EFEKTIVITAS FRAKSI N-HEKSANA, KLOROFORM DAN
ETANOL EKSTRAK BIJI MIMBA SEBAGAI BIOPESTISIDA
UNTUK JAMUR ALTERNARIA PORRI
(THE EFFECTIVITY OF N-HEXANE, CHLOROFORM AND
ETHANOL FRACTION OF NEEM SEED KERNELS EXTRACT
AS BIOPESTICIDE FOR FUNGUS ALTERNARIA PORRI)
Anastasia Wheni Indrianingsih, Khoirun Nisa, Ema Damayanti, Roni Maryana, Satrio Krido W.
UPT BPPT Kimia LIPI Yogyakarta
Jl. Yogya Wonosari Km 32, Gading, Playen, Gunungkidul Telp/Fax (0274) 392570, Email :[email protected]
ABSTRAK
Tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss) merupakan tanaman yang berpotensi sebagai bahan baku biopestisida. Berdasarkan hal tersebut dilakukan penelitian untuk mengetahui keefektifan fraksi n-heksana, kloroform dan etanol dari ekstrak biji mimba yang diperoleh dengan metode soxhlet sebagai biopestisida terhadap jamur penyakit bawang merah, Alternaria porri. Proses ekstraksi soxhlet biji mimba dilakukan secara bertahap dengan 3 pelarut yaitu n-heksana, kloroform dan etanol. Ekstrak dengan konsentrasi 3.000 dan 5.000 ppm diaplikasikan secara in vitro terhadap jamur A. porri dengan parameter pertumbuhan diameter jamur. Rendemen ekstrak yang diperoleh sebesar 32,53% (fraksi n-heksana), 9,28% (fraksi kloroform) dan 9,11% (fraksi etanol). Hasil uji in vitro menunjukkan bahwa ekstrak biji mimba fraksi etanol paling efektif dalam menghambat pertumbuhan diameter jamur A. porri dengan persentase penghambatan sebesar 49,49% pada konsentrasi ekstrak 3.000 ppm dan 54,03% pada 5.000 ppm. Ekstrak fraksi etanol selanjutnya dianalisis dengan TLC (Thin
Layer Chromatography) menggunakan fase diam silika gel GF254 dan fase gerak
etil asetat 100%, hasilnya menunjukkan bahwa ekstrak kemungkinan mengandung senyawa terpenoid. Uji statisika One-way Anova dilanjutkan dengan Duncan Test menunjukkan bahwa ada perbedaan yang signifikan antara penggunaan berbagai pelarut dibandingkan dengan kontrol pada derajat kepercayaan 95%.
Kata kunci : Ekstraksi soxhlet, biji mimba, biopestisida, Alternaria porri, Thin
Layer Chromatography
ABSTRACT
Neem tree (Azadirachta indica A. Juss) is one kind of tree that potent for biopesticide raw material. According to this, a research had been conducted to find out the effectivity influenced of n-hexane, chloroform and ethanol fraction of neem seed kernels extract by soxhlet procedure to fungus Alternaria porri, one kind of onion (Allium cepa) plant diseases.
Soxhlet extraction process was carried out continuously with three kind of organic solvents, which is n-hexane, chloroform and ethanol. Extract with concentration 3,000 and 5,000 ppm were evaluated in vitro to fungus A. porri with diameter growth of fungi as parameter.
The yield extract was 32.53 % (n-hexane fraction), 9.28% (chloroform fraction) and 9.11 % (ethanol fraction). The result showed that ethanol fraction of neem seed kernels extract was the most effective extract to inhibit A. porri growth with inhibition percentage of ethanol fraction was 49.49 % at 3,000 ppm and 54.03 % at 5,000 ppm. Ethanol extract was analyzed with TLC (Thin Layer Chromatography) using silica gel GF254 as stationary phase and ethyl acetate
100% as mobile phase. The result showed that the extract had terpenoids compounds.
Statistical test used One-way Anova continued with Duncan Test showed that there was a significant difference between organic solvents compared with control at confidence degree 95%.
