Prinsip Dan Teknik Isolasi Protein

Prinsip dan Teknik Isolasi dan

Purifikasi Protein

Teknik isolasi dan purifikasi

• Merupakan proses hilir dalam bioteknologi

• Tidak kurang penting dibanding proses hulu – rekayasa genetik, teknik fermentasi

• Yang diolah – produk dari proses terdahulu

• Protein – produk dari rekayasa genetika

• Yang paling banyak – isolasi / purifikasi protein dari tumbuhan, hewan, mikroorganisme

Teknik isolasi / purifikasi – dapat dalam

• skala laboratorium

• skala industri

Sebelum melakukan isolasi – penting

diperhatikan sumber produk yang akan

diisolasi

_{• Hewan}

• Tumbuhan

< tahun 1970 an – digunakan sumber dari

• hewan

- tripsin, lipase, rennin

- mahal, sumber terbatas

• tumbuhan

- papain, bromelain, amilase, lipoksigenase

- dipengaruhi cuaca, politik

Sumber dari mikroorganisme

- banyak digunakan setelah perkembangan

teknologi fermentasi

ISOLASI

Metode isolasi tergantung • Sumber produk

• Skala produksi (lab / industri) • Stabilitas produk

• Bentuk murni / tidak murni

Proses isolasi dimulai dengan mengetahui letak / lokasi produk yang akan disolasi

• Intrasel • Ekstrasel

• Protein larut intrasel dari tumbuhan –

teknik isolasi tidak rumit – karena jaringan

lunak, mudah dihancurkan dengan tissue

homogenizer

• Protein intrasel dari mikroorganisme –

lebih liat – perlu metode lebih kuat

• Protein terikat membran – masalah

tersendiri – tidak tergantung sumber

Metode penghancuran (lisis) sel 1. Abrasif

- dengan blender laboratorium dengan butiran gelas (glass beads)

2. Liquid shear

- suspensi sel dilewatkan dengan tekanan tinggi melalui

lubang kecil ke dalam ruang dengan tekanan atmosfir - karena perbedaan tekanan mendadak – sel pecah

- untuk dinding sel bakteri yang tidak terlalu keras – misal bakteri Gram negatif

3. Osmotic shock

- sel disuspensikan di dalam akuades / larutan hipotonik

sehingga sel lisis

- protein dilepaskan dari sel yang lisis

- tidak efektif untuk sel bakteri dan tumbuhan 4. Penambahan alkali

- metode paling sederhana untuk melisis sel

- sebagian besar sel pecah pada pH 11,5 – 12,5

- protein yang diisolasi harus stabil selama 20 – 30 menit pada pH tinggi tsb

5. Penambahan deterjen.

- selain lisis sel, sebagian besar protein sel mengalami denaturasi

6. Solid shear

- dengan membekukan sel - 20oC, dipaksa melalui lubang

kecil pada tekanan tinggi

7. Penambahan lisozim dan EDTA

- cocok untuk skala kecil karena mahal - efektif untuk sel bakteri

8. Pelarut organik

- toluen dan aseton – untuk melisis berbagai sel

- tidak untuk skala besar – toksik, mahal, mudah terbakar 9. Sonikasi

- lisis sel dengan getaran ultrasonik - untuk skala kecil

PURIFIKASI (PROTEIN)

Pada waktu lisis sel – seluruh isi sel keluar –

banyak kontaminan oleh karena itu harus

disingkirkan, antara lain asam nukleat

Asam nukleat – meyebabkan viskositas

tinggi – pada tahap awal harus disingkirkan

• Presipitasi – penambahan polikation BM 

(protamin, streptomisin, polietileneimin) – mahal

• Digesti – dengan nuklease – mudah, murah

Setelah asam nukleat disingkirkan – sisa sel

yang tidak larut (dinding sel, protein

membran, bagian sel yang hancur) harus

disingkirkan dengan

_{• Sentrifugasi – sangat baik untuk solid}

yang bersifat licin (slimmy or gelatinous

solids)

