Te k n ik D N A da n ge n e t ik pa da st u di
P
ETER
K
OPP AND
J. L
ARRY
J
AMESON
diterjemahkan bebas (tanpa ijin) oleh D. Lyrawati
untuk membantu peserta Instrumentasi Biomedik S2 Universitas Brawijaya
Analisis DNA m olekuler t elah m enj adi bagian int egral pada sem ua bidang spesialisasi k edok t er an. Walaupun genom m anusia berukuran sangat besar dan kom pleks, nam un kem aj uan yang dicapai saat ini dalam proy ek genom m anusia Hum an Genom e Proj ect ( HGP) t elah sangat m eningk at kan penget ahuan k it a m engenai dasar - dasar penyakit pada m anusia. Analisis DNA m olek uler dan genet ik m em berikan dam pak yang t idak sedikit di klinik diant aranya adalah digunak annya pendek at an bar u unt uk m endiagnosis penyak it , m endet eksi pat ogen, skr ining fakt or predisposisi penyakit , konseling genet ik , pengem bangan obat , farm akot erapi dan, unt uk beberapa kasus, t erapi gen.
Lebih dari 3000 penyakit m anusia diket ahui disebabkan oleh adanya cacat pada sat u gen t unggal dan yang dit urunkan sesuai dengan hukum Mendel. Selain it u, banyak proses penyakit dipengar uhi oleh lat ar belak ang
genet ik (genet ic background) si penderit a. Ser ingkali
dit em ui adanya int eraksi yang kom plek s ant ara fakt or lingkungan dan predisposisi genet ik . Banyak diant aranya ( m isalnya hipert ensi, peny akit ar t er i j ant ung, asm a, diabet es) t er m asuk golongan penyakit yang m enj adi m asalah kesehat an um um ut am a dan unt uk m enget ahui pat ogenesis penyakit t ersebut m asih m er upakan t ant angan yang sangat besar. Bent uk lain dari penyakit genet ik adalah sindrom a yang disebabkan oleh aberasi krom osom dan sindrom a kanker yang m enurun, sert a defek pada DNA sel som at ik yang j uga t erj adi pada kanker.
D N A da n t r a n sm isi in for m a si ge n e t ik. Makrom olek ul DNA unt ai ganda m engandung infor m asi genet ik . DNA t erdiri dari dua unt ai yang saling kom plem en dan m elilit m em bent uk heliks ganda (double helix) . Set iap unt ainy a berdasarkan sifat kom plem en yang sangat ket at , set iap unt ai dapat bert indak sebagai cet akan unt uk m em bent uk unt ai baru. Replikasi sem ikonservat if ini akan m enj am in bahw a t iap sel yang m em belah akan m enerim a salinan DNA yang ident ik.
Unt uk suat u gen, pada bagian sekuens yang m enyandi (coding sequence) , t iap set yang t er dir i dar i 3 basa DNA akan m em bent uk kodon, kode genet ik unt uk m enginkorporasikan salah sat u dari 20 asam am ino yang t erdapat dalam prot ein ( Gam bar 2- 1) . Dengan dem ik ian sat u seri kodon akan m enet ukan asam am ino yang ak an disint esis m enj adi sat u polipept ida t ert ent u. I nst r uk si
penyandi- prot ein pada DNA y ang m enyandi suat u gen akan dit ranskripsikan m enj adi m RNA. m RNA ini dit ranslokasik an dar i int i ke sit oplasm a, t em pat t er j adinya t ranslasi oleh ribosom , dit erj em ahkan m enj adi unt aian asam am ino ( sint esis prot ein) .
Penj elasan yang m endet il m engenai t eknik genet ik m olekuler t idak akan dibahas pada bab ini, sedangk an beberapa konsep dasar dan t eknik yang esensial dan berguna unt uk analisis genom dan penyak it genet ik t elah dibahas pada bab Teknik Rek om binan.
Uk u r a n da n or ga n isa si ge n om m a n u sia. Genom disandi oleh polim er DNA yang t erpisah m enj adi beberapa segm en, yang disebut krom osom . Pada m anusia, set iap sel Hanya sebagian kecil pada lengan pendek dari krom osom X dan krom osom Y, pseudoaut osom al region ( PAR) , yang
Sat u gen t erdiri dar i sekuens DNA regulat or, sekuens penyandi ( ekson) dan sekuens int ron. Sekuens suat u gen yang m enyandi prot ein t erlet ak pada ek son, yang dipot ong
dan disam bung kem bali (splice) m em bent uk m RNA.
Berdasarkan j um lah m RNA yang diekspresik an, diperk irakan genom m anusia m engandung 70.000 sam pai 10.000 gen. Ukuran dan st rukt ur gen sangat bervar iasi. Gen- gen kecil t erdiri dari beberapa rat us pasangbasa, sedangkan gen t erbesar yang diket ahui saat ini, gen pada krom osom X yang m enyandi prot ein dist ropin, m engandung 2 x 106 pb dengan lebih dar i 100 int ron. Mut asi pada gen ii
m engakibat kan 2 kondisi klois yang berbeda, Duchene
Muscular Dyst r ophy ( DMD) dan Becker Muscular Dist r ophy ( BMD) . Beberapa daerah krom osom , t erut am a daerah dekat sent rom er , t idak m engandung gen, sedangk an daerah lain m engandung banyak sekali gen. Terkadang, gen berk elom pok m enj adi k lust er di m ana beberapa salinan gen dengan fungsi yang m irip berdekat an sat u sam a lain. Cont oh klust er gen adalah gen horm on per t um buhan, at au
gen yang m enyandi globin dan . Tapi ada j uga, gen- gen
dengan fungsi yang ham pir sam a t er let ak pada krom osom yang berbeda.