Key words: soxhlet extraction, neem seed kernels, biopesticide, Alternaria porri, Thin Layer Chromatography
PENDAHULUAN
Tingginya kebutuhan pangan karena populasi manusia yang semakin meningkat menyebabkan berbagai usaha untuk meningkatkan produksi hasil pertanian dilakukan. Salah satu caranya adalah dengan menggunakan pestisida kimia agar tanaman pertanian terbebas dari hama penyakit dan dengan demikian produksi hasil pertanian meningkat. Namun demikian, di sisi lain ada dampak negatif yang ditimbulkan akibat penggunaan pestisida kimia ini. Selain menyebabkan pencemaran lingkungan, pestisida kimia juga berbahaya bagi kesehatan manusia, antara lain menyebabkan iritasi, batuk, sesak nafas (sistem pernafasan); sakit kepala, depresi (sistem neurologi); anemia (sistem hematologi); penyakit kulit (sistem dermatologi) dan infertilitas (sistem reproduksi). Pestisida kimia ini bisa masuk dalam tubuh manusia melalui ingesti, inhalasi dan absorpsi melalui kulit (www.prn2.usm.my/mainsite/bulletin/sun/1997/sun6.html, 2006). Dengan melihat dampak negatif pestisida kimia tersebut, maka perlu dilakukan usaha-usaha untuk mengurangi pemakaian pestisida kimia. Salah satu hal yang bisa dilakukan adalah penggunaan pestisida alami (biopestisida ) yang aman bagi lingkungan dan makhluk hidup.
Tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss) merupakan tanaman yang potensial sebagai bahan baku pestisida. Di Indonesia, tanaman ini banyak terdapat di Bali dan Lombok (Sukrasno, 2004). Azadirachtin, salah satu jenis tetranortriterpenoid yang didapat dari biji mimba (seed kernels) dan sedikit terdapat di jaringan bagian tanaman mimba yang lain, telah dibuktikan sebagai salah satu zat bioaktif tanaman mimba yang menjanjikan untuk pengendalian hama terpadu ( Schmutterer, H, 1995).
Berbagai penelitian telah dilakukan untuk mengetahui kemampuan ekstrak biji mimba sebagai biopestisida. Kahar Muzakhar, 1996, melaporkan bahwa konsentrasi ekstrak akuades biji mimba optimum yang dapat menurunkan dan menahan kelimpahan hama serangga pada tanaman kedelai adalah 1 %. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Mawardinur dkk, 2003, menunjukkan bahwa perlakuan serbuk daun dan serbuk biji mimba baik sebagai racun kontak maupun racun perut berpengaruh terhadap mortalitas dan waktu kematian Nezara Virdula dibanding serbuk daun mimba. Konsentrasi ekstrak akueous biji mimba sebesar 1% sudah menyebabkan penghambatan yang signifikan terhadap pertumbuhan miselium dan konidiogenesis dari Beauveria Bassiana (Depieri et al, 2005). Akan tetapi Rodriguez-Lagunes et al dalam Depieri et al, 2005 mendapatkan hasil bahwa tidak ada penghambatan yang signifikan dalam pertumbuhan vegetatif jamur pada konsentrasi ekstrak akueous biji mimba 5%.
Berdasarkan uraian di atas, dilakukan penelitian untuk mengetahui keefektifan fraksi n-heksana, kloroform dan etanol ekstrak biji mimba dalam menghambat pertumbuhan diameter jamur Alternaria porri. Ekstrak biji mimba diperoleh dengan metode ekstraksi soxhlet. Ekstraksi soxhlet merupakan suatu ekstraksi yang berkesinambungan terhadap suatu padatan dengan pelarut panas. Padatan dihaluskan untuk memperluas permukaan bahan sehingga meningkatkan interaksi antara pelarut dan senyawa yang diekstrak. Efisiensi pemisahan dalam ekstraksi soxhlet bergantung pada kelarutan senyawa yang diekstrak, volume pelarut yang digunakan dan banyaknya pengulangan proses ekstraksi. Pelarut yang digunakan dipilih berdasarkan tingkat kepolarannya. Analisis TLC digunakan untuk mengetahui komponen-komponen yang terdapat dalam ekstrak
yang diperoleh. Analisis ini didasarkan pada perbedaan retensi komponen-komponen yang terkandung dalam suatu senyawa di fasa diam terhadap fasa gerak (pelarut).