Sentrifugasi

• Kecepatan mulai 100 x g sampai 600.000

xg

• Dapat memisahkan organel sel

berdasarkan massa dan densitasnya

- 3000 g = sel dan nukleus

- 12.000 g = mitokondria / kloroplas

- 100.000 g = mikrosom, ribosom

Penyingkiran asam nukleat + debris sel (=

presipitat, pelet) - menghasilkan supernatan

yang mengandung

- protein yang diinginkan

- kontaminan (protein yang tidak diinginkan,

molekul organik dan inorganik)

Penyingkiran kontaminan – presipitasi dengan • Amonium sulfat dengan berbagai konsentrasi

- protein yang tidak diinginkan diendapkan terlebih dahulu, baru protein yang diinginkan diendapkan dengan konsentrasi yang lebih tinggi

- paling banyak digunakan

- pada skala besar – masalah penanganan dan pembuangan – korosif

• Natrium sulfat

- tidak bersifat korosif

• Pelarut organik

- skala lab, jarang skala industri karena mudah

terbakar

• Polimer

- polietilen glikol (PEG)

- tidak toksik

- tidak mudah terbakar

- penggunaan terbatas karena meningkatkan

viskositas larutan

- polyacrylic acid

_{- non toksik}

Lisis sel sentrifugasi presipitat kontaminan supernatan Am. sulfat presipitat supernatan presipitat supernatan Am. sulfat Fraksinasi

Pemisahan selanjutnya (fraksinasi) – melibatkan 3

komponen

1. Fasa solid / stasioner

- berupa film, kolom, gel atau membran

2. Pelarut

- fasa mobil pada kromatografi

3. Solut

Teknik Dialisis Filtrasi gel Krom. Adsorpsi Krom. Partisi Krom. Pertkr ion Krom. Afinitas

Elektr sel. Aset

PAGE Dasar pemisahan Uk / btk molekul Uk / btk molekul Adsorpsi Solubilitas Ionisasi Interaksi ligan Muatan listrik

Muatan listr + uk mol

Fasa solid Gel Adsorben Innert support Mtrks + ggs terionisasi Matriks + ligan Innert support Innert support berpori Pelarut Mbr semipermabel Air Bufer Nonpolar Polar – nonpolar Bufer Bufer Bufer Bufer

Pada dasarnya pemisahan molekul protein dapat berdasarkan Sifat Muatan Polaritas Ukuran molekul Spesifisitas Prosedur

- kromatografi pertukaran ion - elektroforesis

- kromatografi adsorpsi - kromatografi kertas

- dialisis dan ultrafiltrasi - gel elektroforesis

- kromatografi gel filtrasi - ultrasentrifugasi

Dialisis

• Untuk memisahkan protein (molekul besar) dari garam (molekul kecil) dan kontaminan berukuran kecil

• Protein dimasukkan ke dalam kantong selofan yang berpori kecil

• Kantong dimasukkan ke dalam wadah yang mengandung akuades / bufer, sambil di putar dengan pemutar magnetik semalaman dengan penggantian akuades / bufer beberapa kali dalam wadah

• Pori memungkinkan molekul kecil berdifusi keluar, molekul besar tertahan di dalam kantong

• Dapat untuk memekatkan larutan – dengan meletakkan

Dialisisis

Kantong selofan berisi larutan yang akan dimurnikan

Kromatografi

Pemisahan molekul berdasarkan perbedaan

struktur dan atau sifat fisik pada saat berinteraksi

dengan

_{• fasa stasioner (matriks)}

• fasa mobil

- kertas saring ( krom. kertas)

- lapis tipis selulosa / silika / alumina –

kromatografi lapis tipis

Kromatografi Kertas

• Beberapa tetes larutan yang mengandung komponen yang akan dipisahkan diteteskan pada sepotong kertas –_{dibiarkan kering} • Ujung kertas dicelupkan ke dalam pelarut yang terdiri

dari campuran pelarut polar dan nonpolar

• Komponen polar akan terikat pada kertas membentuk fasa stasioner, sedangkan komponen nonpolar bergerak membentuk fasa mobil

