PENGGUNAAN PENANDA GENETIK TUMBUH CEPAT
UNTUK PRODUKSI CALON INDUK KERAPU SUNU,
Plectropomus leopardus DALAM PROGRAM SELEKSI
Sari Bu d i M or i a Sem b ir i n g , H ar yant i , Ket u t Su w i r ya, I d a Kom an g War d an a, T at am Su t ar m at , d an H i r m aw an T i r t a Yu d h a
Balai Besar Penel i t i an d an Peng em b ang an Bud id aya Laut
Jl . Br. Gondol Kec. Ger okg ak Kab . Buleleng, Kot ak Pos 14 0, Singar aja- Bali 811 01 E- m ai l: m or iasem bir ing@y ahoo.co.id
(Naskah dit er im a: 9 Agust us 20 11 ; Disetujui publik asi: 1 6 Mar et 20 12)
ABST RAK
Penurunan kualitas beni h ker apu sering kali diindikasikan dengan per tum buhan yang lam bat, rentan terhad ap infek si penyakit, dan perubahan lingkungan ser ta terjadinya abnorm alitas. Upaya perbaikan sif at genetik benih kerapu ak an m em berikan dam pak signifikan dalam keberhasilan budidaya. Tujuan penelitian ini adalah untuk m em peroleh p enand a g en t um b uh cep at p ada b eni h/ cal on i nd uk k er ap u sunu sehing g a d ap at m eni ng kat kan ef isi ensi dan ef ek t ivit as p em uli aan. Unt uk m endap at k an penci ri gen tum buh cepat digunakan m etode analisi s m ikrosatelit (SSR/Sim ple Sequence Repeats) deng an m eng ap lik asikan enam set pri m er (f or war d d an r ever se). Cal on induk yang digunakan untuk analisis m asing- m asing berjum lah 4 ekor ukuran kecil dan 10 ekor ukuran besar. Validasi dan akurasi lokus yang dihasilkan dianalisis lebih lanjut dengan sequencing. Hasi l yang d i p erol eh m enunj uk kan b ahwa penanda g en t um buh cep at dapat terlihat dari lokus PL- 03 dengan alel/ fragm en DNA pada berat m olekul 370 bp. Ti ng k at k eakur at an p enand a g en t er seb ut p ad a k el om p ok uk uran b esar m encap ai 80%, sedangkan pada kelom pok ukuran kecil hanya 30%. Hal ini juga didukung dengan keakurat an prediksi d ari hasil sequencing m em b er ikan nilai k em iri pan sebesar 99 %. Dengan dem i kian lok us PL- 03 dapat di gunakan sebagai p enanda g en t um buh cepat pada ikan kerap u sunu dal am m em percepat selek si calon i nduk.
KATA KUNCI: p en an da genet ik , per tu m b uh an cep at , m i k rosat el it , sel ect iv e b r ee d i n g
ABST RACT : Determ in at ion of genetic m ar k er f or f ast gr ow th in p rodu ce can di dat es b r oodstock of coral t rout g r ou per, Pl ect ropom u s leopardus by selective breeding. By: Sari Budi M oria Sembiring, Haryanti, Ketut Suw irya, Ida Kom ang Wardana, T atam Sutarm at, an d H i r m aw an T i r t a Y u d h a
sequencing was conducted. The r esults showed t hat f ast gr owth m ar ker was f ound in
Plect r opom us leopar dus. Balai Besar Penelitian dan Pengem bangan Budidaya Laut Gondol- Bali sudah berhasil m engem bangkan pembenihan k erap u su n u h i n g g a m en g h asil k an b en ih dengan u kuran yan g sesuai u ntu k b udidaya. Walaup un dem ik ian, prod uk si benih b elum yang bervariasi. Berdasarkan beberapa hasil p en elit ian m en un j uk kan b ah wa p eran sifat ko nven sion al t ersebut m em ilik i keterb atasan teru tam a d alam hal wakt u yan g dip erluk an relatif lama untuk m emunculkan gen- gen yang d iin gin k an . Salah sat u k eb u t uh an d asar d i dalam program pemuliaan adalah mendapatkan cara m enyeleksi dalam jum lah san gat banyak, dalam wakt u yang singk at dan pada fase awal pertu m bu han. Selek si berdasark an f eno tip ik serin gkali m em berikan hal yang tidak ak urat, k ar e n a p e r f o r m an si f e n o t i p b an y ak d i -p en garu hi o leh f ak to r ling k un gan. Den gan d em ik ian p en g g u n aan p en an d a m o lek u lar harus dikem b ang kan . Pem anfaatan penan da
m oleku lar seb agai alat b an t u selek si p ad a program pem uliaan di Indonesia m asih sangat sedikit dibandingkan dengan pemuliaan secara ko nvensio nal.