Hasil penelitian yang dilakukan diharapkan dapat bermanfaat bagi pengembangan biopestisida sehingga penggunaan pestisida kimia dapat dikurangi. Jamur A. porri merupakan penyebab penyakit bercak ungu pada tanaman bawang merah. Penyakit bercak ungu ini berupa bintik lingkaran konsentris berwarna ungu atau putih-kelabu di daun, tepi daun kuning serta ujung-ujungnya mengering. (www.naturalnusantara.co.id, 2006).
BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan
Bahan :
Biji mimba yang berasal dari Balai Proteksi Tanaman Obat Pasirjati Ujungberung, Bandung), Jamur Alternaria porri yang diisolasi dari tanaman bawang merah di lahan pasir Sanden, Kabupaten Bantul dan diperbanyak di laboratorium UPT. BPPTK LIPI Yogyakarta, Bahan-bahan kimia berkualitas analitik yaitu n-heksana (C6H14), chloroform (CHCl3), etanol (C2H5OH), akuades, PDA (Potato Dextrose
Agar), Dimetil Sulfoksida, Silika gel GF254, serium (IV) sulfat, etil asetat.
Alat :
Satu set alat ekstraktor Soxhlet, Satu set alat TLC, Autoclave, Pipet appendorf 1000 dan 5000 L, Evaporator Buchi, Desikator, Inkubator, Timbangan digital, Jangka sorong, Kertas saring, Laminar flow, cawan petri, bor gabus, oase, alat-alat gelas.
Metode
a. Ekstraksi Soxhlet Biji Mimba
Serbuk kering biji mimba (seed kernels) ditimbang sebanyak 40 gram, dimasukkan dalam ekstraktor soxhlet dengan menggunakan 200 mL n-heksana sebagai pelarut (perbandingan bahan dan pelarut 1:5). Proses ekstraksi dilakukan
sampai cairan berwarna jernih. Ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan rotary
evaporator. Hasil yang didapat didinginkan dan ditimbang. Hasil ini disebut
sebagai ekstrak biji mimba fraksi n-heksana. Ampas sisa dikeringkan, ditimbang kemudian diekstraksi kembali dengan pelarut kloroform sehingga didapat ekstrak biji mimba fraksi kloroform. Prosedur yang sama dilakukan sehingga didapatkan fraksi etanol.
b. Uji Invitro Ekstrak Biji Mimba Terhadap Jamur Alternaria Pori
Ditimbang 30 gram ekstrak biji mimba, dilarutkan dengan 0,2 mL DMSO dan dimasukkan dalam cawan petri yang berisi 9,8 mL PDA sehingga diperoleh konsentrasi ekstrak 3000 ppm. Campuran dikocok dan didiamkan sampai memadat. Miselium jamur A. Porri dilubangi dengan bor gabus ukuran 6,6 mm kemudian ditanam diatas media PDA. Setiap sampel ekstrak dilakukan pengulangan tiga kali. Pengukuran pertumbuhan jamur dilakukan dari waktu penanaman (Ho) sampai hari ke-7 (H7). Hal yang sama dilakukan dengan
konsentrasi ekstrak 5000 ppm. Persentasi penghambatan pertumbuhan jamur dihitung dengan rumus :
% Hambatan = (Dc-Di) / Dc x 100 %, dengan Dc : diameter jamur kontrol
Di : diameter jamur sampel (ekstrak)
Pengaruh perbedaan antara kontrol dan ekstrak biji mimba terhadap pertumbuhan jamur A. porri dilakukan dengan uji statistika One-way Anova dilanjutkan dengan
Duncan Test dengan derajat kepercayaan 0,95.
