EFEKTIVITAS FRAKSI N-HEKSANA, KLOROFORM DAN
ETANOL EKSTRAK BIJI MIMBA SEBAGAI BIOPESTISIDA
UNTUK JAMUR
ALTERNARIA PORRI
(
THE EFFECTIVITY OF N-HEXANE, CHLOROFORM AND
ETHANOL FRACTION OF NEEM SEED KERNELS EXTRACT
AS BIOPESTICIDE FOR FUNGUS ALTERNARIA PORRI)
Anastasia Wheni Indrianingsih, Khoirun Nisa, Ema Damayanti, Roni Maryana, Satrio Krido W.
UPT BPPT Kimia LIPI Yogyakarta
Jl. Yogya Wonosari Km 32, Gading, Playen, Gunungkidul Telp/Fax (0274) 392570, Email :anastasia_wheni_i@yahoo.com
ABSTRAK
Tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss) merupakan tanaman yang berpotensi sebagai bahan baku biopestisida. Berdasarkan hal tersebut dilakukan penelitian untuk mengetahui keefektifan fraksi n-heksana, kloroform dan etanol dari ekstrak biji mimba yang diperoleh dengan metode soxhlet sebagai biopestisida terhadap jamur penyakit bawang merah, Alternaria porri. Proses ekstraksi soxhlet biji mimba dilakukan secara bertahap dengan 3 pelarut yaitu n-heksana, kloroform dan etanol. Ekstrak dengan konsentrasi 3.000 dan 5.000 ppm diaplikasikan secara in vitro terhadap jamur A. porri dengan parameter pertumbuhan diameter jamur. Rendemen ekstrak yang diperoleh sebesar 32,53% (fraksi n-heksana), 9,28% (fraksi kloroform) dan 9,11% (fraksi etanol). Hasil uji in vitro menunjukkan bahwa ekstrak biji mimba fraksi etanol paling efektif dalam menghambat pertumbuhan diameter jamur A. porri dengan persentase penghambatan sebesar 49,49% pada konsentrasi ekstrak 3.000 ppm dan 54,03% pada 5.000 ppm. Ekstrak fraksi etanol selanjutnya dianalisis dengan TLC (Thin Layer Chromatography) menggunakan fase diam silika gel GF254 dan fase gerak
etil asetat 100%, hasilnya menunjukkan bahwa ekstrak kemungkinan mengandung senyawa terpenoid. Uji statisika One-way Anova dilanjutkan dengan Duncan Test
menunjukkan bahwa ada perbedaan yang signifikan antara penggunaan berbagai pelarut dibandingkan dengan kontrol pada derajat kepercayaan 95%.
Kata kunci : Ekstraksi soxhlet, biji mimba, biopestisida, Alternaria porri, Thin Layer Chromatography
ABSTRACT
Soxhlet extraction process was carried out continuously with three kind of organic solvents, which is n-hexane, chloroform and ethanol. Extract with concentration 3,000 and 5,000 ppm were evaluated in vitro to fungus A. porri with diameter growth of fungi as parameter.
The yield extract was 32.53 % (n-hexane fraction), 9.28% (chloroform fraction) and 9.11 % (ethanol fraction). The result showed that ethanol fraction of neem seed kernels extract was the most effective extract to inhibit A. porri growth with inhibition percentage of ethanol fraction was 49.49 % at 3,000 ppm and 54.03 % at 5,000 ppm. Ethanol extract was analyzed with TLC (Thin Layer Chromatography) using silica gel GF254 as stationary phase and ethyl acetate
100% as mobile phase. The result showed that the extract had terpenoids compounds.
Statistical test used One-way Anova continued with Duncan Test showed that there was a significant difference between organic solvents compared with control at confidence degree 95%.