Ga m ba r 2 - 1 Kode genet ik. Kodon suat u asam am ino t erdiri dari t iga nukleot ida ( t riplet ) . Sat u asam am ino dapat disandi oleh beberapa kodon yang berbeda ( degener asi kode genet ik) . Sekuens unt uk kodon st ar t dan kodon st op
t er m asuk j uga kode genet ik.
kuen t unggal, m elainkan t erdiri dari sekuen berulang
dengan berbagai t ipe. Shor t int er sper sed r epet it ive
elem ent s (SI NE: 100- 500 pb) dan long int er persed r epet it it ive elem ent s (LI NE: 6000- 7000 pb) t er sebar pada genom . Bent uk lain sekuens berulang, m ik rosat elit , t erdir i dari 10- 50 salinan ber ulang dari sekuens y ang sederhana. Fungsinya belum j elas, t api sekuens dem ikian dapat digunakan sebagai alat unt uk pem et aan genet ik dan linkage.
M it osis da n m e iosis. Unt uk keperluan pert um buhan dan perkem bangan j aringan, sel eukar iot ik m engalam i sik lus pem belahan sel dan diferensiasi. Tiap pem belahan sel ( m it osis) m enghasilkan 2 sel diploid ( set krom osom 2n) yang ident ik secara genet ik . Pada t ahap awal m it osis t iap krom osom parent al diduplik asi, m enghasilkan 2 pasang krom at id ( 2n4n) . Krom osom kem udian m em endek dan m em bran int i m enghilang. Pada m et afase, krom osom t ersusun pada bagian ek uat orial. Kedua krom at id yang kem bar berada pada sent r om er, m elekat pada spindel m it ot ik. Kem udian krom at id akan berpisah dan m igrasi ke uj ung yang saling berlaw anan. Set elah m em bran int i t erbent uk m engelilingi m asing- m asing krom at id, sel m em belah dan t erbent uklah dua sel diploid.
Gam et , oosit dan sper m , m engandung hany a sat u salinan unt uk t iap krom osom , sat u set krom osom haploid. Ket ika sper m m em fer t ilisasi sel t elur , kedua set kr om osom haploid bergabung, m em bent uk sat u zigot yang m engandung 2 salinan unt uk t iap krom osom ( diploid at au 2n) . Pem bent ukan gam et haploid dari sel germ inal diploid ( oogonia, sperm at oonia) t erj adi m elalui proses m eiosis, yang t erdir i dari 2 pem belahan sel. Selam a pem belahan m it ot ik pert am a, t erj adi pert ukaran ant ara krom osom -krom osom yang hom olog sehingga m enghasilkan gam et yang secara genet ik berbeda. Set elah pem bent ukan 2
krom at id ( 2n4n) , krom osom yang hom olog berpasangan
dan m em bent uk chiasm at a ( Gam bar 1- 2) . Salah sat u dar i kedua krom at id dapat berpasangan dengan krom osom yang
hom olog dan m engalam ai proses crossing- over, di m ana
segm en krom osom dari ibu (m at ernal) m engalam i
rekom binasi dengan krom osom hom olog dari ayah (pat ernal) m em bent uk krom osom hibrid m enggant ikan krom osom asal. Rekom binasi dem ik ian sering t erj adi, dan
nam pak nya t erdapat sat u chiasm a pada t iap lengan
krom osom . Set elah pert ukaran ini selesai, krom osom ak an disegregasikan secara acak. Karena ada 23 krom osom ,
m aka ada 223 ( > 8 j ut a) kem ungkinan kom binasi
krom osom . Bersam a dengan pert ukaran yang t erj adi selam a r ekom binasi, segregasi krom osom m enghasilkan diversit as ( keanekaragam an) genet ik gam et yang sangat t inggi. Set elah pem belahan m eiosis pert am a, yang m enghasilkan dua sel ( 2n) , k edua krom at id pada t iap krom osom ak an t erpisah selam a proses pem belahan m eiosis k e dua sehingga ak an dihasilkan 4 gam et yang m asing- m asing m em ilik i sat u krom at id ( 1n) .
Ga m ba r 2 - 2 Crossing- ov er dan rekom binasi. Selam a
pem bent ukan chiasm a, salah sat u dari kedua krom at id
pada sat u krom osom berpasangan dengan sat u krom at id
krom osom hom olog. Rekom binasi genet ik m elalui
crossing-over m enghasilkan segm en krom osom rekom binan dan
nonrekom binan pada gam et . Rekom binasi dem ik ian seringkali t erj adi, dan bersam a- sam a dengan segr egasi
acak krom osom m at ernal dan pat ernal, m aka ak an
m engakibat kan keanekaragam an genet ik pada gam et .