c. Analisis TLC
Analisis TLC dilakukan di laboratorium Biologi-Farmasi, Fakultas Farmasi UGM. Ekstrak biji mimba ditotolkan pada pelat silika gel GF254, dikembangkan dengan
pelarut etil asetat 100% dan dianalisis dengan sinar UV 254 nm dan pereaksi penampak bercak serium (IV) sulfat.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pelarut n-heksana bersifat non polar, kloroform bersifat semi polar dan etanol bersifat polar dibandingkan n-heksana dan kloroform. Hasil ekstraksi soxhlet terhadap serbuk biji mimba disajikan dalam tabel 1 berikut :
Tabel 1. Hasil ekstrak serbuk biji mimba dengan 3 macam pelarut. Pelarut Rendemen (%) Sifat fisik
n-heksana 32,53 Oily, cokelat kekuningan
kloroform 9,28 Padat, cokelat muda
etanol 9,11 Padat, cokelat tua
Tabel 1 di atas memperlihatkan bahwa ekstrak biji mimba dengan pelarut n-heksana menghasilkan rendemen paling besar yaitu 32,53%. Ekstrak yang diperoleh berupa cairan oily berwarna cokelat kekuningan. Kemungkinan ekstrak yang terdapat dalam n-heksana adalah minyak dan senyawa-senyawa non polar dari biji mimba. Ekstrak yang diperoleh dengan pelarut kloroform dan etanol mempunyai rendemen yang lebih kecil yakni 9,28% dan 9,11%. Hal ini mengindikasikan bahwa senyawa-senyawa yang bersifat polar yang terkandung dalam biji mimba lebih sedikit dibandingkan senyawa semi polar dan non polar.
Ketiga ekstrak yang diperoleh kemudian diuji secara in vitro terhadap jamur Alternaria porri. Pengukuran pertumbuhan diameter jamur A. Porri dilakukan dari hari penanaman (Ho) sampai hari ke-7 (H7). Konsentrasi ekstrak
yang digunakan adalah 3000 dan 5000 ppm. Pengaruh penghambatan ketiga ekstrak terhadap pertumbuhan radial jamur disajikan dalam gambar 1.
Gambar 1. Persentase hambatan jamur A. Porri pada hari ke-7 dalam ketiga macam ekstrak.
Gambar 1 memperlihatkan bahwa secara keseluruhan, ketiga ekstrak dalam dua konsentrasi, 3000 dan 5000 ppm, menghambat pertumbuhan diameter jamur A.
porri. Ekstrak dengan konsentrasi 5000 ppm lebih efektif dalam menghambat 17.01 24.28 39.5341.61 49.4954.03 0 10 20 30 40 50 60 % h a m b a ta n
n-heksana chlorof orm etanol pelarut ekstraksi soxhlet
% Hambatan Pe rtumbuhan A. porri
3000 ppm 5000 ppm
pertumbuhan radial jamur daripada ekstrak dengan konsentrasi 3000 ppm. Hal ini berarti peningkatan konsentrasi ekstrak biji mimba berbanding lurus dengan peningkatan penghambatannya terhadap pertumbuhan diameter jamur A. Porri.
Persentase hambatan untuk kedua konsentrasi secara berurutan dari yang paling besar dihasilkan oleh ekstrak fraksi etanol, kloroform dan n-heksana. Besar persentase hambatan ekstrak fraksi etanol, kloroform dan n-heksana berturut-turut adalah 49,49% 39.53% dan 17,01% pada konsentrasi 3000 ppm dan sebesar 54,03%, 41,62% dan 24,28% pada konsentrasi 5000 ppm. Data ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol dengan konsentrasi 5000 ppm memiliki sifat antifungi terhadap jamur A. porri yang paling tinggi. Namun demikian secara keseluruhan ketiga ekstrak memiliki sifat antifungal terhadap A. Porri.
