DEPARTEMEN PATOLOGI KLINIK FAKULTAS KEDOKTERAN USU / RSUP H.ADAM MALIK

(1)

PEMERIKSAAN SEROLOGI & IMMUNOLOGI PEMERIKSAAN SEROLOGI & IMMUNOLOGI

HIV & AIDS HIV & AIDS

Prof. DR. Dr. Ratna Akbari Ganie, SpPK, FISH Prof. DR. Dr. Ratna Akbari Ganie, SpPK, FISH Prof Dr. Adi Koesoema Aman, SpPK(KH), FISH Prof Dr. Adi Koesoema Aman, SpPK(KH), FISH

DEPARTEMEN PATOLOGI KLINIK

FAKULTAS KEDOKTERAN USU / RSUP H.ADAM MALIK MEDAN

(2)

Acquired

Acquired ImmuneImmune DeficiencyDeficiency SyndromeSyndrome

Syndrome

Syndrome penyakitpenyakit disebabkandisebabkan oleholeh virusvirus RNARNA padapada umumnyaumumnya HIV

HIV--11 dandan sebagiansebagian kasuskasus didi AfrikaAfrika TengahTengah disebabkandisebabkan oleholeh HIVHIV--22.. Transmisi

Transmisi cairan virus melalui cairan tubuh yang terinfeksi cairan virus melalui cairan tubuh yang terinfeksi melalui hubungan melalui hubungan Seksual, Seksual, Homoseksual Homoseksual Homoseksual, Homoseksual, Penggunaan

Penggunaan jarumjarum suntiksuntik yangyang terkontaminasi,terkontaminasi, Transfusi

Transfusi komponenkomponen darahdarah dandan Vertikal

Vertikal transmisitransmisi kepadakepada bayibayi yangyang dilahirkandilahirkan oleholeh ibuibu yangyang menderitamenderita HIVHIV Vertikal

Vertikal transmisitransmisi kepadakepada bayibayi yangyang dilahirkandilahirkan oleholeh ibuibu yangyang menderitamenderita HIVHIV

Tujuan

Tujuan PemeriksaanPemeriksaan ::

Anti

Anti HIVHIV digunakandigunakan untukuntuk menegakkanmenegakkan diagnosisdiagnosis Anti

Anti--HIVHIV digunakandigunakan untukuntuk menegakkanmenegakkan diagnosis,diagnosis, menentukan

menentukan angkaangka kesakitankesakitan infeksiinfeksi HIV/AIDSHIV/AIDS melauimelaui surveilans,

surveilans, mengamankanmengamankan darahdarah transfusitransfusi dandan transplantasi

transplantasi jaringanjaringan transplantasi

(3)

Pemeriksaan Laboratorium Pasien Terinfeksi HIV Pemeriksaan Laboratorium Pasien Terinfeksi HIV ditujukan kepada :

1 1.. Humoral

Humoral Component

Component (( antibodi

antibodi ))

2 Cellular Component ( CD4 = T

2 Cellular Component ( CD4 = T-- Helper )

Helper )

2. Cellular Component ( CD4 = T

2. Cellular Component ( CD4 = T-- Helper )

Helper )

3 3.. Viral

Viral Load

Load (PCR)

(PCR)

Pada

Pada PasienPasien AIDS,AIDS, penentuanpenentuan konsentrasikonsentrasi selsel TT--helperhelper limfositlimfosit sangatsangat penting

penting LeukopeniaLeukopenia dandan lymphocytopenialymphocytopenia selaluselalu dijumpaidijumpai penting

(4)

Struktur HIV

(5)

Virus

Virus ProteinProtein LocationLocation GeneGene STRUKTUR PROTEIN HIV-1 dan HIV-2`

Virus

Virus ProteinProtein LocationLocation GeneGene HIV

HIV--11 gp41gp41 Envelope(transmembrane Envelope(transmembrane envenv protein) protein) gp160/12 gp160/12 0 0

Envelope (external protein)

Envelope (external protein) envenv 0

0 p24

p24 Core (major structural protein)Core (major structural protein) gaggag HIV

HIV--22 Gp34Gp34 Envelope(transmembrane Envelope(transmembrane protein)

protein)

env env gp140

gp140 Envelope (external protein)Envelope (external protein) envenv p26

p26 Core (major structural protein)Core (major structural protein) gaggag p

(6)

gp120

(7)

(8)

1 PEMERIKSAAN KOMPONEN HUMORAL 1. PEMERIKSAAN KOMPONEN HUMORAL

Humoral component Humoral component : :

Penderita HIV ( + ) membentuk antibodi anti

Penderita HIV ( + ) membentuk antibodi anti--envelope antibodi gp120, envelope antibodi gp120, anti

anti--p24 antibodip24 antibodi

S ( )

Metode pemeriksaan :

Metode pemeriksaan : -- ELISA (Enzym Immunoassay)ELISA (Enzym Immunoassay) -- kuantisasi kuantisasi