Ge n ot ip da n fe n ot ip. Sat u segm en DNA yang dit urunkan sesuai dengan hukum Mendel ( m isalnya gen) disebut lokus ( locus, j am ak: loci) . I nform asi genet ik pada sat u lokus gen disebut sebagai genot ip. Perbedaan urut an DNA, yang berart i j uga per bedaan genot ip, disebut alel
( allele) . Jika dua alel ada pada sat u lokus, m aka ada t iga
Fenot ip adalah karakt erist ik yang dapat dilihat at au diukur pada sat u individu. I st ilah w ild t y pe dipakai unt uk m enerangkan/ m eruj uk pada gen yang norm al, t er m asuk varian alel yang berbeda. Genot ip m ut an t idak selalu m engubah fenot ip. Jika fenot ip alel m ut an dapat dikenali pada kondisi hom ozigot , berart i alel dem ikian adalah resesif. Jika kedua alel dapat dikenali pada kondisi het erozigot , berart i alel- alel bersifat kodom inan ( m isalnya alel A dan B pada sist em golongan darah ABO) .
et nik yang berbeda. Polim orfism e biokim ia, yang t idak langsung dapat dianggap sebagai fenot ipe, j uga dapat t erdet ek si pada banyak prot ein nor m al yang t erdapat pada berbagai bent uk pada suat u populasi. Varian dem ikian dapat dij elaskan karena adanya m ult ipel alel pada t ingk at gen. Polim orfism e dem ikian ant ara lain t er lihat pada sist em golongan darah ABO. Hasil analisis genet ika m olek uler m enunj ukkan bahw a t ernyat a variasi genet ik sangat banyak. Set iap 1 dar i 200 pb pada genom m anusia ber sifat polim orfik , t erut am a pada daerah genom yang t idak
m enyandi (noncoding) , t erm asuk di ant aranya
perubahan/ per bedaan sat u pasangan basa dan variasi
sekuens ber ulang (r epet it ive sequence) . Suat u
polim orfism e dapat m engubah sekuens prot ein j ika polim orfism e t erlet ak pada daerah penyandi (coding region) dan subst it usi t ersebut m engubah asam am ino yang disandi oleh kodon t ert ent u. Polim orfism e dit urunkan secara
Mendel, sat u sifat yang ber guna unt uk st udi linkage dan
unt uk aplikasi forensik.
Polim orfism e m ungk in t idak m em pengar uhi fenot ip, at au hanya berperan pada keanekaragam an populasi dan t idak berasosiasi dengan penyakit . At au, polim orfism e m ungk in m em pengaruhi kerent anan t erhadap, at au ekpresi suat u penyakit t er t ent u. Keanekaragam an genet ik yang t inggi akan m eningkat kan kem am puan suat u populasi unt uk beradapt asi t erhadap perubahan lingkungan, dan m enurunkan r esiko penyak it resesif.
H e t e r oge n it a s ge n e t ik Het erogenit as genet ik adalah perubahan fenot ip yang nam paknya m irip w alaupun defek ( cacat ) t erj adi pada gen yang berbeda. Misalny a,
het erogenit as genet ik pada Mat ur it y - Onset Diabet es of
Young ( MODY), yang dapat disebabkan oleh defek pada gen glukokinase, at au pada gen yang m enyandi HNF- 1 ( Hepat ocy t e nuclear fact or- 1) at au HNF- 4.
Het erogenit as alel at au int ragen adalah perubahan genot ip pada lokus yang sam a yang m engakibat k an fenot ipe yang sam a at au m ir ip. Pada cy st ic fibrosis, lebih dari 600 m ut asi t elah diket ahui pada gen yang m enyandi prot ein regulat or kondukt ans t ransm em bran cyst ic fibr osis (cyst ic fibr osis t ransm em brane condunt ance regulat or prot ein, CFTR) . Pada het erogenit as alel, st udi linkage ak an m engident ifikasi lokus y ang sam a. Sebaliknya, het erogenit as genet ik m enghasilkan fenot ip yang m irip, t api
analisis linkage akan m engident ifikasi lokus- lokus yang
berbeda pada keluarga yang berbeda.
Re st r ict ion e n don u cle a se. Endonuk lease rest r iksi adalah enzim bakt eri yang m engenal dan m em ot ong DNA pada sekuens nukleot ida yang t er t ent u, disebut sit us rest r iksi ( lihat bab Teknik Rekom binan) . Sit us rest r iksi yang paling banyak adalah sekuens 4- 6 pb. Banyak dari sekuens ini ber sifat palindr om ik ( sim et r i pada dua aksis) . Pada suat u fragm en DNA secara acak enzim rest r iksi yang m engenal sekuens 4- basa akan m enem ukan t arget
sekuensnya set iap 44 ( 256) basa, sedangk an pem ot ong
6-basa set iap 46 ( 4036) basa. Pem ot ongan yang t er j adi
dapat m enghasilkan DNA uj ung t um pul (blunt end) at au
uj ung pendek ‘runcing’ unt ai t unggal DNA (cohesive/ st icky
end) . Kem am puan m enggunakan enzim endonuklease
rest r iksi sangat pent ing unt uk m anipulasi DNA, yang ant ar a lain dapat diaplikasikan unt uk analisis Sout her n dan kloning fragm en DNA. Jika variasi sekuens m engak ibat k an hilangnya at au sebaliknya t im bulnya sit us rest r iksi, m aka
disebut polim orfism e panj ang fragm en r est r iksi (RFLP) . Marker polim or fik ini dapat digunakan unt uk st udi linkage.
PCR Polym erase chain react ion ( PCR) , dik enalkan pada 1985, t elah m engubah car a m enganalisis DNA secar a berm akna, dan t elah m enj adi dasar biologi m olekuler dan analisis genet ik. PCR m em ungkinkan unt uk m em perbany ak segm en DNA t ert ent u sam pai j ut aan kali lipat . Pada t ahap kem udian disint esis dengan DNA polim er ase. Prosedur ini biasanya diulang sek it ar 30 kali m enggunakan blok
pem anas ot om at is. Pada t iap siklus, sem ua dsDNA y ang
ada dari siklus sebelum ny a bert indak sebagai cet akan. Karena pada akhir t iap sik lus j um lah DNA m enj adi dua k ali lipat , m aka j um lah DNA yang direplikasi akan m eningk at secara eksponensial.