Ekstrak fraksi etanol dianalisis TLC dengan menggunakan pelat silika gel GF254 sebagai fasa diam dan etil asetat 100% sebagai fasa gerak. Pelat kemudian
diperiksa dengan sinar UV 254 nm dan penampak bercak serium (IV) sulfat. Kromatogram yang diperoleh disajikan dalam gambar 1, 2 dan 3.
Gambar 2. Detektor: serium (IV) sulfat Gambar 3. Detektor: UV-254 nm
Gambar 2 dan 3 memperlihatkan bahwa nampak lima bercak cokelat kemerahan pada analisis TLC dengan detektor serium (IV) sulfat sedangkan penggunaan detektor UV 254 nm hanya memunculkan satu bercak awal penotolan ekstrak dan
1gt gyt 56t 11 11 11 w3 edf 2 3 4 5 1
selebihnya ekstrak fraksi etanol mengalami pemadaman. Hal ini mengindikasikan bahwa ekstrak biji mimba fraksi etanol kemungkinan mengandung senyawa terpenoid. Bercak nomor lima pada gambar 1 yang nampak melebar kemungkinan karena adanya trigliserida yang terkandung dalam fraksi etanol. Namun diperlukan analisis lebih lanjut untuk mengetahui identitas senyawa-senyawa tersebut secara spesifik.
Azadirachtin, zat bioaktif yang paling banyak terdapat di biji mimba, termasuk dalam golongan tetranortriterpenoid dan bersifat polar (Schumutterer, 1995), sehingga kemungkinan besar zat ini terkandung dalam fraksi etanol. Semakin polar suatu pelarut maka semakin banyak dapat mengambil azadirachtin. Hal ini menjelaskan urutan sifat antifungi dari ekstrak n-heksana, kloroform dan etanol. Ekstrak fraksi etanol yang berwarna cokelat tua juga mengindikasikan terdapatnya azadirachtin yang juga berwarna cokelat gelap.
Dalam Grovindachari et al, 1998, sifat antifungi yang aktif dari minyak biji mimba merupakan campuran dari tetranortriterpenoids. Pengujian dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) menunjukkan bahwa komponen utama fraksi yang aktif tersebut adalah 6-deasetilnimbin, azadiradione, nimbin, salanin dan epoksiazadiradion. Grovindachari et al juga menyebutkan bahwa jika masing-masing zat aktif tersebut diaplikasikan secara sendiri-sendiri malah tidak menunjukkan aktivitas yang baik jika dibandingkan ketika semua zat tersebut dicampur dan diaplikasikan. Campuran ini menunjukkan aktivitas antifungi yang mengindikasikan efek kesinergisan. Hal inilah yang kemungkinan menyebabkan ekstrak fraksi n-heksana yang bersifat oily juga memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan diameter radial jamur A. porri.
Sifat antifungi dari ekstrak biji mimba juga kemungkinan disebabkan karena ekstrak tersebut mengandung senyawa sulfur. Balandrin, et al dalam Schmuterrer, 1995, mengidentifikasi bahwa asiklik di-, tri- dan tetrasulfida merupakan konstituen utama dari bagian volatil pada biji mimba. Namun demikian, mekanisme aksi dari zat bioaktif biji mimba terhadap pertumbuhan vegetatif dan reproduksi jamur masih belum diketahui (Locke dalam Depieri et al, 2005).
Pada penelitian ini, ekstrak biji mimba baik dengan konsentrasi 3000 maupun 5000 ppm memiliki daya hambat terhadap pertumbuhan radial jamur A.
porri. Kemampuan daya hambat ini cukup bagus karena fungisida sintetik pun
jika memiliki konsentrasi penghambatan minimum antara 1000-5000 ppm dianggap memiliki aktivitas yang bagus (Paulus, W. dalam Grovindachri et al, 1998). Hal ini membuka jalan bagi kemungkinan pengembangan ekstrak biji mimba sebagai fungisida alami.