Key words: soxhlet extraction, neem seed kernels, biopesticide, Alternaria porri, Thin Layer Chromatography
PENDAHULUAN
Tingginya kebutuhan pangan karena populasi manusia yang semakin
meningkat menyebabkan berbagai usaha untuk meningkatkan produksi hasil
pertanian dilakukan. Salah satu caranya adalah dengan menggunakan pestisida
kimia agar tanaman pertanian terbebas dari hama penyakit dan dengan demikian
produksi hasil pertanian meningkat. Namun demikian, di sisi lain ada dampak
negatif yang ditimbulkan akibat penggunaan pestisida kimia ini. Selain
menyebabkan pencemaran lingkungan, pestisida kimia juga berbahaya bagi
kesehatan manusia, antara lain menyebabkan iritasi, batuk, sesak nafas (sistem
pernafasan); sakit kepala, depresi (sistem neurologi); anemia (sistem hematologi);
penyakit kulit (sistem dermatologi) dan infertilitas (sistem reproduksi). Pestisida
kimia ini bisa masuk dalam tubuh manusia melalui ingesti, inhalasi dan absorpsi
melalui kulit (www.prn2.usm.my/mainsite/bulletin/sun/1997/sun6.html, 2006).
Dengan melihat dampak negatif pestisida kimia tersebut, maka perlu dilakukan
usaha-usaha untuk mengurangi pemakaian pestisida kimia. Salah satu hal yang
bisa dilakukan adalah penggunaan pestisida alami (biopestisida ) yang aman bagi
Tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss) merupakan tanaman yang
potensial sebagai bahan baku pestisida. Di Indonesia, tanaman ini banyak terdapat
di Bali dan Lombok (Sukrasno, 2004). Azadirachtin, salah satu jenis
tetranortriterpenoid yang didapat dari biji mimba (seed kernels) dan sedikit
terdapat di jaringan bagian tanaman mimba yang lain, telah dibuktikan sebagai
salah satu zat bioaktif tanaman mimba yang menjanjikan untuk pengendalian
hama terpadu ( Schmutterer, H, 1995).
Berbagai penelitian telah dilakukan untuk mengetahui kemampuan ekstrak
biji mimba sebagai biopestisida. Kahar Muzakhar, 1996, melaporkan bahwa
konsentrasi ekstrak akuades biji mimba optimum yang dapat menurunkan dan
menahan kelimpahan hama serangga pada tanaman kedelai adalah 1 %. Hasil
penelitian yang dilakukan oleh Mawardinur dkk, 2003, menunjukkan bahwa
perlakuan serbuk daun dan serbuk biji mimba baik sebagai racun kontak maupun
racun perut berpengaruh terhadap mortalitas dan waktu kematian Nezara Virdula
dibanding serbuk daun mimba. Konsentrasi ekstrak akueous biji mimba sebesar
1% sudah menyebabkan penghambatan yang signifikan terhadap pertumbuhan
miselium dan konidiogenesis dari Beauveria Bassiana (Depieri et al, 2005). Akan
tetapi Rodriguez-Lagunes et al dalam Depieri et al, 2005 mendapatkan hasil
bahwa tidak ada penghambatan yang signifikan dalam pertumbuhan vegetatif
jamur pada konsentrasi ekstrak akueous biji mimba 5%.
Berdasarkan uraian di atas, dilakukan penelitian untuk mengetahui
keefektifan fraksi n-heksana, kloroform dan etanol ekstrak biji mimba dalam
menghambat pertumbuhan diameter jamur Alternaria porri. Ekstrak biji mimba
diperoleh dengan metode ekstraksi soxhlet. Ekstraksi soxhlet merupakan suatu
ekstraksi yang berkesinambungan terhadap suatu padatan dengan pelarut panas.