Ga m ba r 2 - 3 Polym erase Chain React ion ( PCR) . PCR
m enghasilkan salinan segm en DNA t er t ent u dalam j um lah
banyak. DNA unt ai ganda (double st randed, ds) didenat
ura-si, pr im er oligonukleot ida sint et is spesifik sepanj ang 20
basa dit em pelkan (annealed) pada kedua sisi segm en yang
dikendaki, dan unt ai kom plem ent er disint esis oleh DNA polim erase yang t ahan panas. Pada t iap siklus, sem ua
Rever se- t ranscript ase- PCR ( RT- PCR) adalah salah sat u st rat egi lain y ang pent ing unt uk analisis m olekuler . Mat er i awal yang dipakai dalam hal ini adalah m RNA. m RNA t ersebut dit ranskrip- balik m enj adi cDNA dengan enzim reverse t ranscript ase ( sint esis unt ai- pert am a) . Kem udian, segm en cDNA dapat diperbanyak dengan cara PCR seper t i yang t elah dit erangkan sebelum nya.
Se k u e n sin g D N A Beber apa prot okol t elah dikem bangkan unt uk m enent ukan sekuens nukleot ida DNA. Pada dua m et ode t radisional ( Maxam - Gilbert dan Sanger ) , cet akan DNA digunakan unt uk m em buat fragm en DNA, yang berbeda ukuran. Menggunakan elekt roforesis gel resolusi t inggi, m olekul DNA dipisahkan pada t ingk at resolusi sat u basa, sehingga sek uens cet akan DNA dapat diperk irakan. Sekuensing Maxam - Gilbert m em anfaat k an zat kim ia yang m em ot ong DNA pada basa t ert ent u, sehingga dihasilkan fragm en- fragm en dengan panj ang yang berbeda. Pada sek uensing m et ode Sanger, r ant ai DNA dengan berbagai panj ang dibuat dengan m enggunak an
dideoksinukleot ida unt uk m enghent ikan ext ension DNA oleh
DNA polim erase (chain t er m inat ion m et hod) . Dengan
m engelekt roforesis 4 reak si secara paralel ( sat u unt uk t iap
dideoksinukleot ida) dan m em isahkan pr oduk ext ension
secara elek t roforesis pada gel poliakrilam id, m aka dapat dilak ukan penent uan sekuens DNA cet akan. Prosedur
ot om at is biasanya didasarkan pada m et ode chain
t er m inat ion dan m enggunakan dideoksinukleot ida at au
prim er yang dilabel fluorescent, kem udian diikut i dengan
analisis sek uens langsung dengan kom put er . Cont oh sekuensing dapat dilihat pada Gam bar 2- 4.
Saat ini sedang dikem bangk an t ek nologi sekuensing DNA yang lebih cepat , lebih sensit if dan lebih hem at biaya. Met odologi yang diek splorasi ant ara lain det eksi basa yang
dilabel fluorescent pada flow cyt om et ry, pem bacaan
langsung sek uens basa unt ai DNA m enggunakan scanning,
t unneling, at au m ikroskopi at om ic force, analisis spekt roskopi m assa, dan analisis sekuens m enggunak an
chips DNA yang m engandung banyak koleksi oligonukleot ida unt uk dapat m enghibridisasikan DNA.
Sit oge n e t ik da n Flu or e sce n t in Sit u H ibr idiza t ion ( FI SH) Krom osom dapat dicat dan dilihat m enggunak an m ikroskop cahaya. Krom osom m enunj ukkan pola pit a yang khas elap dan t erang yang m enggam barkan variasi regional kom posisi DNA. Perbedaan ukuran pola pit a ( banding) m em ungkinkan kit a unt uk m em bedakan ke22 krom osom ot osom dan k rom osom sex unt uk m em nent ukan karyot ip seorang individu. Analisis sit ogenet ik ini dapat m enunj ukkan adanya ket idaknorm alan pada krom osom , t er m asuk adanya krom osom yang hilang at au sebaliknya bert am bah ( t erlalu banyak ) , delesi besar , inser si, at au t ranslokasi.
Fluorescent in sit u hibridizat ion ( FI SH) m er upakan gabungan dari sit ogenet ik konvensional dan hibr idisasi DNA. Krom osom dipersiapkan dari sel berint i dan dihibr idisasi dengan probe DNA yang dilabel fluorochrom e yang spesifik unt uk berbagai lokus. Aberasi num erik dan st ruk t ur dapat didet eksi dengan m enganilisis pola fluor esensi/ pendar an. FI SH m ulai m enggant ik an cara analisis sit ogenet ik konvensional. Resulusi FI SH yang t inggi berguna unt uk diagnosis dan j uga unt uk m em buat pet a krom osom . Jika digunakan krom osom int erfase, probe FI SH dapat m eningkat kan r esolusi pet a sam pai ~ 100.000 pb.
