EKSTRAKSI BIJI KURMA (Phoenix dactylifera L.) DENGAN METODE SOKLETASI DAN KARAKTERISASINYA WINDI RIYADI SKRIPSI

1

EKSTRAKSI BIJI KURMA (Phoenix dactylifera L.) DENGAN METODE SOKLETASI DAN KARAKTERISASINYA

WINDI RIYADI

SKRIPSI

PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

2018 M/1440 H

i

EKSTRAKSI BIJI KURMA (Phoenix dactylifera L.) DENGAN METODE SOKLETASI DAN KARAKTERISASINYA

SKRIPSI

Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains Program Studi Kimia

Fakultas Sains dan Teknologi

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Oleh : Windi Riyadi 1113096000037

PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

2018 M/1440 H

ii

PERNYATAAN

DENGAN INI SAYA MENYATAKAN BAHWA SKRIPSI INI ADALAH HASIL KARYA SENDIRI YANG BELUM PERNAH DIAJUKAN SEBAGAI SKRIPSI ATAU KARYA ILMIAH PADA PERGURUAN TINGGI ATAU LEMBAGA MANAPUN.

Jakarta, Agustus 2018

Windi Riyadi

1113096000037

i

ABSTRAK

WINDI RIYADI, Ekstraksi Biji Kurma (Phoenix dactylifera L.) dengan Metode Sokletasi dan Karakterisasinya, dibawah bimbingan YUSRAINI DIAN INAYATI SIREGAR dan TARSO RUDIANA.

Kurma (Phoenix dactylifera L.) adalah tanaman budidaya famili Arecaceae yang memiliki kandungan nutrisi yang penting bagi tubuh. Tidak hanya buah kurma, tetapi biji kurma juga memiliki nilai gizi yang salah satu manfaatnya sebagai antioksidan.

Tujuan penelitian ini adalah mengekstraksi senyawa antioksidan menggunakan sokletasi dan aktivitas antioksidan dari ekstrak biji kurma, serta identifikasinya.

Ekstraksi dilakukan dengan metode sokletasi menggunakan pelarut n-heksana, dietil eter dan etanol selama 1,5; 2; dan 2,5 jam. Ekstrak biji kurma dilakukan skrining fitokimia menggunakan pereaksi uji fitokimia dan pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) dan TBA (Thiobarbituric acid). Hasil penelitian diperoleh rendemen tertinggi pada waktu 2,5 jam diperoleh ekstrak etanol sebesar 4,929 %, sedangkan ekstrak n-heksana dan dietil eter sebesar 3,502 dan 3,369 %. Nilai IC

₅₀

ekstrak n-heksana, dietil eter dan etanol masing-masing sebesar 8396,556; 9826,880 dan 2,267 ppm. Persentase nilai daya hambat tertinggi ekstrak n-heksana dan dietil eter pada 500 ppm, yaitu 73,160 dan 68,739 %,

sedangkan pada ekstrak etanol pada 250 ppm sebesar 98,223 %. Hasil analisis LC-MS yang diduga memiliki aktivitas antioksidan di dalam ekstrak etanol, yaitu, 3-

(1,2)-1-hidroksi-2-[(metilamino)metil]sikloheksilfenol dan 1-(4-hidroksi-3- metoksifenil)-1,4-tetradekadien-3-on. Hasil analisis GC-MS yang diduga memiliki aktivitas antioksidan dalam ekstrak n-heksana, yaitu 2,4-di-tert-butilfenol dan asam 9-oktadekenoat, sedangkan dalam ekstrak dietil eter, yaitu asam 9-oktadekenoat.

Kata kunci: kurma (Phoenix dactylifera L.), sokletasi, antioksidan, DPPH, TBA

ii

ABSTRACT

WINDI RIYADI, Extraction Date Pits (Phoenix dactylifera L.) using Soxhletation and Characterization under the guidance of YUSRAINI DIAN INAYATI SIREGAR and TARSO RUDIANA.

Date palm (Phoenix dactylifera L.) is cultivated plants from Arecaceae family that has contain essential nutrients for the body. Not only date fruit, date pits also has nutritional that one of the benefits as antioxidant. One of the benefits of date pits are an antioxidant. The purpose of this study was to extraction antioxidant compounds and antioxidant activity from date pits extracts and identification. Extracts are obtained using methods soxhletation with solvents n-hexane, diethyl ether and ethanol for 1,5; 2; and 2,5 hours. Date pits extracts were screened phytochemical

using phytochemical reagens and measured antioxidant activity by DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) and TBA (Thiobarbituric acid) method of each date

pits extracts. The results obtained the highest yield was obtained ethanol extract at 2,5 h of 4,929 %, yield of n-hexane and diethyl ether was respectively 3,502 and 3,369

%. IC

50

of n-hexane, diethyl ether and ethanol each were 8396,556; 9826,880 and 2,267 ppm. LC-MS analysis results are suspected to has antioxidant activity in ethanol extract is 3-(1,2)-1-hydroxy-2-[(methylamino)methyl]cyclohexylphenol and 1-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,4-tetradecadien-3-one. GC-MS analysis results are suspected to has antioxidant activity in n-hexane extracts are 2,4-di-tert- butilphenol and 9-octadecenoic acid, and in diethyl ether extracts are 9-octadecenoic acid.

Keyword: date (Phoenix dactylifera L.), soxhletation, antioxidant, DPPH, TBA

iii

KATA PENGANTAR

Syukur Alhamdulillah penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya, sehingga dapat menyelesaikan skripsi ini.

Skripsi ini berjudul “Ekstraksi Biji Kurma (Phoenix dactylifera L.) dengan Metode Sokletasi dan Karakterisasinya”. Penelitian dilaksanakan di Pusat Laboratorium Terpadu (PLT) Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta disusun untuk memenuhi satu diantara syarat kelulusan dalam menempuh pendidikan Strata 1 (S1). Dalam penulisan skripsi, penulis mendapat banyak bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak. Oleh sebab itu, dalam kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih yang tulus kepada:

1. Yusraini Dian Inayati Siregar, M.Si, selaku dosen pembimbing I di Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Tarso Rudiana, M.Si, selaku pembimbing II yang telah memberikan saran, membimbing dan memberikan motivasi kepada penulis.

3. Drs. Dede Sukandar, M.Si, selaku penguji I dan Ketua Program Studi Kimia Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah memberikan saran dan pengarahan kepada penulis.

4. Anna Muawanah, M.Si, selaku penguji II yang telah memberikan saran dan pengarahan kepada penulis.

5. Dr. Agus Salim, M.Si, selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

iv

6. Isalmi Aziz, MT, selaku Sekretaris Program Studi Kimia Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang telah memberikan motivasi dan semangat kepada penulis dalam penulisan skripsi.