Padatan dihaluskan untuk memperluas permukaan bahan sehingga meningkatkan
interaksi antara pelarut dan senyawa yang diekstrak. Efisiensi pemisahan dalam
ekstraksi soxhlet bergantung pada kelarutan senyawa yang diekstrak, volume
pelarut yang digunakan dan banyaknya pengulangan proses ekstraksi. Pelarut
yang digunakan dipilih berdasarkan tingkat kepolarannya. Analisis TLC
yang diperoleh. Analisis ini didasarkan pada perbedaan retensi
komponen-komponen yang terkandung dalam suatu senyawa di fasa diam terhadap fasa
gerak (pelarut).
Hasil penelitian yang dilakukan diharapkan dapat bermanfaat bagi
pengembangan biopestisida sehingga penggunaan pestisida kimia dapat dikurangi.
Jamur A. porri merupakan penyebab penyakit bercak ungu pada tanaman bawang
merah. Penyakit bercak ungu ini berupa bintik lingkaran konsentris berwarna
ungu atau putih-kelabu di daun, tepi daun kuning serta ujung-ujungnya
mengering. (www.naturalnusantara.co.id, 2006).
BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan
Bahan :
Biji mimba yang berasal dari Balai Proteksi Tanaman Obat Pasirjati Ujungberung,
Bandung), Jamur Alternaria porri yang diisolasi dari tanaman bawang merah di
lahan pasir Sanden, Kabupaten Bantul dan diperbanyak di laboratorium UPT.
BPPTK LIPI Yogyakarta, Bahan-bahan kimia berkualitas analitik yaitu n-heksana
(C6H14), chloroform (CHCl3), etanol (C2H5OH), akuades, PDA (Potato Dextrose
Agar), Dimetil Sulfoksida, Silika gel GF254, serium (IV) sulfat, etil asetat.
Alat :
Satu set alat ekstraktor Soxhlet, Satu set alat TLC, Autoclave, Pipet appendorf
1000 dan 5000 L, Evaporator Buchi, Desikator, Inkubator, Timbangan digital,
Jangka sorong, Kertas saring, Laminar flow, cawan petri, bor gabus, oase,
alat-alat gelas.
Metode
a. Ekstraksi Soxhlet Biji Mimba
Serbuk kering biji mimba (seed kernels) ditimbang sebanyak 40 gram,
dimasukkan dalam ekstraktor soxhlet dengan menggunakan 200 mL n-heksana
sampai cairan berwarna jernih. Ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan rotary
evaporator. Hasil yang didapat didinginkan dan ditimbang. Hasil ini disebut
sebagai ekstrak biji mimba fraksi n-heksana. Ampas sisa dikeringkan,
ditimbang kemudian diekstraksi kembali dengan pelarut kloroform sehingga
didapat ekstrak biji mimba fraksi kloroform. Prosedur yang sama dilakukan
sehingga didapatkan fraksi etanol.
b. Uji Invitro Ekstrak Biji Mimba Terhadap Jamur Alternaria Pori
Ditimbang 30 gram ekstrak biji mimba, dilarutkan dengan 0,2 mL DMSO dan
dimasukkan dalam cawan petri yang berisi 9,8 mL PDA sehingga diperoleh
konsentrasi ekstrak 3000 ppm. Campuran dikocok dan didiamkan sampai
memadat. Miselium jamur A. Porri dilubangi dengan bor gabus ukuran 6,6 mm
kemudian ditanam diatas media PDA. Setiap sampel ekstrak dilakukan
pengulangan tiga kali. Pengukuran pertumbuhan jamur dilakukan dari waktu
penanaman (Ho) sampai hari ke-7 (H7). Hal yang sama dilakukan dengan
konsentrasi ekstrak 5000 ppm. Persentasi penghambatan pertumbuhan jamur
dihitung dengan rumus :
% Hambatan = (Dc-Di) / Dc x 100 %, dengan
Dc : diameter jamur kontrol
Di : diameter jamur sampel (ekstrak)
Pengaruh perbedaan antara kontrol dan ekstrak biji mimba terhadap pertumbuhan
jamur A. porri dilakukan dengan uji statistika One-way Anova dilanjutkan dengan
Duncan Test dengan derajat kepercayaan 0,95.
c. Analisis TLC
Analisis TLC dilakukan di laboratorium Biologi-Farmasi, Fakultas Farmasi UGM.