Seiring d eng an sem akin berk em b angn ya tekno logi yang berbasis p enanda DNA m aka p en and a m ik ro sat elit m eru p ak an p en an d a m o l ek u l ar yan g b er k em b an g l eb ih ak h ir . Prin sip d asar pen an d a m ikro sat elit ad alah am plifikasi sekuen DNA tertentu m enggunakan PCR d an u m um nya salah sat u p rim er d iberi label supaya m em perm udah deteksi (Fishback
et a l ., 1 9 9 9 ). Kel eb i h an u t am a p en an d a m ikro sat elit terletak pada sif at p olim orfism e d an d aya p em b ed an ya yan g t in g g i . Si f at t erseb ut d ap at dik em ban gk an sebagai alat id ent ifik asi genotip (Han cock, 1 999 ).
Pengg unaan p enanda m ik rosatelit telah dilap orkan p ada beberapa jen is ikan seperti
Hyp opt hga lm ich t hys m ilit r ix, Aph yocyp r is chi nensis, Th unn us t hy nnu s t hyn nus, d an At lan tik salm on (Slet tan et al., 1 993 ) serta l e o p ar d c o r al g r o u p e r (Pl ec t r o p o m u s leopar dus) (Xiong Din g et al., 2009 ). Penan da m ikrosatelit juga telah digunakan dalam studi h ub u ng an an tara h et erosigo sit as t erh adap param eter pertum buhan seperti pada ikan nila,
Or eochr om is nilot icus (Appleyard et al., 2001), jenis keran g coklat, Myt ilus edulis (Del Rio-Po r t ill a & Beau m o n t , 2 0 0 0 ) d an u d an g P. st ylir ost r is (Bierne et al., 20 00 ).
Pem an faatan pen and a m olekular d eng an m engu tam akan karak ter kuantitat if t um b uh cep at d eng an p en ciri gen b ertu ju an un tu k m em perbaiki kualitas g enetik benih sehingga didap atkan b enih/ calon in duk kerapu su nu dengan sifat fenot ip d an gen otip yang leb ih baik dan jug a u ntu k m eningk atk an efisien si dan efek tivit as pem uliaan.
BAHAN DAN METODE
Hew an Uji
kelom pok ukuran kecil dan 10 ekor kelom pok uk uran besar. Kelo m pok uk uran k ecil m em -punyai panjang d an bobot rata- rata 13 ,95 cm d an 4 6 ,14 g sed an gk an k elo m p ok u k uran besar 25,5 cm dan 248,2 g. Sampel ikan kerapu s u n u y an g d i an al i s i s b e r asal d ar i sat u proto kol dari prod uk terseb ut. Ku ant itas d an kem urnian DNA d ari m asin g- m asin g sam p el d i u k u r d en g an m e n g g u n ak an s p ek t r o -fo tom eter pada pan jan g g elo m ban g 2 60 nm d an 2 8 0 n m . Kem u rn ian DNA d it et ap k an berdasarkan nilai rasio A260/ A280 sekitar 1,8- 2,0 (Sam brook et al., 1989). gunakan enam set primer mikrosatelit (for war d
dan r ever se). Susunan prim er yang digunakan disajikan dalam Tabel 1. Setiap pasang prim er
diberi label dengan pewarna fluor escent (Fam ; Hex d an Tet) p ad a f or wa r d p r im er yan g bertu juan un tuk m endetek si secara terpisah alel d ari set iap p rim er d alam sat u sam p el m enit. Untu k lokus PL- L5, kondisi PCR ad alah sam a den gan lokus PL- 03; PL- 0 4; PL- 08; dan PL- L4 k ecu ali su h u ann eali ng yait u 6 0oC, d em ik ian j u ga u nt u k lok u s PL L1 2 m eng -gu nak an suhu annealing yang berbeda yaitu 50oC. Hasil am p lif ikasi k em u dian d isep arasi m e n g g u n ak an ABI 3 1 0 0 Av i a n t Gen et i c Analyzer d an d ilaksan ak an di labo rato rium Gen et i k a Mo lek u ler Balai Besar Pen elit i an Bioteknologi dan Pem uliaan Tanam an Hut an (BBPBPTH - Jogjakarta). Pada saat elektroforesis m engg unakan genescan 4 00 HD (Rox ) size st a n d a r d s eb ag ai m ar k e r u k u r an u n t u k m en d et erm in asi u k u ran alel. Pro d u k PCR sebanyak 1- 2 µL untuk masing- m asing sampel dim asu kkan d alam cover plat e 96 r eact ion + 1 2 µ L (Genesca n 4 0 0 HD d an f or m a m i de