7. Sriyatun dan Mulyadi selaku orang tua yang selalu mendoakan dan memberikan dukungan kepada penulis.

8. Nurhasni, M.Si, selaku dosen PA yang telah memberikan dukungan kepada penulis.

9. Dosen kimia tercinta yang membimbing dan memberikan motivasi kepada penulis hingga penyusunan skripsi dapat terselesaikan dengan baik.

10. Fitriah, Nita Rosita, Adawiyah, dan laboran lain yang telah banyak membantu dalam penelitian dan memberikan motivasi kepada penulis.

11. Nur Azizah, Tatu, Desta, Dini dan teman-teman kimia angkatan 2013 yang telah memberikan semangat, sehingga penyusunan skripsi terselesaikan dengan baik.

12. Chaerul Umam yang telah mendoakan, motivasi, memberikan semangat, menemani dan membantu penulis, sehingga penulisan skripsi dapat terselesaikan.

Penulis menyadari masih terdapat banyak kekurangan dalam penulisan skripsi ini.

Penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari para pembaca.

Penulis mengharapkan agar skripsi ini bermanfaat bagi penulis, pembaca, atau peminat lain pada umumnya.

Jakarta, Agustus 2018

Windi Riyadi

v

DAFTAR ISI

Halaman

ABSTRAK ... i

ABSTRACT ... ii

DAFTAR ISI ... v

DAFTAR GAMBAR ... vii

DAFTAR TABEL ... ix

DAFTAR LAMPIRAN ... x

DAFTAR SINGKATAN ... xi

BAB I PENDAHULUAN ... 1

1.1. Latar Belakang ... 1

1.2. Rumusan Masalah ... 5

1.3. Hipotesis ... 6

1.4. Tujuan Penelitian ... 6

1.5. Manfaat Penelitian ... 7

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 8

2.1. Kurma ... 8

2.1.1. Klasifikasi Tanaman Kurma ... 9

2.1.2. Morfologi Tanaman Kurma ... 10

2.1.3. Kandungan Kimia Kurma ... 13

2.2. Antioksidan ... 15

2.2.1. Aktivitas Antioksidan ... 18

2.2.2. Metode Pengujian Antioksidan melalui Free Radical Scavenging ... 19

2.2.3. Metode Pengujian Antioksidan melalui TBA (Thiobarbituric acid) ... 21

2.3. Ekstraksi ... 23

2.4. Spektroskopi ... 26

2.4.1. Spektrofotometri UV-Vis (UV-Visible) ... 26

2.4.2. Liquid Chromatography-Mass Spectroscopy (LC-MS) ... 28

2.5.3. Gas Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS) ... 30

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ... 32

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ... 32

3.2. Alat dan Bahan ... 32

3.3. Prosedur Kerja ... 33

3.3.1. Preparasi Sampel ... 33

3.3.2. Ekstraksi dengan Metode Sokletasi ... 33

3.3.3. Penentuan Persentase Rendemen ... 34

3.3.4. Skrining Fitokimia ... 34

3.3.5. Penentuan Aktivitas Antioksidan ... 36

3.3.6. Analisis Senyawa menggunakan LC-MS ... 38

3.3.7. Analisis Senyawa menggunakan GC-MS... 39

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 40

vi

4.1. Preparasi Sampel ... 40

4.2. Ekstraksi dengan Metode Sokletasi ... 41

4.3. Skrining Fitokimia ... 44

4.4. Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH ... 50

4.5. Aktivitas Antioksidan dengan Metode TBA ... 56

4.6. Analisis Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS) ... 62

4.7. Analisa Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS) ... 65

BAB V SIMPULAN DAN SARAN ... 70

5.1. Simpulan ... 70

5.2. Saran ... 70

DAFTAR PUSTAKA ... 71

LAMPIRAN ... 84

vii

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1. Jenis kurma: (a) kurma ajwah (kurma nabi) (b) kurma saudi arabia

(c) kurma tunisia (d) kurma khalas ... 8

Gambar 2. Biji kurma ... 9

Gambar 3. Pohon kurma ... 10

Gambar 4. Tahap kematangan buah kurma... 12

Gambar 5. Minyak biji kurma ... 15

Gambar 6. Struktur BHA (1), BHT (2), TBHQ (3), PG (4) dan -tokoferol (5) ... 16

Gambar 7. Struktur asam tiodipropion (6) dan dilauriltiopropionat (7) ... 16

Gambar 8. Struktur asam askorbat (8), asam eritorbat (9) dan askorbil palmitat (10) 17 Gambar 9. Struktur superoksida dismutase (11), glutation peroksidase (12) dan glukosa oksidase (13) ... 17

Gambar 10. Struktur EDTA (14) dan asam sitrat (15) ... 18

Gambar 11. Reaksi radikal DPPH dengan antioksidan ... 20

Gambar 12. Pembentukan lipid peroksidasi... 22

Gambar 13. Metode maserasi ... 23

Gambar 14. Alat ekstraksi perkolasi ... 24

Gambar 15. Alat ekstraksi sokletasi ... 25

Gambar 16. Alat ekstraksi refluks ... 26

Gambar 17. Skema spektrofotometer UV-Vis ... 27

Gambar 18. Diagram skematik LC-MS ... 29

Gambar 19. Diagram skematik GC-MS ... 31

Gambar 20. Hasil ekstraksi biji kurma: (a) ekstrak n-heksana (b) ekstrak dietil eter (c) ekstrak etanol ... 43

Gambar 21. Mekanisme reaksi alkaloid dengan pereaksi mayer ... 46

Gambar 22. Mekanisme reaksi alkaloid dengan pereaksi wagner ... 47

Gambar 23. Mekanisme reaksi uji flavonoid ... 47

Gambar 24. Mekanisme reaksi uji kuinon ... 48

Gambar 25. Mekanisme reaksi uji tanin/fenolik ... 48

Gambar 26. Mekanisme reaksi uji triterpenoid/steroid ... 49

Gambar 27. Mekanisme reaksi uji saponin ... 50

Gambar 28. Mekanisme reaksi senyawa (a) asam askorbat dengan radikal DPPH, (b) tokoferol dengan radikal bebas DPPH ... 51

Gambar 29. Mekanisme senyawa flavonoid dengan radikal bebas ... 54

Gambar 30. Struktur senyawa kuinon (16), terpenoid (17) dan saponin (18)... 55

Gambar 31. Nilai serapan ikatan diena terkonjugasi asam linoleat ... 57

Gambar 32. Reaksi pembentukan senyawa kompleks MDA-TBA ... 58

viii

Gambar 33. Konsentrasi MDA ekstrak biji kurma ... 59 Gambar 34. Persentase daya hambat ekstrak biji kurma ... 60 Gambar 35. Hasil kromatogram LC-MS ekstrak etanol ... 62 Gambar 36. Struktur senyawa 3-(1,2)-1-hidroksi-2-[(metilamino)metil]sikloheksil

fenol (19) dan 1-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-1,4-tetradekadien-3-on