Pe m e t a a n ge n Karena ukuran dan sedem ikian kom pleksnya genom m anusia, unt uk m enget ahui ident it as
Ga m ba r 2 - 4 Sekuensing DNA ot om at is m enggunakan dideoksinukleot ida yang dilabel fluorescent . Diant ar a
banyak m et ode sek uensing DNA, m et odologi chain
t er m inat ion adalah prosedur yang paling banyak dipakai, t er m asuk penggunaan prosedur ot om at isnya yang t er us m eningkat . Pr osedur ot om at is m enggunakan dideoksinukleot ida ( at au prim er ) yang dilabel fluor escent
dan analisis sekuens dilakukan langsung m elalui kom put er . Prim er sek uensing dit em pelkan pada cet akan DNA. Dideoksinuk leot ida yang m engandung label fluorescent yang berbeda dit am bahk an ke dalam reak si unt uk m enghent ikan polim er isasi DNA. Dideoksinuk leot ida berkom pet isi dengan deoksinukleot ida ( nukleot ida nor m al)
pada reaksi ex t ension DNA, j ika dideoksinukleot ida yang
t erinkorporasi pada saat polim er isasi/ ex t ension m aka r eaksi polim er isasi akan berhent i karena nuk leot ida baru t idak dapat dit am bahkan pada uj ung 3’nya. Hasil reaksi ini dipisahkan dengan elekt roforesis, yang kem udian langsung dianalisis dengan kom put er .
Ga m ba r 2 - 5 Pet a kandungan STS Ada at au t idaknya STS, frgam en pendek DNA yang diket ahui sekuensnya, dapat dit ent ukan dalam berbagai klon krom osom ragi t iruan (yeast art ificial chrom osom es, YACs) . Perbandingan ant ara sekuens STS dalam beberapa klon YAC m em ungk ink an unt uk m enent ukan urut annya.
Pet a genet ik m enent ukan posisi relat if gen at au lokus berdasarkan frekuensi rekom binasi r elat if t erhadap lokus-lokus lain pada krom osom y ang sam a. Hal ini dinyat ak an sebagai unit rekom binasi at au cent iMorgans ( cM) . Pet a genet ik ~ 40% lebih panj ang pada krom osom yang diperoleh dari w anit a karena frekuensi rekom binasi yang lebih t inggi selam a pem bent ukan sel t elur (oocyt e) . Sekuen polim orfik apapun yang dapat diikut i pola penurunannya berguna unt uk pem et aan. Salah sat u cont oh m arka yang berguna
adalah RFLP dan m ikrosat ellit e repeat s. Pet a genet ik
kem udian disusun berdasarkan st udi linkage yang m enguj i
seberapa sering dua m ark a dit urunkan bersam a- sam a. Lokasi krom osom at au gen yang bert anggung j aw ab unt uk suat u penyakit yang m enur un dapat dit ent ukan dengan m engikut i pola penurunan m arka DNA.
Posisi lokus- lokus pada pet a fisik dit unj ukkan dengan nilai absolut . Berbagai pet a fisik berbeda t ingkat resolusinya. Pet a sit ogenet ik at au krom osom m enent ukan posisi relat if lokus genet ik pada pit a krom osom khas yang t eram at i di baw ah m ikrokop cahaya. Pet a cDNA m em ungkinkan unt uk m elakukan analisis daerah genom yang diek spresikan. Set elah cDNA disint esis dari m RNA
m enggunakan reverse t ranscr ipt ase, asal cDNA dapat
dipet akan pada daerah krom osom t er t ent u dengan cara
hibr idisasi. Sequence- t agged sit es ( STS) adalah segm en
pendek DNA y ang diket ahui lokasinya pada pet a genet ik. STS dapat digunakan unt uk koleksi fragm en DNA yang
Ga m ba r 2 - 6 Analisis linkage pada m ult iple endocr ine
neoplasia t ype 1 ( MEN- 1) ( A) . Sk em a krom osom m anusia 11 yang m enggam barkan posisi gen MEN- 1 pada pit a q13. Pada individu m anapun, t erdapat alel dari bapak (pat er nal)
dan ibu (m at ernal) unt uk MEN 1. Mar ka m ikrosat elit
hipot et is A dan B dit unj ukkan di dekat lokus MEN 1. Marka A lebih dekat pada gen MEN 1. Genot ipe didefinisik an berdasarkan j um lah ulangan pada m ik r osat elit , sedem ik ian rupa sehingga alel bapak ( pat ernal) adalah ‘3- 4’ dan alel ibu ( m at ernal) adalah ‘2- 2’. Ber dasar kan pedigr ee ( at au sekuensing DNA kalau ada) , genot ipe 3- 4 t er lihat
berhubungan (link) dengan gen MEN 1. ( B) . Silsilah
keluarga yang penderit a MEN- 1. Alel anggot a keluarga dit andaidengan genot ipe berdasarkan m ik rosat elit pada A dan B. Penyakit dibaw a oleh anggot a keluarga yang m em puny ai alel ‘3- 4’ ( t ebal) . Baik penderit a m aupun pem baw a dit andai dengan ar sir. Per hat ikan bahw a laki- laki pada generasi ke I I , yang bukan m erupakan bagian dari keluarga yang asli, j uga m em punyai ale ‘3- 4’, t et api t idak m enderit a, hal ini m enunj ukkan bahwa genot ipe khusus ini
hanya berhubungan (link) unt uk sat u keluarga ini, t idak
unt uk populasi um um .
diklon ke dalam yeast ar t ificial chrom osom es ( YACs). Ada at au t idak nya STS t er t ent u pada suat u fragm en klon daapt dibandingkan dengan YACs lain unt uk m engident ifikasi k lon yang overlap. Dengan cara ini DNA y ang berdekat an ( cont igs) dapat dikarakt erisasi ( Gam bar 2- 5) . Pet a fisik dengan resolusi t inggi akan dapat m enunj ukkan sekuens DNA kom plit pada t iap krom osom dalam genom m anusia.