Tabel 1. Susunan basa pada prim er m ikrosatelit (for war d dan r ever se) yang digunakan dalam analisis gen penanda tum buh cepat
deionized) dan dit ut up deng an Micr oAm pTM Caps, kem u dian di-vor t ex dan di-f lushing. Selanjutnya dilakukan heat shock t em per at ur e
dari suh u 9 5oC selam a 2 m enit k e su hu 4oC selam a ± 1 5 m enit. Kem ud ian cover plat e
d i let ak k an d alam m esin ABI 3 1 0 0 Av ia nt Genet ic Analyzer. Hasil elekt rof oresis beru pa
p ea k k em u d i an d i an ali si s m en g g u n ak an
sof t war e Genescan. Selanjutnya data fragm en t e r se b u t d i p i n d ah k an k e p r o g r am g en e m apper 3.5 u ntuk m enganalisis uk uran dari set iap f rag m en t erseb ut . Hasil p em bacaan ukuran fragmen setiap prim er diinterpretasikan sebag ai alel.
Untu k pem b uktian dan validasi pengu jian gen tumbuh cepat, m aka selanjutnya dilakukan an al i si s l ag i m el al u i seq u en ci n g. Dal am
seq u en ci n g t er s eb u t , d i p e r si ap k an h asi l am p lifik asi PCR dan purifikasi am plicon. Hasil
sequencing d ian alisis m en ggu nak an p rog am MEGA4 un tu k m eng et ah ui sim ilarit as ant ar lokus m ik rosatelit yang d igunakan.
HASIL DAN BAHASAN
Dari en am set p rim er yan g d ig u n ak an u nt u k an alisis p enan da gen t um b uh cepat d en g an p en an d a m ik r o sat elit set elah d i -sep ar asi m en g g u n ak an ABI 3 1 0 0 Av i a n t Gen et i c A n a l y z er d an d i an al i si s d e n g an perang kat lu nak (soft war e) gene m apper 3.5, nam paknya hanya 4 prim er yaitu PL- 03; PL- 08; PL- L4 ; d an PL- L5 yang dap at m en unj ukk an polim orfism e fragm en gen yang bertanggung jawab pada tum buh cep at, sedan gkan p rim er PL- 04 dan PL- L12 tidak m em berikan fr agm ent
yang polim orfism e.
H as i l y an g d i p e r o l e h d ar i an al i s i s m ik ro - sat el it d en g an p r im er PL- 0 3 p ad a kelom pok uk uran b esar yang terdet eksi ada 8 0 % yan g m en u n j u k k an u k u r an 3 7 0 b p , sedan gkan p ada uk uran kecil hanya sebesar 30% (Gambar 1).
Pad a l o k u s PL- 0 8 (Gam b ar 2 ), h as i l polim orfism e DNA pada 342 bp m enunjukkan
Gambar 1. Hasil separasi PCR produk ikan kerapu sunu, P. leopar dus dengan prim er PL- 03 m enggunakan ABI 3100 Aviant Genetic Analyzer (A. ukuran besar; B. ukuran kecil)
Figur e 1. Result of separ at ion PCR pr oduct of cor al t r out gr ouper , P. leopardus wit h PL-03 pr im er using ABI 3100 Aviant Genet ic Analyzer (A. big size; B. sm all size)
A
B
A
B
2 0 % t e r d e t e k s i p ad a i k an k e r ap u s u n u k elo m po k uk u ran besar, sed ang k an u n tu k u k u ran k ecil seb esar 8 0 % t erd et ek si p ad a ukuran 306 bp, sehingga lokus ini juga belum dap at d igun akan seb agai pen ciri gen tum buh cep at .