(20) ... 64

Gambar 37. Hasil kromatogram GC-MS ekstrak n-heksana (a) dan ekstrak

dietil eter (b) ... 66

Gambar 38. Struktur senyawa 2,4-di-tert-butilfenol dan asam 9-oktadekenoat ... 68

ix

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Komposisi kimia buah dan biji kurma (P. dactylifera L.) ... 14

Tabel 2. Hasil rendemen ekstrak n-heksana, dietil eter dan ... 42

Tabel 3. Hasil uji fitokimia ekstrak biji kurma (P. dactylifera L.)... 45

Tabel 4. Hasil uji aktivitas antioksidan metode DPPH ekstrak ... 52

Tabel 5. Hasil analisis LC-MS dugaan komponen kimia ekstrak etanol ... 63

Tabel 6. Hasil analisis GC-MS komponen kimia ekstrak n-heksana dan dietil eter ... 67

Tabel 7. Spesifikasi bahan utama ... 86

Tabel 8. Rendemen hasil ekstraksi ... 87

Tabel 9 . Hasil uji antioksidan (DPPH) ekstrak biji kurma... 89

Tabel 10. Penentuan waktu inkubasi optimum asam linoleat ... 94

Tabel 11. Penentuan absorbansi standar TEP ... 95

Tabel 12. Penentuan kandungan antioksidan dengan metode TBA ... 97

x

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Diagram alir penelitian ... 85

Lampiran 2. Spesifikasi bahan ... 86

Lampiran 3. Rendemen hasil ekstraksi ... 87

Lampiran 4. Hasil uji aktivitas antioksidan DPPH ekstrak biji kurma ... 89

Lampiran 5. Hasil uji aktivitas antioksidan TBA ekstrak biji kurma ... 94

Lampiran 6. Optimasi GC-MS ... 98

Lampiran 7. Optimasi LC-MS ... 100

Lampiran 8. Dokumentasi ... 101

xi

DAFTAR SINGKATAN μL : mikroliter

µm : mikrometer

BHA : Butyl Hydroxy Anisol BHT : Butyl Hydroxy Toluene cm : sentimeter

DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EC

₅₀

: Efficient concentration

EDTA : Ethylenediaminetetra acetid acid FTIR : Fourier Transform Infra Red

GC-MS : Gas Chromatography-Mass Spectrometry gr / g : Gram

GSH : Glutathione

HPLC : High Pressure Liquid Chromatography

HPLC MS : High Pressure Liquid Chromatography Mass Spectrometry IC

50

: Inhibition Concentration

IR : Inframerah KBr : Kalium Bromida

KG : Kromatografi kolom gravitasi KLT : Kromatografi Lapis Tipis KVC : Kromatografi Vakum Cair LC : Liquid Chromatography

LC-MS : Liquid Chromatography-Mass Spectrometry MDA : Malondialdehid

MDA-TBA : Malondialdehid-Thiobarbituric Acid mg : milligram

mL : mililiter

mM : milimolar

mm : milimeter

xii

MS : Mass Spectrometry nm : nanometer

P. dactylifera L. : Phoenix dactylifera Linn.

PG : Propyl Gallate pH : potensial hidrogen

PLT : Pusat Laboratorium Terpadu ppm : part per million

PUFA : Polyunsaturated fatty acid Rf : Retention Factor

ROS : Reactive Oxygen Species SOD : Superoksida dismutase TBA : Thiobarbituric Acid TBArs : TBA-reacting substance TBHQ : Tert-Butyl Hydroxy Quinone TCA : Trichloroacetic acid

TEP : 1,1,3,3-tetraetoksipropana TLC : Thin Layer Chromatography

TLC-DPPH : Thin Layer Chromatography-1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl USDA : United States Departement of Agriculture

UV : Ultraviolet

UV-Vis : UV-Visible

1

BAB I PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Allah SWT telah menciptakan tumbuh-tumbuhan yang beranekaragam.

Tumbuhan merupakan salah satu makhluk hidup ciptaan Allah yang memiliki banyak manfaat (Khariruddin, 2015). Keanekaragaman hayati merupakan bukti kebesaran Allah yang diciptakan dengan berbagai manfaat, yakni rezeki yang bisa diambil oleh makhluk hidup untuk kebutuhan hidupnya. Allah SWT berfirman dalam Surah Qaaf ayat 9-11 sebagai berikut:

Artinya: “Dan Kami turunkan dari langit air yang banyak manfaatnya lalu Kami tumbuhkan dengan air itu pohon-pohon dan biji-biji tanaman yang diketam dan pohon kurma yang tinggi-tinggi yang mempunyai mayang yang bersusun-susun, untuk menjadi rezeki bagi hamba-hamba (Kami), dan Kami hidupkan dengan air itu tanah yang mati (kering). Seperti itulah terjadinya kebangkitan” (QS. Qaaf : 9-11).

Surah Qaaf ayat 9-11 menjelaskan bahwa Allah SWT telah menurunkan air hujan

dengan banyak manfaat, seperti menumbuhkan tanaman-tanaman dan menyuburkan

tanah yang kering. Allah SWT juga menumbuhkan dari kebun-kebun dan biji-bijian

yang dipanen, pohon kurma yang menjulang tinggi sebagai bahan makanan dan

rezeki untuk seluruh hamba-Nya (Asy-Syanqithi, 2006).

2

Allah SWT menciptakan tumbuh-tumbuhan dari benih yang tumbuh menjadi kecambah dan berkembang menjadi pohon hingga berbuah dan kematangan buah tersebut dapat dimanfaatkan. Selain dapat diambil kayunya, tanaman juga dapat dimanfaatkan di bidang pengobatan, pertanian dan sebagainya. Salah satu tanaman yang digunakan sebagai tanaman obat adalah kurma (Phoenix dactylifera L.). Buah kurma menjadi salah satu makanan favorit Nabi Muhammad SAW karena kandungan gizi yang terdapat pada buahnya hampir sempurna tanpa ada dampak buruk sedikitpun bagi yang mengonsumsinya. Allah SWT sendiri telah melebihkan buah kurma di atas buah-buah yang lain (Khariruddin, 2015).

Buah kurma (P. dactylifera L.) baik dikonsumsi karena memiliki kandungan nutrisi yang penting bagi tubuh diantaranya mineral dan vitamin (Wijayanti, 2013).