Ekstrak biji mimba ditotolkan pada pelat silika gel GF254, dikembangkan dengan
pelarut etil asetat 100% dan dianalisis dengan sinar UV 254 nm dan pereaksi
penampak bercak serium (IV) sulfat.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pelarut n-heksana bersifat non polar, kloroform bersifat semi polar dan
etanol bersifat polar dibandingkan n-heksana dan kloroform. Hasil ekstraksi
Tabel 1. Hasil ekstrak serbuk biji mimba dengan 3 macam pelarut.
Pelarut Rendemen (%) Sifat fisik
n-heksana 32,53 Oily, cokelat kekuningan
kloroform 9,28 Padat, cokelat muda
etanol 9,11 Padat, cokelat tua
Tabel 1 di atas memperlihatkan bahwa ekstrak biji mimba dengan pelarut
n-heksana menghasilkan rendemen paling besar yaitu 32,53%. Ekstrak yang
diperoleh berupa cairan oily berwarna cokelat kekuningan. Kemungkinan ekstrak
yang terdapat dalam n-heksana adalah minyak dan senyawa-senyawa non polar
dari biji mimba. Ekstrak yang diperoleh dengan pelarut kloroform dan etanol
mempunyai rendemen yang lebih kecil yakni 9,28% dan 9,11%. Hal ini
mengindikasikan bahwa senyawa-senyawa yang bersifat polar yang terkandung
dalam biji mimba lebih sedikit dibandingkan senyawa semi polar dan non polar.
Ketiga ekstrak yang diperoleh kemudian diuji secara in vitro terhadap
jamur Alternaria porri. Pengukuran pertumbuhan diameter jamur A. Porri
dilakukan dari hari penanaman (Ho) sampai hari ke-7 (H7). Konsentrasi ekstrak
yang digunakan adalah 3000 dan 5000 ppm. Pengaruh penghambatan ketiga
ekstrak terhadap pertumbuhan radial jamur disajikan dalam gambar 1.
Gambar 1. Persentase hambatan jamur A. Porri pada hari ke-7 dalam ketiga
macam ekstrak.
Gambar 1 memperlihatkan bahwa secara keseluruhan, ketiga ekstrak dalam dua
konsentrasi, 3000 dan 5000 ppm, menghambat pertumbuhan diameter jamur A.
porri. Ekstrak dengan konsentrasi 5000 ppm lebih efektif dalam menghambat
pertumbuhan radial jamur daripada ekstrak dengan konsentrasi 3000 ppm. Hal ini
berarti peningkatan konsentrasi ekstrak biji mimba berbanding lurus dengan
peningkatan penghambatannya terhadap pertumbuhan diameter jamur A. Porri.
Persentase hambatan untuk kedua konsentrasi secara berurutan dari yang
paling besar dihasilkan oleh ekstrak fraksi etanol, kloroform dan n-heksana. Besar
persentase hambatan ekstrak fraksi etanol, kloroform dan n-heksana berturut-turut
adalah 49,49% 39.53% dan 17,01% pada konsentrasi 3000 ppm dan sebesar
54,03%, 41,62% dan 24,28% pada konsentrasi 5000 ppm. Data ini menunjukkan
bahwa ekstrak etanol dengan konsentrasi 5000 ppm memiliki sifat antifungi
terhadap jamur A. porri yang paling tinggi. Namun demikian secara keseluruhan
ketiga ekstrak memiliki sifat antifungal terhadap A. Porri.
Ekstrak fraksi etanol dianalisis TLC dengan menggunakan pelat silika gel
GF254 sebagai fasa diam dan etil asetat 100% sebagai fasa gerak. Pelat kemudian
diperiksa dengan sinar UV 254 nm dan penampak bercak serium (IV) sulfat.