Lin k a ge Linkage genet ik m erupakan dasar unt uk penyusunan pet a genet ik, dan digunakan unt uk m endet ek si
gen baru dengan cara posit ional cloning. Linkage j uga
penyakit t er t ent u. Syarat unt uk analisis linkage adalah adanya berbagai polim orfism e sek uens, m isalnya RFLP, perbedaan j um lah repeat s berdekat an ( v ariable num ber of t andem repeat s/ VNTR), aTau m ikrosat elit , yang digunakan unt uk m em bedakan asal alel (parent al origin) . Lok us gen pada kroosom orangt ua dapat m engalam i r ekkom binasi at au t et ap (nonrecom binant) . Frekuensi rekom binasi yang t eram at i ant ar a dua lokus m erupakan fungsi dari j arak ant ar lokus dan dinyat akan sebagai cent iMorgan ( cM) . Jik a frekuensi rekom binasi ant ar a dua lokus adalah 1% , m aka kedua lokus t ersebut dikat ak an berj arak 1 cM ( 1 cM adalah ~ 1Mb DNA) . Karena frek uensi rekom binasi m eningkat sesuai dengan j arak genet ik, m aka m ak in dekat j arak ant ar dua lok us berart i m ak in t inggi kem ungkinan bahw a
keduanya dir urunkan secara bersam a- sam a (genet ic
linkage) . Sat u set m arka yang sangat berdekat an dan
dit urunkan bersam a- sam a akan m em bent uk haplot y pe.
Lokus DNA diident ifikasikan dengan nom enklat ur spesifik. Misalnya, lok us D7S525 ber ar t i kr om osom m anusia 7, segm en 525, dan t er let ak pada lengan pendek kr om osom 7.
Unt uk m engident ifikasi lokus krom osom yang dit urunkan (segr egat e) bersam a- sam a suat u penyak it , perlu dilakukan penent uan genot ipe DNA sam pel dari sat u at au lebih silsilah
keluarga (pedigree) . Set elah it u, kit a akan dapat
rekom binasi dan akan m em peroleh nilai linkage y ang lebih
t inggi. Dat a y ang diperoleh dari karakt erisasi banyak lok us kem udian dianalisis dengan program kom put er. Link age biasanya dinyat akan sebagai nilai Lod (logar it hm of odds) , yang m erupak an rasio kem ungkinan bahw a suat u penyakit dan m arka t er t ent u m em punyai hubungan (linked) . Nilai
Lod dinyat ak an sebagai logarit m a dasar 10 yang
m enunj ukkan bahw a angka posit if berart i berhubungan (linkage) dan angka negat if berar t i t idak berhubungan (nonlinkage) . Nilai Lod + 3 ( 1000: 1) biasanya dianggap
m enunj ukkan adanya linkage, sedangkan nilai - 2 berart i
t idak ada linkage.
Cont oh penggunaan analisis linkage dit unj ukkan pada
Gam bar 2- 6. Dalam kasus ini, gen penyakit ot osom al
dom inan, m ult iple endocrine neoplasia t ype 1 ( MEN- 1),
diket ahui ber lokasi pada krom osom 11q13. Marka m ikrosat elit polim orfik hipot et is berada cukup dekat dengan gen MEN- 1, yang m enyandi prot ein m enin ( saat ini belum dik et ahui fungsinya) . Pada pedigree t er lihat pada generasi I kak ek ( penderit a) m em baw a alel 3 dan 4 pada krom osom dengan gen MEN- 1 t er m ut asi dan alel 2 dan 2
pada kr om osom 11 lainnya. Sesuai dengan linkage
genot ipe 3/ 4 pada lokus MEN- 1, pada generasi I I anak laki-lakinya j uga pender it a, sedangkan anak perem puannya ( yang m ew arisi genot ip 2/ 2 dari ayahnya) bukan pender it a. Pada generasi ke t iga, t ransm isi genot ipe 3/ 4 m enunj uk kan resiko t erj adinya MEN- 1, dengan anggapan t idak t erj adi rekom binasi genet ik ant ara alel 3/ 4 dan gen MEN- 1. Jika m ut asi spesifik dalam gen MEN- 1 dapat diident ifikasi dalam keluarga t ersebut , m aka t ransm isi m ut asi it u sendir i dapat diik ut i, dengan dem ikian dapat m enghilangkan keraguan yang disebabk an oleh adany a rekom binasi.
Klon in g ge n DNA dapat diperbanyak dengan kloning fragm en DNA ke dalam vekt or yang sesuai yang dapat dipropagasikan ke dalam sel host. Vek t or - vekt or t er sebut ant ara lain m olekul DNA yang diperoleh dari virus, bakt er i,
at au ragi yang dapat m elakukan replikasi t anpa t ergant ung
pada genom sel host. Set elah vekt or dan DNA yang ak an
disisipkan didigest i dengan enzim rest r iksi, vekt or dan DNA dapat digabung m enggunak an DNA ligase. Vekt or yang m em baw a fragm en kem udian dipindahkan ke dalam sel
host ( bak t eri, ragi at au sel eukarit ik) unt uk ber eplikasi. Dengan cara ini dapat diper oleh sej um lah besar DNA unt uk st udi ekperim ent al lebih lanj ut .