Kurma lebih banyak dimanfaatkan pada bagian buah daripada bijinya. Tidak hanya dapat dikonsumsi secara langsung, buah kurma juga dapat diolah menjadi berbagai produk kurma. Oleh karena itu, biji kurma menjadi limbah utama pada produk olahan buah kurma termasuk pada saat bulan suci ramadhan. Namun pemanfaatan biji kurma belum banyak dilakukan terkait dengan pengetahuan mengenai manfaat dan kandungan nutrisi yang ada di dalamnya.

Penelitian mengenai ekstraksi biji kurma sudah banyak dilakukan di berbagai negara, seperti Arab Saudi, Tunisia, Pakistan, Amerika hingga Indonesia. Namun, masih sedikit penelitian mengenai ekstraksi dan pemanfaatan biji kurma di Indonesia.

Ekstraksi biji kurma umum dilakukan menggunakan pelarut yang memiliki perbedaan

kepolaran, seperti etanol, etil asetat, dietil eter dan n-heksana. Ekstraksi yang

dilakukan dengan pelarut etanol akan diperoleh ekstrak yang bersifat polar,

3

sedangkan ekstraksi yang dilakukan dengan pelarut nonpolar akan diperoleh ekstrak nonpolar berupa minyak. Minyak biji kurma secara umum dapat diekstraksi menggunakan metode sokletasi dengan pelarut organik seperti, dietil eter dan n-heksana (Hossain et al., 2014).

Beberapa penelitian telah melakukan berbagai ekstraksi menggunakan metode sokletasi dengan perbandingan pelarut, ukuran partikel dan waktu tertentu. Hal ini dapat mempengaruhi perbedaan jumlah rendemen. Herchi et al. (2014) melaporkan bahwa rendemen tertinggi ekstrak biji kurma (Kentichi) diperoleh sebesar 7,1 % menggunakan petroleum eter. Ali et al. (2015) melaporkan bahwa rendemen optimum ekstrak biji kurma (Iraqi) sebesar 5 % diperoleh pada waktu ekstraksi 2 jam, ukuran partikel 0,4 mm dengan pelarut n-heksana menggunakan metode sokletasi.

Agung (2016) melaporkan bahwa rendemen tertinggi ekstrak biji kurma (Egyptian date) sebesar 9,5 % menggunakan pelarut etil asetat pada waktu ekstraksi 2 jam dan perbandingan biji kurma dengan pelarut 1:6.

Beberapa penelitian juga telah dilakukan mengenai salah satu manfaat biji kurma, yaitu sebagai antioksidan. Chaira et al. (2007) melaporkan bahwa aktivitas antioksidan pada ekstrak etil asetat biji kurma (Alig) mampu menghambat 50 % radikal bebas pada konsentrasi 29 ppm. Ghiaba et al. (2014) melaporkan bahwa ekstrak biji kurma (Tafezauine) aktivitas antioksidan tertinggi dengan nilai IC

50

sebesar 33,168 ppm. Bouhlali et al. (2015) melaporkan bahwa aktivitas antioksidan ekstrak biji kurma (Boufgous) memiliki nilai IC

₅₀

sebesar 166 ppm.

Widyowati (2015) melaporkan bahwa rendemen tertinggi ekstrak biji kurma

(Khalas) dengan pelarut n-heksana sebesar 6,5 % dan pelarut etanol sebesar 5,9 %

4

menggunakan metode sokletasi. Sokletasi yang dilakukan menggunakan berat sampel 10 gram dan pelarut sebanyak 400 mL selama 5 jam. Pada penentuan persen daya hambat menggunakan metode TBA digunakan asam linoleat yang berasal dari Virgin Coconut Oil (VCO). Aktivitas antioksidan tertinggi pada ekstrak etanol dengan nilai IC

₅₀

sebesar 4,7 ppm dan nilai persen daya hambat oksidasi ekstrak n-heksana sebesar 82,3 % pada konsentrasi 50 ppm. Hasil analisis GC-MS diperoleh dugaan senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan dalam ekstrak n-heksana adalah 9-octadecenoic acid (Z)-methyl ester, sedangkan dalam ekstrak etanol adalah senyawa phenol,2,6- bis(1,1-dimethylethyl)-4-methyl, 1,2-benzenedicarboxyl acid dan dihydro methyl jasmonate. Namun, identifikasi senyawa antioksidan menggunakan GC-MS dianggap masih kurang efektif karena belum mendapatkan hasil yang sesuai dengan sifat masing-masing ekstrak. Senyawa aktif dalam ekstrak etanol terdapat golongan senyawa yang tidak tahan panas, sehingga perlu dilakukan analisis menggunakan instrumen LC-MS. Hal inilah yang menyebabkan senyawa antioksidan dalam ekstrak etanol hanya terdeteksi lebih sedikit salah satunya golongan senyawa fenolik, yaitu phenol,2,6-bis(1,1-dimethylethyl)-4-methyl. Habib and Ibrahim (2013) telah melaporkan bahwa terdapat banyak senyawa polifenol yang dianalisis menggunakan LC-MS dari biji kurma (Khalas) yang diekstraksi menggunakan pelarut metanol dan dilanjutkan dengan perbandingan pelarut asetonairasam trifloroasetat (TFA) sebesar 60 : 40 : 0,05 (v/v/v).

Penelitian ini akan dilakukan ekstraksi biji kurma varietas khalas dengan metode

sokletasi menggunakan tiga jenis pelarut, yaitu n-heksana, dietil eter dan etanol yang

5

memiliki indeks polaritas masing-masing pelarut sebesar 0,1; 2,8 dan 4,3.

Penggunaan ketiga pelarut bertujuan untuk membandingkan hasil rendemen tertinggi berdasarkan pelarut yang sering digunakan pada umumnya. Waktu optimum dalam proses ekstraksi biji kurma dapat mempengaruhi hasil ekstraksi dan aktivitas antioksidan, sehingga penelitian ini bertujuan untuk menentukan waktu optimum ekstraksi biji kurma (Khalas). Hasil rendemen tertinggi dilakukan skrining fitokimia dan pengukuran aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH (free radical scavenging assay) dan metode TBA (Thiobarbituric acid). Pada penentuan persen daya hambat menggunakan metode TBA digunakan asam linoleat yang berasal dari Soybean Oil. Aktivitas antioksidan tertinggi pada ekstrak etanol dianalisis menggunakan LC-MS, sedangkan pada ekstrak n-heksana dan dietil eter dianalisis menggunakan GC-MS.

1.2. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang penelitian, maka rumusan masalah dalam penelitian ini adalah:

1. Berapakah rendemen terbesar dengan variasi pelarut (n-heksana, dietil eter dan etanol) dan waktu ekstraksi (1,5 jam; 2 jam dan 2,5 jam) menggunakan metode sokletasi?