Pada prim er PL- L4 jug a n am pak adan ya separasi DNA untuk sam pel kelom pok ukuran besar dan kecil. Dari kelom p ok uku ran besar yang dian alisis ad a 40 % yang m enunj ukk an ukuran 315 bp; 50% (305 bp) dan 20% (317 bp), sedang kan pada u ku ran k ecil 4 0% (30 5 bp dan 315 bp) dan 20% (317 bp) (Gam bar 3).
Pad a loku s PL- L5 (Gam bar 4 ), ik an kerapu su n u k elo m p o k u k u ran b esar t id ak d ap at terseparasi pada fr agm ent DNA dengan bobot m o lek ul 341 bp secara jelas dan sem p urn a, hal ini t erlihat dari “peak” yan g m uncul tid ak seperti pada lokus PL- 03, sem entara kelompok u k u ran k ecil h an ya 2 0 % yan g t erd et ek si .
Dengan dem ik ian nam pak nya lo kus terseb ut juga belum dapat dijadikan penciri gen tumbuh cep at .
Pad a lok us PL- 08; PL- 0 4; dan PL- L5, j uga terlihat adanya fragm en yang tidak terdeteksi, hal ini karena m un culnya band st ut t er yang d iseb ab k an o l eh sl ip p -st r a n d m i sp a i r i n g
selam a proses PCR, d an band st ut t er akan cenderun g berku ran g d eng an m eningk atn ya p an jan g un it m ik ro sat elit. Sehin gg a k et ig a lo kus terseb ut m asih belum dap at d ijadik an lo ku s ku an t it at if u nt u k m en d et ek si secara aku rat dari sifat gen yang b ertan ggun g jawab p ad a t u m b u h cep at . Dari k eem p at lo k u s tersebut di atas, nampaknya primer PL- 03 lebih baik dan aku rat sebag ai pen ciri gen t um b uh cepat pada ikan kerap u sunu karena dilih at dari polim orfism e fr agm ent DNA pada 370 bp sebanyak 80% sam p el u kuran besar d ap at t erek sp resi p ad a alel t ersebu t , sed an g k an pada kelo m po k u kuran k ecil h anya 30 %. Gambar 2. Hasil separasi PCR produk ikan kerapu sunu, P. leopar dus dengan prim er PL- 08
m enggunakan ABI 3100 Aviant Genetic Analyzer (A. ukuran besar; B. ukuran kecil)
Figur e 2. Result of separ at ion PCR pr oduct of cor al t r out gr ouper , P. leopardus wit h PL-08 pr im er using ABI 3100 Aviant Genet ic Analyzer (A. big size; B. sm all size)
A
B
B
Gambar 3. Hasil separasi PCR produk ikan kerapu sunu, P. leopar dus dengan prim er PL- L4 m enggunakan ABI 3100 Aviant Genet ic Analyzer (A. ukuran besar; B. ukuran kecil)
Figur e 3. Result of separ at ion PCR pr oduct of cor al t r out gr ouper , P. leopardus wit h PL-L4 pr im er using ABI 3100 Aviant Genet ic Analyzer (A. big size; B. sm all size)
A B
D e n g an m e n g g u n ak an 4 p e n an d a m i k r o s at el i t s aj a, t e r n yat a s u d ah d ap at m endet eksi perbedaan genet ik tum buh cepat pada ikan kerap u sunu . Hal ini m en unj ukk an bahwa penanda m ikrosatelit dapat digu nakan u nt u k m en det eksi variasi alel yan g tin g gi. Sel an j u t n ya Mo r g an t e & Ol i v i er i (1 9 9 3 ), m enyatakan bahwa penanda m ikrosatelit yang m em i l i k i n i l ai “Pol y m o r p h i c In f or m a t i on Cont ent” (PIC) 8 7 d ap at d ig u n ak an u nt u k m enyu sun pem etaan QTL (Quant it at ive Tr ait Loci) d an d i k e m b an g k an u n t u k m en car i penan da m ikrosatelit yan g b erp eran sebag ai MAS (Mar ker Assist ed Select ion). Selain it u, p e n g g u n aan l o k u s m i k r o sat el i t s eb ag ai
m ar ker g enetik dap at m en gek spresik an sif at ko dom inan, m en gik uti pola d asar k etu run an M e n d e l , r e p r o d u k t i b i l i t as y an g b ai k , m en g h asilk an al el yan g t er d et ek si d al am ju m lah b anyak dan m en gek spresikan variasi g en e t i k yan g l eb i h t i n g g i (M u k h er j ee & N r i p e n d r an at h , 2 0 0 9 ). D e m i k i a n j u g a Sc h l o e t t e r er & Pe m b er t o n (1 9 9 6 ) yan g
m enyatak an b ahwa m ikrosatelit m eru pak an al at b an t u y an g s a n g at ak u r at u n t u k m em bedak an g eno tip e, evaluasi k em u rnian turunan, pem etaan, dan seleksi genotipe untuk karakter yang diinginkan.