Manipulasi dem ikian dapat dilakukan unt uk m em perbanyak fragm en DNA t unggal, at au unt uk m em buat
library di m ana sem ua fragm en yang berasal dari DNA genom akhirnya akan dir epresent asikan sebagai koleksi koloni. Pada prinsipnya libr ar y genom adalah fragm en dar i
seluruh genom yang diklon. Library genom j uga dapat
dibuat dar i krom osom t unggal yang t elah diseleksi m enggunakan fluorescence- act ivat ed cell sort ers ( FACS).
Library cDNA dapat dibuat m enggunakan m RNA j aringan t ert ent u. Beberapa m odifik asi dapat dilakukan unt uk m eningkat kan j um lah m RNA spesifik ( m isalnya dengan seleksi poly( A) at au ber dasarkan uk uran) , sehingga kem ungkinan unt uk m em peroleh klon spesifik j uga lebih t inggi.
Set elah libr ar y dipersiapkan, langkah berik ut nya adalah m engisolasi k lon rekom binan yang m engandung sek uens genom at au gen penyandi. Jika t er dapat infor m asi m engenai prot ein yang disandi, m ikrosek uensing sekuens sebagian asam am ino akan m em ungkinkan unt uk m ensint esis oligonukleot ida berdasarkan kode genet ik.
Karena kode genet ik ada beberapa (degeneracy) , st rat egi
ini m enggunakan sekelom pok oligonukleot ida. Oligonukleot ida dilabel radioakt if dan dihibridisasi pada k lon
library. Klon dengan sinyal posit if diisolasi dan diperbany ak. Sekuensing fr agm en DNA yang disisipkan pada vek t or t ersebut akan dapat m em berikan infor m asi, walaupun hanya sebagian, m engenai gen yang dit elit i.
Kloning gen j uga dapat dilakukan t anpa m enget ahui t erlebih dahulu inform asi m engenai prot ein yang berkait an. St rat egi ini disebut posit ional cloning at au reverse genet ic
( Gam bar 2- 7) . Pendekat an ini m ulai dikenal pada akhir 1980an dan t elah ber hasil m engident ifikasi banyak gen t er m asuk gen penyebab cy st ic fobrosis, Duchenne m uscular dyst rophy , polycyst ic k idney disease, dan sindrom a MEN. Langkah per t am a t erdiri dari penet apan genet ic linkage anat ra fenot ipe penyak it dan m arka DNA. Hal ini m em ungkinkan unt uk m enent ukan krom osom yang m engandung gen kandidat . I dent ifikasi m ar ka- m arka yang t erlet ak dekat dengan gen m enj adi t it ik aw al unt uk
m elakukan chrom osom e walking at au j um ping, bergerak
m endekat i gen yang ingin diket ahui. Met ode ini dapat digunakan unt uk skrining DNA yang t erlet ak di ant ara m aka- m arka unt uk m enget ahui adanya gen y ang fungsional. Jika sat u at au beberapa kandidat gen t erident ifikasi, gen- gen t ersebut dapat diklon dan disekuensing. Langkah t erakhir adalah m enunj uk kan bahwa gen y ang t elah diisolasi t ersebut m engandung m ut asi yang dit urunkan (segr egat e) bersam a- sam a dengan penyakit .
M u t a si Mut asi, secara luas, didefinisikan sebagai perubahan pada sekuens prim er nuk leot ida DNA, t anpa m em per hat ikan akibat / konsekuensi fungsionalnya. Mut asi
yang t erj adi pada sel germ inal (ger m cell) ak an
Ga m ba r 2 - 7 Posit ional cloning. Skem a garis besar langkah- langk ah ident ifikasi suat u gen penyakit dengan cara posit ional cloning.
t erbat as pada sekelom pok sel pada suat u j aringan, berperan pent ing pada pem bent ukan neoplasm a. Dengan perkecualian pada t riplet repeat s yang dapat m akin panj ang, m ut asi biasany a bersifat st abil ( Tabel 2- 1) .
Secara st ruk t ural, m ut asi sangat bervar iasi. Mut asi dapat m elibat k an seluruh genom e seper t i yang t erj adi pada t riploi, m aupun perubahan st rukt ur at au j um lah krom osom . Delesi besar dapat m em pengaruhi bagian dari gen, seluruh gen at au j ika beberapa gen t erlibat , m ut asi dapat berak ibat pada sindrom a. Persilangan yang t idak seim bang anat ar a gen- gen yang hom olog dapat m engak ibat kan m ut asi fusi gen, sepert i pada but a w arna. Mut asi dapat j uga m elibat kan perubahan pada beberapa at au sat u pasang
basa. Mut asi sat u basa disebut m ut asi t it ik (point
m ut at ion) . Analog dengan perubahan krom osom , m ut asi t it ik m ungk in t erdir i dari subst it usi, delesi at au inser si. Subst it usi disebut t ransisi j ik a basa purin digant ikan oleh basa pur in lain ( AG) at au pir im idin digant ikan oleh pirim idin lain ( CT) . Perubahan dar i purin ke pir im idin at au sebalik nya disebut t r ansver sI . Delesi at au insersi m eny ebabkan pergeseran pem bacaan k odon basa yang dit erj em ahkan m enj adi asam am ino (shift of t ranslat ional reading fram e) , yang biasanya m enyebabkan
penghent ian/ st op yang lebih awal (nonsense m ut at ion) .