2. Berapa nilai IC

50

ekstrak biji kurma menggunakan metode DPPH dan berapa persen nilai daya hambat ekstrak biji kurma menggunakan metode TBA?

3. Senyawa apa yang teridentifikasi di dalam ekstrak biji kurma yang memiliki

aktivitas antioksidan berdasarkan analisis LC-MS dan GC-MS?

6

1.3. Hipotesis

Berdasarkan latar belakang penelitian, maka rumusan masalah dalam penelitian ini adalah:

1. Didapatkan rendemen ekstrak biji kurma yang optimal berdasarkan pelarut (n-heksana, dietil eter dan etanol) dan waktu ekstraksi (1,5 jam; 2 jam dan 2,5 jam) menggunakan metode sokletasi.

2. Aktivitas antioksidan ekstrak etanol biji kurma lebih tinggi pada pengujian metode DPPH dibandingkan ekstrak n-heksana dan dietil eter, dan aktivitas antioksidan ekstrak n-heksana dan dietil eter biji kurma lebih baik menggunakan metode TBA.

3. Senyawa golongan fenolik dan senyawa golongan flavonoid memiliki aktivitas antioksidan berdasarkan hasil analisis menggunakan LC-MS dan GC-MS.

1.4. Tujuan Penelitian

Berdasarkan latar belakang penelitian, maka rumusan masalah dalam penelitian ini adalah:

1. Menentukan rendemen tertinggi berdasarkan perbedaan pelarut dan waktu ekstraksi biji kurma menggunakan metode sokletasi.

2. Menentukan nilai aktivitas antioksidan ekstrak biji kurma menggunakan metode DPPH dan metode TBA.

3. Menentukan senyawa kimia yang memiliki aktivitas antioksidan yang terkandung

dalam ekstrak biji kurma menggunakan LC-MS dan GC-MS.

7

1.5. Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi bahwa ekstrak biji kurma

hasil ekstraksi dengan pelarut n-heksana, dietil eter dan etanol menggunakan metode

sokletasi memiliki potensi sebagai antioksidan, pemanfaatannya sebagai antioksidan

alami dan sebagai produk tambahan bahan fungsional.

8

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Kurma

Kurma (Phoenix dactylifera L.) adalah salah satu tanaman famili Arecaceae yang diproduksi secara luas di daerah gurun panas Asia Tenggara dan Afrika Selatan, serta dipasarkan di seluruh dunia sebagai tanaman buah bernilai tinggi (Al-Farsi and Lee, 2008). Tidak hanya di negara luar, beberapa jenis kurma juga dipasarkan di Indonesia seperti pada Gambar 1.

Gambar 1. Jenis kurma: (a) kurma ajwah (kurma nabi) (b) kurma saudi arabia (c) kurma tunisia (d) kurma khalas (Satuhu, 2010)

Buah kurma memiliki rasa manis yang khas, sehingga banyak digemari mulai dari anak-anak hingga orang lanjut usia. Kurma memiliki banyak manfaat bagi kesehatan yang memiliki berbagai aktivitas biologi dan farmakologi, seperti mencegah pembekuan darah, mencegah penyakit stroke, membantu pertumbuhan tulang dan membantu menguatkan saraf, antioksidan, antimikroba, antimutagenik, antiinflamasi, antiviral, antifungal, antihiperlipidemik, hepatoprotektif dan nefroprotektif (Elgindi et al., 2015; El-Far et al., 2016; El Sohaimy et al., 2015;

Setiyono, 2011).

9

Biji kurma (Gambar 2) adalah produk limbah dari berbagai proses produksi buah kurma dan berbagai produk kurma. Biji kurma merupakan sumber kaya serat dan senyawa antioksidan alami yang berpotensi sebagai suplemen dari serat dan antioksidan di dalam industri farmasi dan obat-obatan, sebagai sumber minyak nabati dan sebagai bahan pangan fungsional melalui peningkatan nilai nutrisi produk pangan (Boukouada and Yousfi, 2009; Hossain et al., 2014). Di Arab, biji kurma dimanfaatkan untuk membuat minuman kopi bebas kafein (Al Juhaimi et al., 2011).

Biji kurma memiliki berat yang bervariasi sekitar 10-15% dari total massa buah kurma dan mengandung minyak sekitar 10 % (Herchi et al., 2014).

Gambar 2. Biji kurma (Shalaby, 2015)

2.1.1. Klasifikasi Tanaman Kurma

Kurma dalam berbagai negara dikenal sebagai sugar palm (English), Nakhal (Arabic), khajur (Hindi and Urdu), karchuram (Tamil, Malayalam) dan arjura (Kannada) (Al-Shahib and Marshall, 2003; Zaid, 1999).

United States Departement of Agriculture (USDA) menyatakan bahwa

klasifikasi botani dari tanaman kurma adalah sebagai berikut :

10

Kingdom : Plantae

Divisi : Magnoliophyta Kelas : Liliopsida Ordo : Arecales Famili : Arecaceae Genus : Phoenix

Spesies : Phoenix dactylifera Linn.

2.1.2. Morfologi Tanaman Kurma

Kurma termasuk ke dalam tanaman suku pinang-pinangan (palem) yang memiliki ciri tumbuhan yang sama dalam satu famili dengan pohon kelapa, pohon pinang dan lain-lain. Ciri-ciri tanaman kurma, yaitu berakar serabut, bentuk daun menyirip dan tulang daun sejajar (Manickavasagan et al., 2012). Pohon kurma (Gambar 3) memiliki tinggi sekitar 15-25 meter dan panjang daun 3-5 meter (Abul- Soad, 2010; Satuhu, 2010).

Gambar 3. Pohon kurma (Abul-Soad, 2010)

Pohon kurma berbuah sekali dalam setahun dan memiliki lima tahap perkembangan untuk mencapai tingkat kematangan buah setelah proses penyerbukan.

Proses kematangan buah kurma sangat lama karena memerlukan waktu selama tujuh

11

bulan. Tingkat kematangan buah kurma ditandai dengan warna kuning hingga coklat kemerahan. Rasa manis dan tekstur buah kurma bergantung pada tingkat kematangan. Beberapa perubahan eksternal dan internal diamati dengan warna dan komposisi kimia selama pertumbuhan dan perkembangan buah kurma. Tingkat kematangan buah kurma memiliki lima tahap perkembangan, yaitu Hababouk, Khimri, Khalal, Rutab dan Tamar (Gambar 4) (Baliga et al., 2011).

1. Tahap Hababouk

Tahap Hababouk adalah tahap pertama dan pasca pembuahan berlangsung selama empat sampai lima minggu. Buah kurma belum matang dan tertutup oleh kelopak. Buah kurma pada tahap ini berukuran kecil seperti kacang polong dan beratnya sekitar satu gram.