Kromatogram yang diperoleh disajikan dalam gambar 1, 2 dan 3.
Gambar 2. Detektor: serium (IV) sulfat Gambar 3. Detektor: UV-254 nm
Gambar 2 dan 3 memperlihatkan bahwa nampak lima bercak cokelat kemerahan
pada analisis TLC dengan detektor serium (IV) sulfat sedangkan penggunaan
detektor UV 254 nm hanya memunculkan satu bercak awal penotolan ekstrak dan 1gt
gyt 2 3 4 5
selebihnya ekstrak fraksi etanol mengalami pemadaman. Hal ini mengindikasikan
bahwa ekstrak biji mimba fraksi etanol kemungkinan mengandung senyawa
terpenoid. Bercak nomor lima pada gambar 1 yang nampak melebar kemungkinan
karena adanya trigliserida yang terkandung dalam fraksi etanol. Namun
diperlukan analisis lebih lanjut untuk mengetahui identitas senyawa-senyawa
tersebut secara spesifik.
Azadirachtin, zat bioaktif yang paling banyak terdapat di biji mimba,
termasuk dalam golongan tetranortriterpenoid dan bersifat polar (Schumutterer,
1995), sehingga kemungkinan besar zat ini terkandung dalam fraksi etanol.
Semakin polar suatu pelarut maka semakin banyak dapat mengambil azadirachtin.
Hal ini menjelaskan urutan sifat antifungi dari ekstrak n-heksana, kloroform dan
etanol. Ekstrak fraksi etanol yang berwarna cokelat tua juga mengindikasikan
terdapatnya azadirachtin yang juga berwarna cokelat gelap.
Dalam Grovindachari et al, 1998, sifat antifungi yang aktif dari minyak
biji mimba merupakan campuran dari tetranortriterpenoids. Pengujian dengan
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) menunjukkan bahwa
komponen utama fraksi yang aktif tersebut adalah 6-deasetilnimbin, azadiradione,
nimbin, salanin dan epoksiazadiradion. Grovindachari et al juga menyebutkan
bahwa jika masing-masing zat aktif tersebut diaplikasikan secara sendiri-sendiri
malah tidak menunjukkan aktivitas yang baik jika dibandingkan ketika semua zat
tersebut dicampur dan diaplikasikan. Campuran ini menunjukkan aktivitas
antifungi yang mengindikasikan efek kesinergisan. Hal inilah yang kemungkinan
menyebabkan ekstrak fraksi n-heksana yang bersifat oily juga memiliki
kemampuan menghambat pertumbuhan diameter radial jamur A. porri.
Sifat antifungi dari ekstrak biji mimba juga kemungkinan disebabkan
karena ekstrak tersebut mengandung senyawa sulfur. Balandrin, et al dalam
Schmuterrer, 1995, mengidentifikasi bahwa asiklik di-, tri- dan tetrasulfida
merupakan konstituen utama dari bagian volatil pada biji mimba. Namun
demikian, mekanisme aksi dari zat bioaktif biji mimba terhadap pertumbuhan
vegetatif dan reproduksi jamur masih belum diketahui (Locke dalam Depieri et al,
Pada penelitian ini, ekstrak biji mimba baik dengan konsentrasi 3000
maupun 5000 ppm memiliki daya hambat terhadap pertumbuhan radial jamur A.
porri. Kemampuan daya hambat ini cukup bagus karena fungisida sintetik pun
jika memiliki konsentrasi penghambatan minimum antara 1000-5000 ppm
dianggap memiliki aktivitas yang bagus (Paulus, W. dalam Grovindachri et al,
1998). Hal ini membuka jalan bagi kemungkinan pengembangan ekstrak biji
mimba sebagai fungisida alami.