-- kualitasi (Rapid test)kualitasi (Rapid test)

HIV Antigen ELISA mendeteksi HIV core Antigen (p24) merupakan HIV Antigen ELISA mendeteksi HIV core Antigen (p24) merupakan

mayor antigen . mayor antigen . HIV antibodi terhadap protein gp120 dan p24 HIV antibodi terhadap protein gp120 dan p24

(9)

Pemeriksaan antibodi → Induplo ( cek ulang Pemeriksaan antibodi → Induplo ( cek ulang Pemeriksaan antibodi → Induplo ( cek ulang Pemeriksaan antibodi → Induplo ( cek ulang

dengan

dengan duplikasi ) duplikasi ) untuk menghindari untuk menghindari teknikal error dan false positif.

teknikal error dan false positif. Hasil :

Hasil : Reaktif → pemeriksaan konfirmasi menggunakanReaktif → pemeriksaan konfirmasi menggunakan metode

metode Western Blood Test Western Blood Test ( WB Test ) ( WB Test ) . . metode

metode Western Blood Test Western Blood Test ( WB Test ) ( WB Test ) . . False positif jarang terjadi.

False positif jarang terjadi.

Kekurangan WB Test : Kekurangan WB Test :

1. Memerlukan waktu yang lama 1. Memerlukan waktu yang lama 2 Membutuhkan Staff yang terlatih 2 Membutuhkan Staff yang terlatih 2. Membutuhkan Staff yang terlatih 2. Membutuhkan Staff yang terlatih

3. Memerlukan biaya yang relatif mahal 3. Memerlukan biaya yang relatif mahal

(10)

(11)

KEPUTUSAN MENTERI KESEHATAN REPUBLIK KEPUTUSAN MENTERI KESEHATAN REPUBLIK KEPUTUSAN MENTERI KESEHATAN REPUBLIK KEPUTUSAN MENTERI KESEHATAN REPUBLIK

INDONESIA INDONESIA NOMOR : 241/Menkes/SK/IV/2006 NOMOR : 241/Menkes/SK/IV/2006 TENTANG TENTANG

STANDAR PELAYANAN LABORATORIUM KESEHATAN STANDAR PELAYANAN LABORATORIUM KESEHATAN

PEMERIKSA HIV DAN INFEKSI OPORTUNISTIK PEMERIKSA HIV DAN INFEKSI OPORTUNISTIK PEMERIKSA HIV DAN INFEKSI OPORTUNISTIK PEMERIKSA HIV DAN INFEKSI OPORTUNISTIK

Tentang Tentanggg

Penggunaan strategi III : Penggunaan strategi III :

Kombinasi 3 reagen rapid test HIV T j an Diagnosis Kombinasi 3 reagen rapid test HIV T j an Diagnosis Kombinasi 3 reagen rapid test HIV → Tujuan Diagnosis. Kombinasi 3 reagen rapid test HIV → Tujuan Diagnosis.

(12)

Strategi III dengan persyaratan reagensia sebagai Strategi III dengan persyaratan reagensia sebagai

berikut : berikut :

1. Sensitivitas reagen pertama >99% 1. Sensitivitas reagen pertama >99% 2. Spesifisitas reagen kedua > 98% 2. Spesifisitas reagen kedua > 98%

S f %

3. Spesifitas reagen ketiga > 95% 3. Spesifitas reagen ketiga > 95% Untuk tujuan surveilans :

Untuk tujuan surveilans : Untuk tujuan surveilans : Untuk tujuan surveilans :

reagen pertama harus memiliki sensitiviras >99%. Spesifisitas reagen pertama harus memiliki sensitiviras >99%. Spesifisitas reagen kedua >98%. Semua regensia yang dipakai harus

reagen kedua >98%. Semua regensia yang dipakai harus terdaftar di DepKes RI

terdaftar di DepKes RI terdaftar di DepKes RI. terdaftar di DepKes RI.

Pemeriksaan menggunakan strategi III untuk diagnosis pasien yang Pemeriksaan menggunakan strategi III untuk diagnosis pasien yang

Asymptomatic. Asymptomatic.

(13)

St

d

l

ik

ti

St

d

l

ik

ti HIV

HIV

Standar alur pemeriksaan anti

Standar alur pemeriksaan anti--HIV

HIV

Pemeriksaan

Pemeriksaan anti

anti--HIV

HIV disertai

disertai informed

informed

consent

consent tertulis,

tertulis, sebelumnya

sebelumnya didahului

didahului

dengan

dengan konseling

konseling pra

pra--uji

uji // test

test dan

dan

sesudahnya

sesudahnya konseling

konseling pasca

pasca--uji

uji // test

test..

Pelaporan

Pelaporan pemeriksaan

p

pemeriksaan dilaporkan

p

dilaporkan reaktif

p

reaktif

dan

dan non

non reaktif

reaktif..