Un tuk valid asi dari loku s- loku s t ersebu t, dilaku kan sequencing sam pel u kuran b esar. Hasil sequencing dari am plicon PCR kelom pok besar un tuk lo kus PL- 03; PL- L4 ; d an PL- L5 set el ah d ian ali si s d en g an MEGA4 sep ert i tertera p ada Tab el 2.
Dari ket iga lo kus terseb ut terlih at bah wa lokus PL- 03 m em berikan nilai kemiripan yang paling tinggi pada kelompok ukuran besar yaitu m encapai 99%, sehingga lo kus PL- 03 dap at dijadikan sebagai lokus kuant itatif untuk sifat tum buh cepat pada ikan kerapu sunu. Demikian ju ga bila dilih at dari hasil kem iripan sequens
t o t al n u cl eot i d e D NA i k an k er ap u su n u kelo m p ok uk uran b esar m enu nj ukk an n ilai kem iripan yang tinggi dari lim a sam pel yang di
Tabel 2. Hasil sim ilaritas pada ikan kerapu sunu, P. leopar dus kelom pok ukuran besar dengan 3 lokus m ikrosatelit
Table 2. Result of sim ilar it y on big size of cor al t r out gr ouper , P. leopardus wit h 3 locus m icr osat ellit e
Aksesi
Accessi on
Deskrip si
Descr ipt ion
Ni lai maksimum
Ma xi m um scor e
Nil ai t o t al
T ot a l scor e
T ing kat kemi ri p an
Sim il a r i t y
( %)
gi|254679483|FJ548641.1 Plect r opom us leopar dus
c lone PL-03 mic rosatellit e sequenc e
562 5549 99
gi|254679490|FJ549858.2 Plect r opom us leopar dus
c lone PL-L5 mic rosatellit e sequenc e
492 2424 85
gi|253879959|6325758.1 Plect r opom us leopar dus
c lone PL-L4 mic rosatellit e sequenc e
351 3049 90 Gambar 4. Hasil separasi PCR produk ikan kerapu sunu, P. leopar dus dengan prim er PL- L5
m enggunakan ABI 3100 Aviant Genet ic Analyzer (A. ukuran besar; B. ukuran kecil)
Figur e 4. Result of separ at ion PCR pr oduct of cor al t r out gr ouper , P. leopardus wit h PL-L5 pr im er using ABI 3100 Aviant Genet ic Analyzer (A. big size; B. sm all size)
KESIMPULAN
Penggun aan penanda m ikrosatelit untuk penciri gen tum buh cepat pada ikan kerapu sunu untuk seleksi diperoleh pada berat molekul 370 bp dengan prim er PL- 03.
Primer PL- 03 dapat dijadikan lokus kuantitatif u n t u k t u m b u h c ep at d e n g an ad an ya p rediksi karak ter feno tip t um bu h cepat sebanyak 80%.
Hasil sequencing untuk validasi ketiga lokus prim er m enunjukkan nilai kem iripan 99% pada lokus PL- 03.