Uji statistika One-Way Anova dilanjutkan dengan Duncan Test dengan
derajat kepercayaan 95%, dilakukan untuk mengetahui apakah ada perbedaan
yang signifikan dengan penggunaan berbagai pelarut dalam penghambatan
pertumbuhan diameter jamur A. porri. Hasil yang diperoleh adalah disajikan
dalam tabel 2 berikut:
Tabel 2. Pengaruh berbagai macam pelarut
terhadap pertumbuhan
diameter jamur A. porri
Pelarut Rata-rata diameter (cm)
3000 ppm 5000 ppm
DMSO
(kontrol)
3,600 c 3,600 c
etanol 1,8167 a 1,6533 a
kloroform 2,1767 a 2,1033 b
n-heksana 2,9850 b 2,7233 b
Ket. Angka yang diikuti huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata (Duncan Test) dengan taraf kepercayaan 95%.
Hasil di atas menunjukan bahwa ada perbedaan yang signifikan dalam
penggunaan berbagai macam pelarut dibandingkan dengan kontrol terhadap
pertumbuhan diameter jamur A. porri., namun ekstrak fraksi etanol dan ekstrak
fraksi n-heksana saling tidak berbeda nyata.
1. Ekstrak biji mimba fraksi etanol paling efektif dalam menghambat
pertumbuhan diameter jamur A. porri dibandingkan fraksi n-heksana dan
kloroform dengan persentase penghambatan sebesar 49,49% dan 54,03%
pada konsentrasi 3000 dan 5000 ppm.
2. Ekstrak biji mimba fraksi etanol mengandung senyawa terpenoid.
3. Ada perbedaan yang signifikan dalam penggunaan berbagai pelarut
dibandingkan dengan kontrol terhadap penghambatan pertumbuhan
diameter jamur A. porri.
KESIMPULAN
Terima kasih kepada Kepala UPT. BPPTK LIPI atas penyediaan fasilitas
penelitian, Kepala Laboratorium Biologi-Farmasi Fakultas Farmasi UGM atas
analisis TLC, Ibu Vita T.R atas diskusi dan saran dalam penyusunan tulisan ini
dan Bapak Asep W. yang membantu kegiatan teknis di laboratorium.
UCAPAN TERIMAKASIH
Ucapan terimakasih bila perlu dapat dicantumkan untuk memberi
penghargaan kepada sposnsor penelitian atau pihak-pihak yang mendukung
penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Depieri, R.A., Martinez, S.S., and Menezes Jr, A.O., 2005, Compatibility of the Fungus Beauveria Bassiana (Ba ls.) Vuill. (Deuteromycetes) with extracts
of Neem Seeds and Leaves and The Emulsible Oil.,
www.scielo.br/schielo.php
Mawardinur, Chamzurni, T., Hasnah, 2000, Mortalitas Nympha dan Imago Nezara viridula L. Akibat Aplikasi Servbuk Daun dan Biji Mimba (Azadirachta indica A. Juss). Laporan Penelitian, Fakultas Pertanian Universitas Syiah Kuala: Banda Aceh.
Muzakhar, K., 1996, Optimasi Konsentrasi Pemberian Ekstrak Biji Nimba (Azadirachta indica A. Juss) Sebagai Pengganti Bahan Insektisida Sintesis Pada Budidaya Kedelai (Glycine max L.), Laporan Penelitian, Universitas Jember: Jember.
Seminar Nasional PATPI 2007 11
Rukmana, R. dan Oesman, Y.Y., 2002, Nimba Tanaman Penghasil Pestisida Alami, , Yogyakarta: Penerbit Kanisius.
Rosenblatt, D.H. and G. T. Davis, 1973, Laboratory Course in Organic Chemistry, Allyn and Bacon, Inc: Boston
Schmutterer, H., 1995, The Neem Tree, Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft mbH.
Sukrasno, 2004, Mimba Tanaman Obat Multifungsi. AgroMedia Pustaka: Jakarta.
www.prn2.usm.my/mainsite/bulletin/sun/1997/sun6.html., Hazardous Health Effects of Pesticides, 31 Mei 2006.