KERAHASIAAN!!!!

(14)

(15)

(16)

(17)

(18)

2. Pengukuran cellular component

2. Pengukuran cellular component :

:

Target cell adalah T.helper (CD4+) Target cell adalah T.helper (CD4+)

Normal :CD4+ : 65 % dan CD8+ : 35% dari total T

Normal :CD4+ : 65 % dan CD8+ : 35% dari total T--cell cell Pada penderita AIDS konsentrasi CD4+ menurun secara Pada penderita AIDS konsentrasi CD4+ menurun secara drastis.

drastis. drastis. drastis.

Konsentrasi CD4+ dihubungkan dengan konsentrasi CD8 . Konsentrasi CD4+ dihubungkan dengan konsentrasi CD8 . Menyebabkan rasio CD4+ / CD8 terbalik pada HIV / AIDS

(19)

TECHNIC PEMERIKSAAN .

CD4+

CD4+ Cara Immunophenotypng Cara Immunophenotypng menggunakan Flow menggunakan Flow Cytometri dan Cell sorter

Cytometri dan Cell sorter

PRINSIP

PRINSIP :

:

Menggabungkan kemampuan alat untuk Menggabungkan kemampuan alat untuk gggg gg pp mengindentifikasi karakteristik masing

mengindentifikasi karakteristik masing--masing masing

permukaan cell dengan kemampuan memisahkan cell permukaan cell dengan kemampuan memisahkan cell yang berada dalam suatu suspensimenurut karakteristik yang berada dalam suatu suspensimenurut karakteristik

y g p

masing

masing--masing dengan menggunakan satu atau lebih masing dengan menggunakan satu atau lebih Probe yang sesuai secara automatis melalui suatu celah Probe yang sesuai secara automatis melalui suatu celah yang diteruskan oleh seberkas sinar laser.

yang diteruskan oleh seberkas sinar laser. y g

(20)

(21)

IMMUNOPHENOTYPING

( IMMUNOLOGI MARKERS ) SEL :

DEFINISI

DEFINISI :

:

P

t

d I

l

i d

i t

kt

/

P

t

d I

l

i d

i t

kt

/

Pertanda Immunologi dari struktur /

antigen permukaan sel baik sel

normal maupun sel abnormal .

(22)

Immunophenotyping Hematolog

- Methode Immunoflourescent - Methode Immunoenzymatic

(23)

Cara Immunoflourescent :

K

t

K

t

Keuntungan :

-- Cepat

Cepat

-- Bisa double flourescent

Bisa double flourescent Æ

Æ dua warna

dua warna

-- Banyak di gunakan

Banyak di gunakan

Kerugian :

-- Flourescent tidak tahan lama

Flourescent tidak tahan lama

(24)

Methode Immunoflourescent

-Immunoflourescent Labelling Sel Suspension

- Monoklonal antibodi - Flourochrome

(25)

Methode Immunoenzymatic .

1. Preparat darah tepi atau sumsum tulang 1. Preparat darah tepi atau sumsum tulang 1. Preparat darah tepi atau sumsum tulang 1. Preparat darah tepi atau sumsum tulang 2. Lebelling Immunoenzyme pada preparat 2. Lebelling Immunoenzyme pada preparat

3. Reaksikan dengan kromogenic substrate 3. Reaksikan dengan kromogenic substrate

(26)

Keuntungannya

Label permanent

-- Label permanent

Label permanent

-- Morfologi sel dapat divisualiasikan

Morfologi sel dapat divisualiasikan

secara simultan dengan antigen

-- Menggunakan mikroskope cahaya .

Menggunakan mikroskope cahaya .

Kerugiannya

-- Lebelling perlu waktu lama

Lebelling perlu waktu lama

-- Sulit untuk labelling ganda.

Sulit untuk labelling ganda.

(27)

Si l

Sinar laser

Cell

Sinyal elektronik

detector

cell

detector

Detector

→

→ dicatat sebagai karakteristik

dicatat sebagai karakteristik

cell

yang bersangkutan

cell

yang bersangkutan

→

→ Identifikasi jenis cell

Identifikasi jenis cell

→

→ aktivitas cell

aktivitas cell

→

→ aktivitas cell

aktivitas cell

→

→ Jumlah cell dalam populasi

Jumlah cell dalam populasi

campuran

(28)

3. Memantau Pasien HIV

Dengan Viral Load

PT Roche Indonesia

Divisi Diagnostics

(29)

Pendahuluan

Diketahui bahwa AIDS disebabkan oleh ‘Human Diketahui bahwa AIDS disebabkan oleh ‘Human Immunodeficiency Virus’ (HIV

Immunodeficiency Virus’ (HIV--1).1).