2. Tahap Khimri

Tahap Khimri disebut juga green stage atau tahap hijau. Perkembangan buah kurma pada tahap ini berlangsung selama sembilan sampai empat belas minggu.

Buah kurma pada tahap ini berwarna hijau, cukup keras dengan komposisi berat kering 80 % kelembaban dan 50 % gula (glukosa dan fruktosa). Pada tahap ini, buah kurma biasanya memiliki rasa yang pahit dan tidak cocok untuk dimakan.

3. Tahap khalal

Tahap Khalal disebut juga color stage. Tahap ini berlangsung selama enam

minggu dan buahnya matang secara fisiologis, keras dan matang. Pada tahap ini

tergantung varietasnya, warna buah kurma berubah dari kuning kehijau-hijauan,

kuning, merah muda, merah tua. Buah kurma mencapai berat dan ukuran maksimal

12

pada akhir tahap ini. Kenaikan konsentrasi gula yang cepat akibat penurunan kadar air (sekitar 50 - 85 % kadar air).

4. Tahap Rutab

Tahap Rutab disebut juga tahap matang yang lembut. Tahap ini berlangsung antara dua sampai empat minggu. Buah kurma mulai matang dan tekstur buah menjadi lembut. Astringency atau rasa sepat dari tahap sebelumnya berangsur-angsur hilang dan buah mulai memperoleh warna coklat atau hitam karena penurunan kadar air yang konsisten dan beratnya semakin berkurang. Pada tahap ini, adanya konversi sukrosa menjadi gula sederhana.

5. Tahap Tamar

Tahap Tamar (tahap matang penuh) merupakan tahap akhir dalam pematangan dan buah kurma tampak keriput. Buah kurma semi kering dan kering masing-masing memiliki hampir 50 % sukrosa dan mengurangi gula. Pada kebanyakan varietas, kulit menempel pada daging dan keriput lembut saat daging bagian dalam menyusut.

Warna kulit dan daging yang mendasari berwarna gelap seiring waktu.

Hababouk Kimri Khalal Rutab Tamar Tamar Tamar (Farad) (Khajur soft) (Khajur hard)

Gambar 4. Tahap kematangan buah kurma (Baliga et al., 2011)

Buah kurma memiliki karakteristik bervariasi bergantung pada kultivarnya. Berat

buah kurma berkisar antara 6,0 - 28,7 g (Sakr et al., 2010), panjang 3,5 - 6,7 cm,

tekstur lunak sampai kering dan berwarna hijau, kuning, kuning gelap, coklat muda,

13

coklat, coklat gelap, hitam (Hammadi et al., 2009). Kulit buah berwarna hijau dan berangsur menguning, coklat, akhirnya kehitaman sesuai dengan tingkat kematangan buah. Buah kurma tidak bisa dimakan saat masih muda, selain rasanya yang sepat, tekstur daging buah pun keras dan bergetah. Setelah tua dan matang, pati dalam buah kurma akan berubah menjadi glukosa atau fruktosa sehingga rasanya manis (Satuhu, 2010).

2.1.3. Kandungan Kimia Kurma

Kurma baik dikonsumsi karena memiliki kandungan nutrisi yang penting bagi tubuh. Buah kurma mengandung karbohidrat, serat pangan, protein, lipid, beberapa vitamin, mineral dan senyawa bioaktif (Al-Farsi and Lee, 2008). Selain nilai gizi, buah kurma kaya akan senyawa antioksidan, yaitu senyawa karotenoid, flavonoid dan polifenol (Anjum et al., 2012).

Biji kurma mengandung banyak senyawa bernutrisi seperti, serat, protein, karbohidrat, lemak, vitamin, mineral dan senyawa antioksidan (Al-Farsi et al., 2007;

Nehdi et al., 2010). Biji kurma memiliki berat rata-rata 10 % dari berat buah kurma

(Ardekani et al., 2010). Biji kurma dari berbagai varietas mengandung minyak sekitar

5,7 - 8,8 g/100 g (Habib and Ibrahim, 2009). Perbedaan kandungan minyak di dalam

biji kurma disebabkan perbedaan varietas kurma, asal kurma, waktu panen dan

penggunaan pupuk yang dapat mempengaruhi kandungan gizi kurma (Nehdi et al.,

2010). Komposisi kimia yang terkandung pada buah kurma (Besbes et al., 2010) dan

biji kurma (Habib and Ibrahim, 2009) ditunjukkan pada Tabel 1.

14

Tabel 1. Komposisi kimia buah dan biji kurma (P. dactylifera L.) Komponen Buah Kurma (%) Biji Kurma (%) Karbohidrat 72,8 - 85,0 2,4 - 4,7

Protein 1,1 - 3,0 4,8 - 6,9

Lemak 0,5 - 3,3 5,7 - 8,8

Serat 5,9 - 18,4 67,6 - 74,2

Aktivitas antioksidan dalam kurma dipengaruhi oleh komposisi total fenolik, flavonoid, vitamin C, A dan E, β-karoten dan Glutathione (GSH) (El-Far et al., 2016). Kandungan antioksidan berbeda pada buah dan biji kurma bergantung pada varietas kurma. Herchi et al. (2014) melaporkan bahwa ekstrak biji kurma (kentichi) mengandung karotenoid sebesar 11,2 mg/kg minyak, total fenolik 319 mg/100 g minyak dan total flavonoid 41 mg/100 g minyak.

Minyak biji kurma menyediakan sumber potensial antioksidan alami seperti fenol, tokoferol dan sterol. Total fenol di dalam minyak biji kurma sebesar 52,1 % dari varietas Deglet Nour lebih banyak dibandingkan minyak biji kurma varietas Allig sebesar 22 %. Total tokoferol yang dikandung minyak biji kurma varietas Deglet Nour dan Allig didominasi oleh senyawa -tokoferol sebesar 24,9 % (Deglet Nour) dan 38,9 % (Allig). Total sterol dalam minyak biji kurma varietas Deglet Nour dan Allig sebesar 350 mg/100 g dan 300 mg/100 g (Besbes et al., 2004).

Minyak biji kurma secara umum dapat diekstraksi menggunakan pelarut organik seperti, dietil eter dan heksan dengan metode sokletasi (Abdalla, 2012; Ali, 2015;

Bouhlali, 2015; Hossain et al., 2014). Minyak biji kurma (Gambar 5) tertinggi

diperoleh dengan metode sokletasi menggunakan pelarut petroleum eter dari ekstrak

biji kurma (Kentichi) sebesar 7,1 % (Herchi et al., 2014), ekstrak biji kurma (Monaif)

15

sebesar 7,9 % (Al Juhaimi et al., 2011) dan pelarut n-heksana dari ekstrak biji kurma sebesar 6,5 % (Widyowati, 2015).