• Berbagai komponen dalam larutan akan terpisahkan berdasarkan perbedaan kelarutan dalam fasa stasioner

• Setelah bergerak dalam jarak tertentu –

kromatogram diangkat dan dikeringkan

• Dideteksi dengan

- radioaktif

- sinar UV

- pewarnaan dengan zat warna

• Kecepatan migrasi – Rf (rate of fractionation)

– perbandingan jarak yang ditempuh solut

Kromatografi kertas - dua dimensi

Kromatografi kolom

• Fasa stasioner – kolom butiran kecil selulosa / akrilamid / silika

• Fasa stasioner berinteraksi dengan protein berdasarkan - muatan

- interaksi hidrofobik - interaksi ligan

• Campuran protein dimasukkan ke dalam kolom, kemudian di luruhkan dengan fasa mobil (eluen)

• Fasa mobil yang keluar (eluat) ditampung dalam fraksi-fraksi dengan volume tertentu

Matriks yang digunakan

•

•

•

•

•

•

Cross-linked dextran (Sephadex)

Agarosa (Sepharose, Biogel)

Cross-linked agarosa (Sepharose CL)

Poliakrilamid (Biogel P)

Porous glass (Bio-glass)

Polistiren (Bio-beads)

Kromatografi Partisi

• Pemisahan dengan kromatografi kolom berdasarkan

afinitas relatif berbagai protein terhadap fasa mobil dan fasa stasioner

• Protein yang lebih kuat berinteraksi dengan matriks akan tertahan

• Lamanya waktu protein berinteraksi dengan matriks tergantung dari komposisi fasa stasioner dan fasa mobil • Pemisahan protein optimal – diperoleh dengan

Kromatografi Berdasarkan Ukuran Molekul

(Filtrasi Gel, Size Exclusion Chromatography)

• Pemisahan protein berdasarkan perbedaan ukuran molekul dan melewatkannya melalui kolom gel yang telah mengembang

• Yang paling banyak dipakai – Sephadex – partikel kecil hidrofilik, tidak larut karena cross-linking dekstran

membentuk jaringan 3 dimensi

• Molekul >> keluar lebih dahulu, molekul << tertahan karena masuk ke dalam butiran gel

• = Molecular sieving

Size exclusion chromatography

Size exclusion chromatography

Kromatografi adsorpsi

• Teknik kromatografi paling tua – I x digunakan oleh Tswett untuk memisahkan pigmen tumbuhan

• Senyawa diadsorpsi ke dalam kolom – terjadi

keseimbangan antara molekul yang terikat pada matriks dengan yang terdapat di dalam pelarut

• Derajat pengikatan ditentukan oleh muatan, ikatan van der Waals, interaksi ionik, ikatan hidrogen, struktur

senyawa yang dipisahkan

• Adsorben – alumina, kieselguhr, sukrosa, silika gel

• Eluen – kloroform, heksan, etil eter, campuran pelarut organik

Kromatografi pertukaran ion

• >> digunakan untuk purifikasi protein, molekul kecil • Matriks – bahan inert dengan gugus terionisasi – DEAE

selulosa, CM selulosa

• Atom N dari DEAE pada pH < 9 – mengikat molekul bermuatan negatif – disebut penukar anion (anion

exchanger)

• CM selulosa – penukar kation (cathion exchanger) • Peluruhan protein – berdasarkan muatan atau

konsentrasi garam dalam bufer

• Penting diperhatikan – resin yang dipakai, pH, ionic

Kromatografi afinitas

• Ligan – terikat secara kovalen pada matriks porous yang inert

• Ligan

- spesifik – substrat, analog, inhibitor - umum – AMP, hidrokarbon, zat warna

• Dalam skala besar jarang digunakan – mahal, keterbatasan kapasitas, tidak stabil