Dengan merusakkan selDengan merusakkan sel--sel dari sistem kekebalan,sel dari sistem kekebalan,

Dengan merusakkan selDengan merusakkan sel sel dari sistem kekebalan, sel dari sistem kekebalan, virus HIV menghancurkan kemampuan tubuh untuk virus HIV menghancurkan kemampuan tubuh untuk melawan infeksi dan jenis kanker tertentu.

melawan infeksi dan jenis kanker tertentu.

Target dari virus HIV adalah sel darah putih yang Target dari virus HIV adalah sel darah putih yang disebut sel CD4+ Infeksi HIV menyebabkan jumlah disebut sel CD4+ Infeksi HIV menyebabkan jumlah disebut sel CD4+. Infeksi HIV menyebabkan jumlah disebut sel CD4+. Infeksi HIV menyebabkan jumlah sel CD4+ menurun. Bila jumlah sel

sel CD4+ menurun. Bila jumlah sel--sel CD4+ sel CD4+

berkurang sampai pada tingkat tertentu, maka sistem berkurang sampai pada tingkat tertentu, maka sistem kekebalan tubuh menjadi lemah. Bila jumlah CD4+ kekebalan tubuh menjadi lemah. Bila jumlah CD4+ t dib h 200 t bil i f k i t i tik t dib h 200 t bil i f k i t i tik turun dibawah 200, atau apabila infeksi oportunistik turun dibawah 200, atau apabila infeksi oportunistik atau kanker timbul, maka seseorang dengan infeksi atau kanker timbul, maka seseorang dengan infeksi HIV disebut sebagai AIDS (Acquired

HIV disebut sebagai AIDS (Acquired Immunodeficiecy Syndrome).

Immunodeficiecy Syndrome).yy yy ))

Untuk mengetahui status infeksi HIV, ada dua Untuk mengetahui status infeksi HIV, ada dua

pemeriksaan laboratorium yang penting yaitu jumlah pemeriksaan laboratorium yang penting yaitu jumlah CD4+ dan viral load HIV.

(30)

Apakah Viral Load HIV ?

Viral Load HIV adalah jumlah partikel virus HIV yang ditemukan Viral Load HIV adalah jumlah partikel virus HIV yang ditemukan dalam setiap mililiter darah.

dalam setiap mililiter darah.

SS ki bki b k jk j l hl h tik l itik l i HIV did lHIV did l dd hh

Semakin banyak jumlah partikel virus HIV didalam darah, Semakin banyak jumlah partikel virus HIV didalam darah, semakin cepat sel

semakin cepat sel--sel CD4+ dihancurkan dan semakin cepat sel CD4+ dihancurkan dan semakin cepat pasien kearah AIDS.

pasien kearah AIDS.

SS ti tti t kk dd fik dibfik dib h i ih i i

(31)

Apakah Viral Load HIV ?

Pemeriksaan Viral Load bila dikombinasi dengan Pemeriksaan Viral Load bila dikombinasi dengan pemeriksaan jumlah CD4+ dan dipantau dari waktu pemeriksaan jumlah CD4+ dan dipantau dari waktu ke waktu memungkinkan hal

ke waktu memungkinkan hal--hal sebagai berikut :hal sebagai berikut : ke waktu memungkinkan hal

ke waktu memungkinkan hal hal sebagai berikut :hal sebagai berikut :

Mengetahui bagaimana tubuh memerangi HIVMengetahui bagaimana tubuh memerangi HIV

Memperkirakan resiko kearah AIDSMemperkirakan resiko kearah AIDS

Mengetahui efektifitas dari terapiMengetahui efektifitas dari terapi

gg pp

Viral Load memberikan tanda sejauh mana keberhasilan suatu Viral Load memberikan tanda sejauh mana keberhasilan suatu

terapi, menjaga agar virus HIV dalam kontrol dan ditekan terapi, menjaga agar virus HIV dalam kontrol dan ditekan selama mungkin dengan pengobatan

selama mungkin dengan pengobatan selama mungkin dengan pengobatan. selama mungkin dengan pengobatan.

(32)

Apakah kegunaan pemeriksaan CD4+

dan VL?

Pemeriksaan jumlah CD4+ dan Viral Load dilakukan untuk Pemeriksaan jumlah CD4+ dan Viral Load dilakukan untuk mendapatkan gambaran yang lengkap mengenai sistem mendapatkan gambaran yang lengkap mengenai sistem kekebalan tubuh melawan virus.

kekebalan tubuh melawan virus.

Jumlah selJumlah sel--sel CD4+ dan titer Viral Load memberikan pedoman sel CD4+ dan titer Viral Load memberikan pedoman dalam menentukan dimulainya pengobatan anti

dalam menentukan dimulainya pengobatan anti--viral.viral.

Tujuannya adalah untuk menjaga agar jumlah CD4+ tinggi dan Tujuannya adalah untuk menjaga agar jumlah CD4+ tinggi dan jj yy j gj g gg jj gggg titer VL rendah. Untuk itu pemantauan jumlah CD4+ dan titer VL titer VL rendah. Untuk itu pemantauan jumlah CD4+ dan titer VL HIV sebelum dan selama pengobatan akan menunjukkan

HIV sebelum dan selama pengobatan akan menunjukkan bagaimana respon terhadap terapi.