Gambar 5. Minyak biji kurma (Nehdi et al., 2010) 2.2. Antioksidan

Antioksidan adalah suatu senyawa atau komponen kimia yang dalam kadar atau jumlah tertentu mampu menghambat atau memperlambat kerusakan akibat proses oksidasi dan dapat memutus reaksi berantai dari radikal bebas (Sayuti, 2015;

Kumalaningsih, 2006). Antioksidan bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang bersifat oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut dapat dihambat (Winarti, 2010).

Senyawa-senyawa antioksidan dapat diklasifikasikan dalam lima tipe antioksidan berdasarkan fungsinya, yaitu:

1. Antioksidan primer, yaitu senyawa-senyawa fenol yang mampu memutus rantai

reaksi pembentukan radikal bebas asam lemak. Senyawa ini memberikan atom

hidrogen yang berasal dari gugus hidroksi senyawa fenol, sehingga terbentuk

senyawa yang stabil. Senyawa antioksidan yang termasuk kelompok ini, misalnya

Butyl Hydroxy Anisol (BHA) (1), Butyl Hydroxy Toluene (BHT) (2), Tert-Butyl

Hydroxy Quinone (TBHQ) (3), Propyl Gallate (PG) (4) dan tokoferol salah satuya

adalah -tokoferol (5) (Gambar 6).

16

OH

O

OH

OH

OH

HO HO

OH

O O

O

CH₃ CH₃

CH₃ C

H₃

CH₃ O

H

CH₃ CH₃ CH₃

Gambar 6. Struktur BHA (1), BHT (2), TBHQ (3), PG (4) dan -tokoferol (5) (Winarsi, 2007)

2. Antioksidan sekunder, yaitu senyawa-senyawa yang mempunyai kemampuan untuk berdekomposisi hidroperoksida menjadi produk akhir yang stabil. Tipe antioksidan ini pada umumnya digunakan untuk menstabilkan poliolefin resin.

Contohnya asam tiodipropion (6) dan dilauriltiopropionat (7) (Gambar 7).

O OH

S

O HO

C

H₃ O S O

O O

CH₃

Gambar 7. Struktur asam tiodipropion (6) dan dilauriltiopropionat (7) (Winarsi, 2007)

3. Oxygen scavenger, yaitu senyawa-senyawa yang berperan sebagai pengikat oksigen sehingga tidak mendukung reaksi oksidasi. Senyawa tersebut akan mengadakan reaksi dengan oksigen yang berada dalam sistem sehingga jumlah oksigen akan berkurang. Contohnya asam askorbat (8), askorbil palmitat (9) dan asam eritorbat (10) (Gambar 8).

(6)

(1) (2) (3) (4)

(5)

(7)

17

OH OH

O H O O

O

H

O O

O OH

H HO

OH

O O

OH

O O

OH OH

Gambar 8. Struktur asam askorbat (8), asam eritorbat (9) dan askorbil palmitat (10) (Winarsi, 2007)

4. Antioxidant enzyme, yaitu enzim yang berperan mencegah terbentuknya radikal bebas. Contohnya glukosa oksidase (11), glutation peroksidase (12), superoksida dismutase (SOD) (13) (Gambar 9) dan katalase.

Gambar 9. Struktur superoksida dismutase (11), glutation peroksidase (12) dan glukosa oksidase (13) (Sumaiya and Trivedi, 2015)

5. Chelators sequestrants, yaitu senyawa-senyawa yang mampu mengikat logam seperti besi dan tembaga dan mampu mengkatalis reaksi oksidasi lemak. Senyawa yang termasuk didalamnya adalah ethylenediaminetetra acetid acid (EDTA) (14) dan asam sitrat (15) (Gambar 10) (Octavia, 2009).

(8) (9)

(10)

(11) (12) (13)

18

N

N O HO O

HO O

HO

O

OH

HO

O OH

O OH

O HO

Gambar 10. Struktur EDTA (14) dan asam sitrat (15) (Winarsi, 2007)

2.2.1. Aktivitas Antioksidan

Aktivitas antioksidan merupakan kemampuan suatu senyawa atau ekstrak untuk menghambat reaksi oksidasi yang dapat dinyatakan dengan persen penghambatan (Brand-Williams, 1995). Antioksidan dibutuhkan untuk melindungi tubuh dari kerusakan sel oleh radikal bebas. Salah satu kerusakan membran sel akibat reaksi peroksidasi lipid membran yang mengandung PUFA (polyunsaturated fatty acid) (Slatter, 1984). Reaksi pembentukan peroksidasi lipid merupakan proses yang bersifat kompleks akibat reaksi asam lemak tak jenuh ganda penyusun fosfolipid membran sel dengan Reactive Oxygen Species (ROS), membentuk hidroperoksida (Langseth, 1995). Tingginya konsentrasi asam lemak tak jenuh dalam fosfolipid di setiap membran sel menjadi sasaran utama untuk reaksi dengan agen oksidasi dan memungkinkan terjadinya reaksi rantai panjang reaksi radikal bebas (Marnet, 2000).

Pengukuran metode Thiobarbituric Acid (TBA) berdasarkan terbentuknya senyawa TBA-reacting substance (TBArs), seperti malondialdehid (MDA) melalui proses autooksidasi (Kikuzaki and Nakatani, 1993). MDA merupakan salah satu senyawa produk dari reaksi peroksida lipid yang digunakan sebagai tanda terjadinya stress oksidatif, sehingga diperlukan antioksidan untuk meredam radikal bebas.

Peningkatan k adar MDA dapat meningkatkan produksi radikal bebas (Asni et al.,

(14) (15)

19

2009). Pengukuran MDA dilakukan sebagai indeks tidak langsung dari kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh peroksidasi lipid.

Metode uji aktivitas antioksidan yang digunakan secara umum selain metode TBA adalah metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) free radical scavenging assay (Krismawati, 2007). Metode DPPH digunakan secara luas untuk mengukur aktivitas antioksidan penangkap radikal dari berbagai ekstrak tanaman (Elmastas et al., 2007). Kelebihan metode DPPH antara lain sederhana, cepat, mudah, murah, tidak membutuhkan banyak sampel dan hasil yang akurat (Marxen et al., 2007). Hasil pengukuran metode DPPH menunjukkan kemampuan antioksidan sampel secara umum, tidak berdasarkan pada jenis radikal yang dihambat (Juniarti et al., 2009).

Pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode DPPH merupakan cara pengukuran aktivitas penghambatan radikal bebas secara langsung dengan radikal bebas sintetis DPPH. Sedangkan aktivitas antioksidan dengan metode TBA, radikal bebas yang dihambat berupa senyawa peroksida dan senyawa malonaldehida (Fitri, 2014).