Kromatografi lapis tipis

• Pemisahan senyawa pada lempeng tipis

• Dasar – adsorpsi, pertukaran ion, partisi, filtrasi gel • Berlangsung cepat

• Dapat memisahkan beberapa pemisahan sekaligus

• Bercak yang timbul diwarnai dengan pewarnaan tertentu – diukur kadarnya secara spektrofotometri

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

• Separasi berdasarkan – adsorpsi, pertukaran ion atau filtrasi

• Sampel diuapkan dan dimasukkan ke dalam kolom dengan tekanan tinggi (sp 5000 psi)

• Eluat dideteksi dengan mengukur serapan pada gelombang UV

• Resolusi tinggi, cepat, sensitivitas >> - dapat mengukur sampai ng

Elektroforesis

• Merupakan teknik pemisahan protein yang paling sering digunakan di lab

• Berdasarkan pergerakan molekul bermuatan dalam medan listrik

• Pada pH > pI, protein bermuatan negatif – bergerak ke

anoda; pada pH < pI, protein bermuatan positif – bergerak ke katoda; pada pH = pI, protein tidak bergerak

• Matriks yang digunakan – membran selulosa asetat, starch gel, akrilamid, agarosa

SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

• SDS = Sodium dodecyl sulphate

• Akrilamid berpolimerisasi dan cross-linked – membentuk matriks yang porous

• SDS – membuat protein bermuatan negatif, sehingga

pemisahan terjadi berdasarkan kecepatan bergerak

dalam medan listrik yang dipengaruhi oleh besar molekul

• Molekul besar lebih tertahan pergerakannya dibanding molekul kecil

• Protein yang terpisah divisualisasi dengan zat warna –

Pada tiap tahap purifikasi harus dilakukan • Pengukuran volume sampel

• Penetapan kadar protein

 Mulai dari tahap awal sampai tahap akhir penetapan – untuk mengetahui seberapa

jauh terjadi pemurnian produk

Bila pada elektroforesis diperoleh 1 puncak

setelah melalui berbagai tahap purifikasi –

presipitasi, krom pertukaran ion, filtrasi gel, krom afinitas – dapat dikatakan protein telah murni

Bila mungkin – protein murni disimpan dalam bentuk kristal

IDENTIFIKASI & PENGHITUNGAN KADAR PROTEIN DALAM BAHAN UJI PADA TAHAP PURIFIKASI

- secara spektrofotometri- serapan pada  280 nm (sinar UV)

- serapan protein setelah diwarnai dengan pewarna yang bereaksi dengan asam amino / protein

- ninhidrin ( biru )  kromatografi lapis tipis - biuret (lembayung)

- Bradford (biru) - fluoresamin

Dibandingkan terhadap serapan larutan standar yang diketahui kadarnya

Untuk enzim – dihitung aktivitas dan

aktivitas spesifik pada setiap tahap

purifikasi

• Aktivitas (Unit) enzim = jumlah protein

yang dapat mengubah 1 mol substrat

menjadi produk per menit pada suhu 25

o

C pada pH optimum

Homogenat

supernatan presipitat

Am.sulfat

Krom. Pert. Ion

Gel filtrasi

Krom. Afinitas

Vol,kdr protein,Akt,AS

Volume, kadarprotein,

Akt,AS

Fraksinasi

Vol,kdrprotein,Akt,AS–pilih fraksidenganAS paling_

Vol,kdr protein,Akt, AS–pilihfraksi denganASpaling _

Vol,kdr protein,Akt,AS–pilihfraksi denganASpaling _

1pita Enzimmurni

Elektroforesis

Tahap

Homogenat

Presipitat

Krom Pert Ion

Filtrasi gel Krom Afinitas Vol fraksi (mL) 1.400 280 90 80 6 Prot total (mg) 10.000 3.000 400 100 3 Aktivitas (U) 100.000 96.000 80.000 60.000 45.000 Akt Spesifik (U/mg prot) 10 32 200 600 15.000