(33)

Bagaimanakah Viral Load HIV

diukur ?

Viral Load HIV menggunakan suatu teknologi yang canggih dan Viral Load HIV menggunakan suatu teknologi yang canggih dan sensitif untuk menghitung jumlah materi genetik virus HIV yang sensitif untuk menghitung jumlah materi genetik virus HIV yang ada dalam darah. Suatu pemeriksaan VL yang akurat dan

ada dalam darah. Suatu pemeriksaan VL yang akurat dan pp yy gg sensitif harus dapat mendeteksi secara konsisten, mempunyai sensitif harus dapat mendeteksi secara konsisten, mempunyai spesifitas yang tinggi dan reprodusibilitasnya baik dari tes ke spesifitas yang tinggi dan reprodusibilitasnya baik dari tes ke tes.

tes.

Vi l L d HIV di ik d k

Vi l L d HIV di ik d k t kt k ll i PCRi PCR

Viral Load HIV diperiksa dengan menggunakan Viral Load HIV diperiksa dengan menggunakan teknologi PCR teknologi PCR (Polymerase Chain Reaction = Reaksi Rantai Polimerase).

(34)

Bagaimanakah Viral Load HIV

diukur ?

PCR adalah suatu paten teknologi yang menghasilkan PCR adalah suatu paten teknologi yang menghasilkan

turunan/kopi yang berlipat ganda dari sekuen nukleotida dari turunan/kopi yang berlipat ganda dari sekuen nukleotida dari organisme target yang dapat mendeteksi target organisme organisme target yang dapat mendeteksi target organisme organisme target, yang dapat mendeteksi target organisme organisme target, yang dapat mendeteksi target organisme

dalam jumlah yang sangat rendah dengan spesifitas yang tinggi. dalam jumlah yang sangat rendah dengan spesifitas yang tinggi.

Target Sekuen

Rantai DNA

(35)

Bagaimanakah Viral Load HIV

diukur ?

Proses PCR ini disebut amplifikasi atau Proses PCR ini disebut amplifikasi atau

penggandaan. Dalam proses amplifikasi target penggandaan. Dalam proses amplifikasi target sekuen digandakan berulang

sekuen digandakan berulang ulang sehingga didapatulang sehingga didapat sekuen digandakan berulang

sekuen digandakan berulang--ulang sehingga didapat ulang sehingga didapat jutaan kopi/turunan yang dinamakan amplikon.

jutaan kopi/turunan yang dinamakan amplikon.

Amplikon direaksikan dengan reagensia spesifik, Amplikon direaksikan dengan reagensia spesifik, sehingga dapat dihitung jumlah partikel virus HIV sehingga dapat dihitung jumlah partikel virus HIV dalam setiap mililiter darah yang diperiksa.

dalam setiap mililiter darah yang diperiksa.pp yy gg pp

Hasil pemeriksaan dilaporkan sebagai Hasil pemeriksaan dilaporkan sebagai copies/mlcopies/ml

atau dalam perhitungan matematik logaritma atau atau dalam perhitungan matematik logaritma atau atau dalam perhitungan matematik logaritma atau atau dalam perhitungan matematik logaritma atau

‘log’ ‘log’..

Misalnya hasil

Misalnya hasil pasien Xpasien X adalah adalah 173.000 copies/ml = 173.000 copies/ml = 2

2 log 5,24. log 5,24.

(36)

(37)

Proses Amplifikasi

No. of No. Amplicon

C l C i f T t

Cycles Copies of Target

1 2 2 4 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon ₂ ₄ 3 8 4 16 4 cycle = 16 Amplicon 5 l 32 A li 4 16 5 32 6 64 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 6 64 20 1,048,576 30 1 073 741 824 7 cycle = 128 Amplicon 30 1,073,741,824

(38)

(39)

(40)

Bagaimanakah Viral Load HIV

diukur ?

Proses Deteksi :

Denaturasi dan Hibridisasi Denaturasi dan Hibridisasi

Deteksi

(41)

(42)

Mengapa Penting mengetahui Viral Load Mengapa Penting mengetahui Viral Load

HIV ? HIV ?

Sebelum pengobatan dimulai, Viral Load HIV diperiksa Sebelum pengobatan dimulai, Viral Load HIV diperiksa

bersamaan dengan jumlah CD4+ untuk menentukan kapan bersamaan dengan jumlah CD4+ untuk menentukan kapan pengobatan harus dimulai. Apabila titer VL rendah, maka pengobatan harus dimulai. Apabila titer VL rendah, maka

p g p ,

keputusan mulainya pengobatan dapat ditunda. Tetapi bila keputusan mulainya pengobatan dapat ditunda. Tetapi bila meningkatnya titer VL sangat tinggi disarankan untuk mulai meningkatnya titer VL sangat tinggi disarankan untuk mulai pengobatan dengan ‘highly active antiretroviral therapy

pengobatan dengan ‘highly active antiretroviral therapy (HAART)’

(HAART)’ (HAART) . (HAART) .