Uji statistika One-Way Anova dilanjutkan dengan Duncan Test dengan derajat kepercayaan 95%, dilakukan untuk mengetahui apakah ada perbedaan yang signifikan dengan penggunaan berbagai pelarut dalam penghambatan pertumbuhan diameter jamur A. porri. Hasil yang diperoleh adalah disajikan dalam tabel 2 berikut:
Tabel 2. Pengaruh berbagai macam pelarut
terhadap pertumbuhan diameter jamur A. porri
Pelarut Rata-rata diameter (cm) 3000 ppm 5000 ppm DMSO (kontrol) 3,600 c 3,600 c etanol 1,8167 a 1,6533 a kloroform 2,1767 a 2,1033 b n-heksana 2,9850 b 2,7233 b
Ket. Angka yang diikuti huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata (Duncan Test) dengan taraf kepercayaan 95%.
Hasil di atas menunjukan bahwa ada perbedaan yang signifikan dalam penggunaan berbagai macam pelarut dibandingkan dengan kontrol terhadap pertumbuhan diameter jamur A. porri., namun ekstrak fraksi etanol dan ekstrak fraksi n-heksana saling tidak berbeda nyata.
1. Ekstrak biji mimba fraksi etanol paling efektif dalam menghambat pertumbuhan diameter jamur A. porri dibandingkan fraksi n-heksana dan kloroform dengan persentase penghambatan sebesar 49,49% dan 54,03% pada konsentrasi 3000 dan 5000 ppm.
2. Ekstrak biji mimba fraksi etanol mengandung senyawa terpenoid.
3. Ada perbedaan yang signifikan dalam penggunaan berbagai pelarut dibandingkan dengan kontrol terhadap penghambatan pertumbuhan diameter jamur A. porri.
KESIMPULAN
Terima kasih kepada Kepala UPT. BPPTK LIPI atas penyediaan fasilitas penelitian, Kepala Laboratorium Biologi-Farmasi Fakultas Farmasi UGM atas analisis TLC, Ibu Vita T.R atas diskusi dan saran dalam penyusunan tulisan ini dan Bapak Asep W. yang membantu kegiatan teknis di laboratorium.
UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan terimakasih bila perlu dapat dicantumkan untuk memberi penghargaan kepada sposnsor penelitian atau pihak-pihak yang mendukung penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Depieri, R.A., Martinez, S.S., and Menezes Jr, A.O., 2005, Compatibility
of the Fungus Beauveria Bassiana (Bals.) Vuill. (Deuteromycetes) with extracts
of Neem Seeds and Leaves and The Emulsible Oil.,
www.scielo.br/schielo.php
Mawardinur, Chamzurni, T., Hasnah, 2000, Mortalitas Nympha dan Imago Nezara viridula L. Akibat Aplikasi Servbuk Daun dan Biji Mimba (Azadirachta indica A. Juss). Laporan Penelitian, Fakultas Pertanian Universitas Syiah Kuala: Banda Aceh.
Muzakhar, K., 1996, Optimasi Konsentrasi Pemberian Ekstrak Biji Nimba (Azadirachta indica A. Juss) Sebagai Pengganti Bahan Insektisida Sintesis Pada Budidaya Kedelai (Glycine max L.), Laporan Penelitian, Universitas Jember: Jember.
Grovindachari, T.R., Suresh, G., Gopalakrishnan, G., Banumathy, B., and Masilamani, S., 1998, Identification of Antifungal Compounds from the Seed Oil of Azadirachta indica. Phytoparasitica 26(2): 1-8.
Rukmana, R. dan Oesman, Y.Y., 2002, Nimba Tanaman Penghasil
Pestisida Alami, , Yogyakarta: Penerbit Kanisius.
Rosenblatt, D.H. and G. T. Davis, 1973, Laboratory Course in Organic
Chemistry, Allyn and Bacon, Inc: Boston
Schmutterer, H., 1995, The Neem Tree, Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft mbH.
Sukrasno, 2004, Mimba Tanaman Obat Multifungsi. AgroMedia Pustaka: Jakarta.
www.prn2.usm.my/mainsite/bulletin/sun/1997/sun6.html., Hazardous Health Effects of Pesticides, 31 Mei 2006.