Mut asi pada daerah int ron dapat m enghilangkan at au
m enim bulkan sit us awal/ ak hir pem ot ongan (splice donor
at au splice accept or sit es) , yang m engakibat kan pot ongan (spliced) m RNA gen yang t erm ut asi m enj adi t idak nor m al. Mut asi j uga dapat dit em ukan pada sekuens regulat or suat u gen dana dapat m enyebabkanberkurang at au t idak adany a t ranskr ipsi gen yang bersangkut an.
Ga m ba r 2 - 8 Sout her n blot Sout hern blot dapat
digunakan unt uk m endet eksi perubahan pada st ruk t ur gen
( m isalnya delesi, insersi, variable num ber t andem
repeat s/ VNTR) , at au rest ict ion fragm ent lengt h polym orphism ( RFLP) . DNA genom didigest i dengan sat u at au beberapa enzim rest r ik si. Hasil digest i dipisahkan dengan gel agarose dan dit ransfer ke m em br an. Hibr idisasi DNA, yang t elah diim obilisasi, dengan pr obe yang dilabel radioakt if m em ungk inkan unt uk m endet eksi fragm en t ert ent u secar a radiografi. Sepert i t er lihat pada gam bar, RFLP dapat m enghasilkan per bedaan panj ang fragm en yang didet eksi. Polim orfism e dem ik ian digunakan pada st udi
linkage unt uk m enilai apak ah suat u penyakit dit ur unk an
bersam a- sam a (cosegregat e) dengan m arka genet ik
t ert ent u.
kedua nor m al alel secara som at is pada seorang indiv idu
dengan efek heredit er pada alel yang lain (her edit ar y
ret inoblast om a) . Two- hit m odel ini, diusulk an per t am a kali oleh Knudson, berlak u pada beberapa sindrom a kank er . Alel yang defekt if dit urunkan sesuai dengan hukum Mendel dan m engikut i pola dom inan, t et api pem bent ukan t um orny a ( t um or igenesis) disebabkan oleh hilangny a gen supresor t um or yang resesif pada j aringan yang ber sangkut an. Pada kasus lain, pem bent ukan kanker biasanya m em er luk an
defek pada beberapa gen, y ang disebut proses m ult ist ep
carcinogenesis.
Uj i m ut asi DNA m em puny ai beber apa k eunt ungan dibanding analisis pada t ingkat prot ein. DNA m udah diisolasi, dan regulasi DNA pada berbagai j aringan t idak berbeda, 2 karakt erist ik yang berlainan dengan prot ein. DNA dapat diisolasi dari berbagai m acam sum ber , t er m asuk sel darah put ih, sam pel j arigan, sel kulit dan akar ram but . Banyak m et ode t elah dikem bangkan unt uk m enganalisis m ut asi ( Tabel 2- 1) . Mut asi besar , delesi, inser si,
rearrangem ent s, at au ekspansi t r iple repeat s dapat
didet eksi dengan cara Sout her n blot at au PCR. Pada
analisis Sout hern, DNA dengan berat m olekul t inggi
didigest i dengan enzim rest riksi, m enghasilkan banyak fragm en yang kem udian dapat dipisahkan dengan elek t roforesis pada gel. Set elah DNA dit ransfer ke m em bran, DNA dapat dinat urasi dan dihibridisasi dengan
probe yang dilabel radioakt if yang ak an m endet ek si sekuens t ert ent u di ant ara fragm en- fragm en yang t ak t erhit ung j um lahnya. Per bedaan pola hibr idisasi yang
diperoleh dari Sout hern blot dapat m enunj ukkan adanya
delesi at au inser si pada DNA genom ( Gam bar 2- 8) .
Sebagai cont oh Sout hern blot dapat digunakan unt uk
m endiagnosis varian t alasem ia- di Asia Tenggara. Pada
beberapa kasus resesif aut osom , dit em ukan adanya delesi besar pada kedua gen - globin dar i k lust er gen 30 kb pada
krom osom 1. Karena delesi j uga m elalui gen - globin,
m aka m engak ibat kan hydrops fet alis dan k em at ian dalam kandungan.
RT- PCR berguna j uga unt uk m endet ek si ket idakadaan at au berkurangnya ek spresi m RNA akibat alel y ang t er m ut asi. Sk rining unt uk m enget ahui adanya m ut asi t it ik dapat dilakuk an dengan beberapa m et ode ( Tabel- 2- 2) .
Met ode didasarkan pada m ism at ch ant ara dupleks asam
nukleat , pem isahan DNA unt ai t unggal at au ganda dengan elek t roforesis, at au sekuensing fragm en DNA yang diperbanyak dengan PCR. Sekuensing DNA dapat dilak ukan secara langsung pada hasil PCR ( am plikon) at au m enggunakan fragm en yang diklon ke dalam vekt or plasm id. Sensit iv it as m et ode- m et ode ini bervariasi ant ar a 80 sam pai 100% . Uj i pr ot ein t er pot ong (pr ot ein t runcat ion t est / PTT) dapat digunakan unt uk m endet eksi m ut asi yang m engakibat kan penghent ian sint esis polipept ida dini. cDNA yang diisolasi dit ranskripsik an dan dit ranslasi secara in vit r o, kem udian pr ot ein dianalisis dengan elekt rofor esis gel. Perbandingan dengan prot ein wild- t ype ( norm al) dilakuk an unt uk m endet eksi m ut an yang t erpot ong (t r uncat ed) . Pendekat an ini t erut am a ber guna unt uk m endet ek si m ut asi pada gen yang besar yang m engakibat kan hilangnya fungsi.
Ta be l 2 - 1
Ta be l 2 - 2
M e t ode D e t e k si M u t a si