Bila pengobatan antiBila pengobatan anti--viral sudah dimulai, kesuksesan viral sudah dimulai, kesuksesan pengobatan dapat dipantau dengan memeriksa VL HIV. pengobatan dapat dipantau dengan memeriksa VL HIV. Pengobatan yang efektif akan menurunkan titer VL HIV. Pengobatan yang efektif akan menurunkan titer VL HIV. Pengobatan yang efektif akan menurunkan titer VL HIV. Pengobatan yang efektif akan menurunkan titer VL HIV.

Bila titer VL HIV tidak menjadi turun atau sampai dengan tidak Bila titer VL HIV tidak menjadi turun atau sampai dengan tidak terdeteksi selama masa pengobatan, maka Dokter akan

terdeteksi selama masa pengobatan, maka Dokter akan merekomendasikan untuk mengganti dengan obat yang merekomendasikan untuk mengganti dengan obat yang berbeda.

(43)

Kapan Viral Load HIV harus

diperiksa ?

p

Pemeriksaan awalan atau ‘baseline’Pemeriksaan awalan atau ‘baseline’ : pada : pada saat kunjungan pertama ke Dokter akan

saat kunjungan pertama ke Dokter akan dianjurkan periksa jumlah CD4+ dan Viral dianjurkan periksa jumlah CD4+ dan Viral Load untuk menentukkan kapan harus Load untuk menentukkan kapan harus Load untuk menentukkan kapan harus Load untuk menentukkan kapan harus dimulainya terapi.

dimulainya terapi.

Pemeriksaan setelah terapi dimulaiPemeriksaan setelah terapi dimulai : :

direkomendasikan agar pemeriksaan diulang direkomendasikan agar pemeriksaan diulang dalam waktu 2

dalam waktu 2 4 minggu setelah terapi4 minggu setelah terapi dalam waktu 2

dalam waktu 2--4 minggu setelah terapi 4 minggu setelah terapi dimulai untuk melihat respon pengobatan. dimulai untuk melihat respon pengobatan. Pemeriksaan selanjutnya dilakukan dalam Pemeriksaan selanjutnya dilakukan dalam kurun waktu 4

kurun waktu 4--6 bulan atau sampai dengan 6 bulan atau sampai dengan VL tidak terdeteksi

VL tidak terdeteksi VL tidak terdeteksi. VL tidak terdeteksi.

Pemeriksaan selama terapiPemeriksaan selama terapi : :

direkomendasikan untuk periksa VL dan direkomendasikan untuk periksa VL dan jumlah CD4+ setiap 3

jumlah CD4+ setiap 3--4 bulan sekali untuk 4 bulan sekali untuk

t f ktifit t i

memantau efektifitas terapi. memantau efektifitas terapi.

Pemeriksaan bila belum dilakukan terapiPemeriksaan bila belum dilakukan terapi : : bila pemeriksaan VL yang pertama sangat bila pemeriksaan VL yang pertama sangat rendah dan jumlah CD4+ sangat tinggi, rendah dan jumlah CD4+ sangat tinggi, jj gg gggg maka Dokter tidak akan mulai terapi. maka Dokter tidak akan mulai terapi. Walaupun terapi belum dimulai, setiap 3 Walaupun terapi belum dimulai, setiap 3--4 4 bulan harus periksa VL untuk mengetahui bulan harus periksa VL untuk mengetahui bagaimana tubuh melawan virus. Bila titer bagaimana tubuh melawan virus. Bila titer

(44)

Apakah arti hasil Viral Load HIV ?

Meningkat atau menurunnya hasil titer Viral Meningkat atau menurunnya hasil titer Viral Load lebih dari 1/10 kali lipat atau lebih

Load lebih dari 1/10 kali lipat atau lebih besar dari ‘1 log’ maka dikatakan ada besar dari ‘1 log’ maka dikatakan ada besar dari 1 log maka dikatakan ada besar dari 1 log maka dikatakan ada perubahan hasil yang berarti.

perubahan hasil yang berarti.

Hasil Viral Load tidak terdeteksi adalah bila Hasil Viral Load tidak terdeteksi adalah bila

titer HIV sangat rendah

titer HIV sangat rendah sehingga tidak sehingga tidak dapat terbaca oleh reagensia.

dapat terbaca oleh reagensia. Jumlah virus Jumlah virus didalam darah sangat sedikit atau hasil VL didalam darah sangat sedikit atau hasil VL tidak terdeteksi membuat resiko kearah tidak terdeteksi membuat resiko kearah

AIDS dan juga resiko resisten terhadap obat AIDS dan juga resiko resisten terhadap obat AIDS dan juga resiko resisten terhadap obat AIDS dan juga resiko resisten terhadap obat menjadi rendah.

menjadi rendah.