SARAN
Pe n c i r i g e n t u m b u h c e p a t d e n g an penan da m ikrosatelit p ada lo kus PL- 03 perlu diaplikasikan lebih lanju t d alam seleksi calon induk ikan kerapu sunu. Bioteknologi dan Pem uliaan Tanam an Hut an (BBPBPTH - Jogjakarta) yang sudah m em bantu dalam m enganalisis m ikrosatelit.
DAFTAR ACUAN
Appleyard, S.A., Renwick, J.L., & Mather, P.B. 2 00 1 . In d ividu al Het ero z yg o sit y Levels
an d Rel at i ve Gr o w t h Per f o r m an ce i n
Or eochr om is nilot icus (L.) Cultured under Fijian Conditions. Aquacultur e Resear ch, 32: 287- 296.
Benzie, J.A.H., Kenway, M., & Trott, L. 1997. Es-tim ates for The Heritability of Size in Juve-nile P. m onodon from Half- sib Mattings.
Aquacultur e, 152: 49- 53.
Bierne, N., Beuzart, I., Vonau, V., Bonhomm e, F., & Bédier, E. 2000. Microsatellite- Associated Heterosis in Hatchery- Propagated Stocks of the Shrim p Penaeus st ylir ost r is. Aqua-cultur e, 184(3- 4): 203- 219.
Del Rio- Portilla, M.A. & Beaum ont, A.R. 2000. Lar v al Gr o w t h , Ju ve n i l e Si z e an d autom ated Microsatellite Multiplex Poly-m erase Chain Reaction SystePoly-m s for Rain-bow Trout (Oncor hynchus m ykiss). Aqua-cult ur e, 172: 247- 254.
Hancock, J.M. 1999. Microsatellite and oyher Sim ple Sequence: Genom ic Contex t and Mutational Mechanisms. In Goldstein, D.B. and Schlottere, C. (Eds.). Microsatellites: Evolution and Applications. Oxfor d Univer -sit y Pr ess.
Morgante, M. & Olivieri, A.M. 1993. Am plified m icrosatellites as Markers in Plant Genet-ics. Plant Jour nal, 3: 175- 182.
Mukherjee, K. & Nripendranath, M. 2009. A Micro sat ell it e DNA Mark er Devek o p ed for Identifying Disease- resistant Population Tabel 3. Hasil tingkat kemiripan sequens total nucleotide DNA ikan kerapu sunu,
P. leopar dus kelom pok ukuran besar pada GenBank dengan nom or aksesi yang sam a
Table 3. Sim ilar it y sequens of t ot al DNA nucleot ide on big size cor al t r out gr ouper , P. leopardus in GenBank wit h sam e accession num ber
o f Gian t Bl ack Ti g er Sh r im p , Pena eu s monodon. Jour nal of The Wor ld Aquacult ur e Societ y, 40(2): 274- 280.
Sam brook, J., Fritsh, E.F., & Maniatis, T. 1989. Molecular clo nin g . Cold Spr ing Har bor Labor at or y Pr ess, New York, p. 568- 500. Sb o rd o n i, V., De Mat t t h aei s, E., Co b o l li
-Sbordoni, M., La Rosa, G., & Mattoccia, M. 1987. Bottleneck Effects and The Depres-sio n o f Gen et ic Variab ilit y in Hatch ery Stocks of Penaeus j aponicus (Crustacea: Decapoda). Aquacultur e, 57: 239- 251. Schloetterer, C. & Pem berton, J. 1996. The Use
of Microsatellite for Genetics Analysis of
Nat ural Po p ulat ion . Paper on Eur opean Un i o n Meet i n g “ Mol ec u l a r T o ol s f o r Biodiver sit y. Decem ber 14t h- 1 8t h 19 96 , Vienna.
Slettan, A., Olsaker, I., & Lie, O. 1993. Isolation an d Ch aract eriz at io n of Variab le (GT)n Repetitive Sequences from Atlantic Salmon,
Salm o-salar L. Anim Genet , 24: 195- 197. Xiong Ding, S., Zeng, H.S., Wang, Y., Pan, Y., &
Feng Shi, X. 2009. Characterization of eight p o lym o rp h ic m icro sat ellit e lo ci f o r t h e l eo p ar d co r al g r o u p er (Pl ect r op om u s leopar dus). Molecular Ecology Resources.
