 て P 値 が <0.0001であった.. 104.

本 研 究 で は C E - T O F / M S とL C - M S / M S を 用 い て 得 ら れ た デ 一 夕 を 対 象 と し て 解 析 を 行 っ た 結 果 か ら，熟 成 す る 事 に よ っ て 何 ら か の 化 学 変 化 が 生 じ ，含 有 成 分 に 変 化 が 起 こ る 事 を 明 ら か に し た .一 方 で ，今 回 得 ら れ た デ 一 夕 で は 長 期 熟 成 前 の サ ン プ ノ レ に お い て は 差 異 を 確 認 す る 事 が 出 来 な か っ た . 長 期 熟 成 後 に は 酒 米 の 違 い に よ る 影 響 が 現 れ て い る 事 か ら ，長 期 熟 成 前 の 日 本 酒 に お け る 酒 米 や 酵 母 と い っ た 原 材 料 か ら の 影 響 を 明 ら か に す る 為 に は ，本 研 究 で 用 い た 種 類 以 外 の 代 謝 物 に つ い て も 研究対象としていく事が必要であると考える. また , 本 研 究 の 過 程 で 明 ら か に な っ た ，長 期 間 熟 成 さ せ る 事 に よ っ て 日 本 酒 中 に 含 ま れ る 成 分 の 内 糖 分 の 占 め る 割 合 が 減 少 し ，有 機 酸 の 占 め る 割 合 が 増 加 す る 事 象 は 興 味 深 い .ワ イ ン は 日 本 酒 と 比 較 し て 先 行 研 究 が 多 く ，長 期 間 の 熟 成 過 程 に お い て 発 生 す る 反 応 に つ い て 既 に 様 々 な 知 見 が 得 ら れ て い る . ワ イ ン は 日 本 酒 と 違 い 加 熱 処 理 を 施 さ ず に 長 期 熟 成 を 行 う た め ，微 生 物 や 酵 素 が 残 留 し て お り ， 日 本 酒 に は 当 て は ま ら な い も の も 多 い が ，ワ イ ン の 研 究 に よ っ て 明 ら か に な っ た 知 見 の 1つ と し て エ ス テ ル 化 合 物 に よ る 糖 類 の 分 解 反 応 が 挙 げ ら れ る .こ の 反 応 で は ワ イ ン 中 に 含 ま れ る 有 機 酸がエタノールと反応して生成したエステル化合物が糖類を分解する事によってエチルエステルが 増 加 し ，香 気 成 分 が 増 加 す る 事 が 知 ら れ て い る . 本 研 究 で 用 い た 日 本 酒 は 全 て 吟 醸 酒 で あ る が ，吟醸 酒 の 特 徴 と し て 吟 醸 香 と 呼 ば れ る 香 り が 強 い 事 が 挙 げ ら れ る .吟 醸 香 は 酢 酸 イ ソ ア ミ ル な ど の フ ー ゼ ル ア ル コ ー ル の 酢 酸 エ ス テ ル や 力 プ ロ ン 酸 エ チ ル な ど に よ る も の で あ る が ，こ れ ら は 中 鎖 脂 肪 酸 の エ チ ル エ ス テ ル で あ る . こ の 事 か ら 日 本 酒 に お い て も ，長 期 熟 成 過 程 に お い て 類 似 し た 化 学 反 応 が 行 わ れ て い る 可 能 性 は 高 い . しかし，本 研 究 で 用 い た 測 定 法 で は エ ス テ ル 類 や エ タ ノ ー ル 類 の 測 定 は 難 し く ，こ れ ら の 可 能 性 に 言 及 す る 事 は 出 来 な か っ た .今 後 は 本 研 究 で 対 象 と し た 成 分 以 外 の 研 究 が 進 む 事 に よ り ，熟 成 過 程 で 発 生 す る 反 応 が 明 ら か に な り 安 定 的 な 日 本 酒 の 長 期 熟 成 が 実 現 す る 可能性があり， 今後の研究に期待されるところである.. 105.

謝辞 本 研 究 を 行 う に あ た り ，常 日 頃 か ら 刺 激 と な る 討 論 の 場 を 提 供 し て 下 さ っ た 先 端 生 命 科 学 研 究 会 の 方 々 に は 心 よ り 感 謝 を 申 し 上 げ ま す .特 に 私 の 大 学 生 活 に お い て 最 も 公 私 共 に お 世 話 に な っ た の が 村 上 慎 之 介 氏 で あ り ま す . 大 学 2 年 時 か ら 3 年 時 に か け て 参 加 さ せ て 頂 い た バ イ オ キャンプ，そして 大学4年 時 か ら の 2 年間の鶴岡での研究生活が充実したものであったのはひとえに村上氏の御陰で ありました. この場をお借りしてお礼申し上げます. ま た ,研 究 活 動 を 行 う に あ た り 的 確 な ア ド バ イ ス に よ っ て 御 指 導 を 頂 い た の が 福 田 真 嗣 氏 と 杉 本 昌 弘 氏 で あ り ま し た . 私 が 学 部 4年 時 に グ ラ ス ゴ ー で 行 わ れ ま し た 国 際 学 会 に て 発 表 を 行 う 事 が で きたのはひとえに両氏の指導の御陰であります. この場をお借りして深くお礼申し上げます. 最 後 に ，本 研 究 を 行 う た め の 環 境 を 与 え て 頂 き ま し た 冨 田 勝 教 授 に 感 謝 の 意 を 表 し ま す .. 参考文献. Fang F, Jing-Ming Li, Qiu-Hong P., et al., (2007) Determination of red wine flavonoids by HPLC and effect of aging. Food Chemistry,101,428-433. G. Fiechter, H. and K. Maver., et al., (2011) UPLC analysis of free ammo acids in wines: Profiling of on-lees aged wines. Chromatography B, 879, 1361-1366. (jf047933) Fei, S. Yibin, Y., et al., (2011) Multivariate classification of rice wines according to ageing time and brand based on amino acid profiles. Food Chemistry, 129, 565-569. ISOGAI, A. UTSUNOMIYA，H•，ぱ 《 /., (2005) Changes in the Aroma Compounds of Sake during Aging. Food Chem. 53,4118-4123 Sugimoto, M. Koseli, T., et al., (2010) Correlation between Sensory Evaluation Scores of Japanese Sake and Metabolome Profiles. Food Chem. 58, 374-383. S a to , Y . F u k u d a , H . , et al., ( 2 0 1 0 ) C o n t r ib u t io n o f e th a n o l-to le ra n t x y la n a s e G 2 f r o m A s p e r g illu s o ry z a e o n Jap a n e s e sake b r e w in g . B i o e n g i n e e r i n g . 1 10, 6 , 6 7 9 -6 8 3 . M iy -Y o u n g , S. S o - V oung, C .,. et al., ( 2 0 0 9 ) A n t i -a g i n g. e ffe c t o f ric e w in e in c u lt u r e d h u m a n. fib ro b la s ts a n d k e ra tin o c y te s . B io e n g in e e r in g . 1 0 7 , 3 , 2 6 6 -2 7 1 .. 谷本昌太 . 松本英之.,がar/.,(2004) 清酒の火入れ中の酵素失活挙動 . Brew.. 99, 3 ,208-214.. 106. Soc. Japan..