Bila hasil yang sudah tidak terdeteksi Bila hasil yang sudah tidak terdeteksi menjadi terdeteksi kembali, maka menjadi terdeteksi kembali, maka pemeriksaan harus diulang untuk pemeriksaan harus diulang untuk

meyakinkan hasilnya. Bila hasil ulangan meyakinkan hasilnya. Bila hasil ulangan tetap meningkat dari pemeriksaan

tetap meningkat dari pemeriksaan

sebelumnya maka Dokter akan melihat sebelumnya maka Dokter akan melihat sebelumnya maka Dokter akan melihat sebelumnya maka Dokter akan melihat faktor kemungkinannya dan

faktor kemungkinannya dan dapat berarti dapat berarti bahwa pengobatan sekarang sudah tidak bahwa pengobatan sekarang sudah tidak efektif lagi dan harus dilakukan modifikasi efektif lagi dan harus dilakukan modifikasi

b t b t

(45)

Polymerase Chain Reaction

PT Roche Indonesia

(46)

Apakah Metoda PCR ?

Metoda PCR adalah paten teknologi yang dapat Metoda PCR adalah paten teknologi yang dapat pp g yg y gg pp

membuat tiruan berlipat ganda dari sekuen nukleotida membuat tiruan berlipat ganda dari sekuen nukleotida spesifik dari organisme target.

spesifik dari organisme target.

Metoda PCR menyediakan suatu mekanisme untuk Metoda PCR menyediakan suatu mekanisme untuk mendeteksi target organisme dengan konsentrasi yang mendeteksi target organisme dengan konsentrasi yang mendeteksi target organisme dengan konsentrasi yang mendeteksi target organisme dengan konsentrasi yang sangat kecil dengan spesifitas yang tinggi.

sangat kecil dengan spesifitas yang tinggi.

Teknologi PCR ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun Teknologi PCR ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1985.

(47)

Apakah Metoda PCR ?

Metoda PCR dapat digunakan untuk berbagai aplikasi Metoda PCR dapat digunakan untuk berbagai aplikasi pp gg gg pp penting seperti bidang penelitian biologi, genetika,

penting seperti bidang penelitian biologi, genetika, arkeologi, forensik, tes paterniti dan diagnostik klinik. arkeologi, forensik, tes paterniti dan diagnostik klinik. Didalam bidang diagnostik klinik, hanya dibutuhkan Didalam bidang diagnostik klinik, hanya dibutuhkan

jumlah sampel yang sangat sedikit dan dibuat tiruannya jumlah sampel yang sangat sedikit dan dibuat tiruannya jumlah sampel yang sangat sedikit dan dibuat tiruannya jumlah sampel yang sangat sedikit dan dibuat tiruannya berlipat ganda sehingga ada atau tidak adanya virus

berlipat ganda sehingga ada atau tidak adanya virus dan bakteri spesifik serta mutasi materi genetik dapat dan bakteri spesifik serta mutasi materi genetik dapat dideteksi

dideteksi dideteksi dideteksi

(48)

Tahapan Proses PCR

Pre Pre –– PCR : PCR : Preparasi reagensia Preparasi reagensia

Preparasi spesimen : isolasi/ purifikasi DNA/ RNA Preparasi spesimen : isolasi/ purifikasi DNA/ RNA

PCR lifik i

PCR : proses amplifikasi PCR : proses amplifikasi

Denaturasi (pemisahan rantai DNA) Denaturasi (pemisahan rantai DNA) Annealing (penempelan primer)

Annealing (penempelan primer)

Extension (pemanjangan oleh enzim) Extension (pemanjangan oleh enzim)

Post

Post –– PCR :PCR :

Deteksi/ Analisa Hasil PCR Deteksi/ Analisa Hasil PCR Deteksi/ Analisa Hasil PCR Deteksi/ Analisa Hasil PCR

(49)

Sekuen Target

Target Sequence DNA/ RNA diperoleh dari hasil isolasi/ purifikasi target organisme DNA Strand target organisme Double Helix DNA Strand Supercoiled DNA Strand Chromosome

(50)

Komponen Basa DNA

DNA B N l t

Base Nucleoside Nucleotide Abbreviation Base Ring

Structure

DNA Base Nomenclature

Structure

Adenine (A) Adenosine Adenosine dATP Purine Triphosphate

Guanine (G) Guanosine Guanosine dGTP Purine Triphosphate

Thymine (T) Thymidine Thymidine dTTP Pyrimidine Triphosphatep p

Cytosine (C) Cytidine Cytidine dCTP Pyrimidine Triphosphate

(51)

Perbedaan antara RNA dan DNA

Diff b t RNA d DNA

RNA DNA

S Rib D ib

Difference between RNA and DNA

Sugar Ribose Deoxyribose

Adenine (A) Adenine (A)

Bases Cytosine (C) Cytosine (C)

Uracil (U) Thymine (T)

Guanine (G) Guanine (G)

No. of strands Usually single Double

(52)

Sekuen Nukleotida

H d B d Hydrogen Bonds Cytosine (C) Adenine (A) Guanine (G) Thymine (T)

Guanine (G) _{Adenine (A)}

Thymine (T) Cytosine (C) ( ) Deoxyribose (Sugar molecule) Phosphoric Acid (Phosphate molecule)

(53)

Phosphate M l l

Ikatan Basa, Gula

Deoxyribose

S M l l

Molecule

,,

dan Kelompok Fosfat

Sugar Molecule

Bases 5’ _3’ Hydrogen B d 3’ 5’ Bonds Sugar-Phosphate Backbone

(54)

PROSES PCR

1 1 –

– Denaturasi oleh panas

Denaturasi oleh panas

Target Sequence

(55)

2 2 –

– Penempelan pasangan primer

Penempelan pasangan primer

p

g

p

berlabel biotin di kedua ujung Sekuen Target

(56)

3 3 -- Taq

Taq DNA Polymerase mengkatalisa

q

DNA Polymerase mengkatalisa

y

g

pemanjangan Primer sebagai

Komplemen Nukleotida

(57)

Akhir Siklus PCR ke

Akhir Siklus PCR ke--1

1 Hasil 2 tiruan dari Sekuen Target

Hasil 2 tiruan dari Sekuen Target

(58)

Target Amplifikasi : Siklus PCR diulang

No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target Cycles Copies of Target

1 2 2 4 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 3 8 4 16 y p 4 cycle = 16 Amplicon 5 l 32 A li 5 32 6 64 20 1 048 576 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 20 1,048,576 30 1,073,741,824 7 cycle = 128 Amplicon

(59)

Deteksi/Analisa Hasil PCR

Elektroforesis gel agarosa (horizontal) Elektroforesis gel agarosa (horizontal) Eleftroforesis gel poliakrilamid (vertikal) Eleftroforesis gel poliakrilamid (vertikal)gg pp (( )) Enzym labelling oligonucleotide

Enzym labelling oligonucleotide Biotin

Biotin--labelled oligonucleotidelabelled oligonucleotide Digoxigenin

Digoxigenin--labelled oligonucleotidelabelled oligonucleotide Selanjutnya : RFLP, Sequencing dll. Selanjutnya : RFLP, Sequencing dll.

(60)

RT

RT –

– PCR

PCR

1 1 -- Primer berlabel biotin menempel pada

Primer berlabel biotin menempel pada

Sekuen Target RNA

(61)

2 2 -- rrTth

Tth DNA Polymerase mengkatalisa

DNA Polymerase mengkatalisa

y

g

pemanjangan Primer dengan

Nukleotida komplemennya

(62)

3 3 –

– Hasil sintesa dari DNA komplemen (cDNA)

Hasil sintesa dari DNA komplemen (cDNA)

3 3 Hasil sintesa dari DNA komplemen (cDNA)

Hasil sintesa dari DNA komplemen (cDNA)

terhadap Sekuen Target

(63)

PCR Step 1

Denaturasi oleh Panas

PCR Step 1

PCR Step 1 –

– Denaturasi oleh Panas

Denaturasi oleh Panas

Target RNA Sequence

cDNA

(64)

PCR Step 2

Penempelan Primer pada cDNA

PCR Step 2

(65)

PCR Step 3

PCR Step 3 -- rrTth

Tth DNA Polymerase

DNA Polymerase

PCR Step 3

PCR Step 3 rrTth

Tth DNA Polymerase

DNA Polymerase

mengkatalisa pemanjangan Primer

(66)

Akhir Siklus ke

Akhir Siklus ke--1 PCR

1 PCR –

–

Akhir Siklus ke

Akhir Siklus ke 1 PCR

1 PCR

Hasil tiruan Untai Ganda DNA (Amplikon)

dari Sekuen Target

g

(67)

Akhir Siklus ke

Akhir Siklus ke--2 PCR

2 PCR –

–

Akhir Siklus ke

Akhir Siklus ke 2 PCR

2 PCR

rrTth

Tth DNA Polymerase mengkatalisa

DNA Polymerase mengkatalisa

pemanjangan Primer

(68)

PCR

PCR –

– Amplifikasi Exponensial :

Amplifikasi Exponensial :

p

Setiap Siklus Baru menghasilkan jumlah

berlipat ganda dari Amplikon

1 cycle = 1 (RNA/cDNA hybrid)

Single strand RNA

2 cycle = 2 3 cycle = 4 4 cycle = 8 5 cycle = 16 6 cycle = 32 6 cycle 32 7 cycle = 64