2.2.2. Metode Pengujian Antioksidan melalui Free Radical Scavenging

Pengukuran antioksidan metode DPPH berdasarkan proses reduksi senyawa DPPH oleh antioksidan yang menyebabkan pengurangan intensitas warna larutan DPPH. Larutan DPPH berwarna ungu gelap yang berperan sebagai radikal bebas yang mengandung nitrogen tidak stabil dengan absorbansi kuat pada λ max 517 nm (Sayuti, 2015).

Uji kuantitatif pengukuran antioksidan dengan metode DPPH dilakukan

menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Larutan DPPH akan bereaksi dengan

20

senyawa antioksidan dan berubah menjadi DPPH-H (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyn) yang bersifat non-radikal. Adanya aktivitas antioksidan sebagai peredam radikal bebas akan mereduksi radikal DPPH dengan mendonasikan proton atau atom hidrogen membentuk senyawa DPPH non radikal yang ditandai dengan perubahan warna ungu menjadi kuning (Gambar 11). Perubahan tersebut kemudian diukur dengan spektrofotometer UV-Vis (Sayuti, 2015).

N N N⁺ O^-

O

N⁺ O^- O

N⁺

O^- O

N NH N⁺ O^-

O

N⁺ O^- O

N⁺

O^- O

Gambar 11. Reaksi radikal DPPH dengan antioksidan (Herold, 2007)

Parameter dalam aktivitas antioksidan adalah harga konsentrasi efisien atau efficient concentration (EC

50

) atau Inhibition Concentration (IC

50

), yaitu konsentrasi zat antioksidan yang menyebabkan 50% DPPH kehilangan karakter radikal atau konsentrasi suatu zat antioksidan yang memberikan persentase penghambatan 50 %.

Zat yang mempunyai aktivitas antioksidan tinggi akan mempunyai harga EC

50

atau IC

₅₀

yang rendah, yaitu kurang dari 200 ppm. Bila nilai IC

₅₀

yang diperoleh berkisar antara 200 - 1000 ppm, maka zat tersebut kurang aktif namun masih berpotensi sebagai zat antioksidan (Silalahi, 2010).

Nilai IC

50

diperoleh dari nilai absorbansi DPPH dikurangi dengan absorbansi sampel yang diukur dengan spektrofotometer UV-Vis (Zheng et al., 2011).

+ ^RH → ^{+ R•}

•

21

Absorbansi yang diukur adalah absorbansi larutan DPPH sisa yang tidak bereaksi dengan senyawa antioksidan di dalam larutan sampel atau larutan kontrol positif (Josephy, 1997). Nilai absorbansi tersebut diukur berdasarkan panjang gelombang maksimum larutan DPPH. Molyneux (2004) menyatakan bahwa nilai serapan maksimum DPPH dapat diukur pada kisaran panjang gelombang maksimum (

maks

), yaitu 515520 nm. Absorbansi yang diperoleh berdasarkan hasil pengukuran berbanding terbalik dengan konsentrasi sampel, persen inhibisi dan aktivitas antioksidannya. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak, semakin rendah absorbansi yang dihasilkan. Penurunan absorbansi menunjukkan peningkatan kemampuan ekstrak dalam menghambat aktivitas radikal bebas DPPH, sehingga persen inhibisi dan aktivitas antioksidan meningkat.

2.2.3. Metode Pengujian Antioksidan melalui TBA (Thiobarbituric acid)

Pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode TBA diawali dengan penentuan waktu inkubasi asam linoleat menggunakan metode diena terkonjugasi berdasarkan pengukuran serapan diena terkonjugasi yang terbentuk. Waktu inkubasi optimum terjadi jika nilai absorbansi mencapai maksimum dan terjadi penurunan nilai absorbansi. Nilai absorbansi maksimum tersebut merupakan indikator terjadinya oksidasi asam linoleat menjadi senyawa peroksida, sebelum terbentuk malondialdehida.

Pada waktu inkubasi asam linoleat akan teroksidasi dengan oksigen yang diawal

dengan kehilangan pasangan elektron pada ikatan rangkapnya. Reaksi ini terjadi

secara bertahap, sehingga asam linoleat yang terkena radikal bebas akan menstabilkan

22

diri dengan cara menata ulang ikatan rangkapnya dan terbentuk ikatan diena terkonjugasi. Selanjutnya asam linoleat terdekomposisi menjadi senyawa yang lebih sederhana dan relatif stabil, yaitu malondialdehida. Semakin banyak ikatan diena terkonjugasi yang terbentuk, maka semakin besar nilai serapan yang dihasilkan. Nilai absorbansi dari terbentuknya ikatan diena terkonjugasi diukur pada panjang gelombang 234 nm (Murray et al., 2003).

Gambar 12. Pembentukan lipid peroksidasi (Murray et al., 2003)

Malondialdehida yang terbentuk dari dekomposisi senyawa peroksida

direaksikan dengan TBA akan menghasilkan kompleks MDA-TBA. Kompleks

MDA-TBA berwarna merah muda yang dapat diukur dengan spektrofotometer UV-

Vis pada panjang gelombang 532 nm (Prawira et al., 2015). Senyawa

malondialdehida yang terbentuk dari hasil autooksidasi akan lebih sedikit apabila

diberi penambahan senyawa antioksidan. Nilai serapan yang diperoleh akan

sebanding dengan konsentrasi malondialdehida yang terbentuk dan berbanding

terbalik dengan aktivitas antioksidasinya (Tokur et al., 2006).

23

2.3. Ekstraksi

Ekstraksi adalah proses pengambilan komponen kimia yang larut dalam bahan atau sampel dengan menggunakan pelarut seperti air, alkohol, eter dan aseton (pelarut ekstraksi tidak boleh saling bercampur). Pemisahan komponen terjadi atas dasar kemampuan larut yang berbeda dari komponen-komponen dalam campuran (Harborne, 1987). Metode ekstraksi dengan menggunakan pelarut dibagi menjadi dua cara, yaitu :

1) Ekstraksi Cara Dingin a. Maserasi

Maserasi adalah proses ekstraksi dengan cara merendam sampel dalam pelarut dan dilakukan pada temperatur ruang (Gambar 13). Keuntungan metode ini adalah cara ekstraksi sederhana dan peralatan yang mudah digunakan, namun memerlukan waktu beberapa hari (Handa et al., 2008).

Gambar 13. Metode maserasi (Pratiwi, 2010) b. Perkolasi

Perkolasi adalah ekstraksi yang menggunakan pelarut yang selalu baru sampai

sempurna (exhaustive extraction) yang dilakukan pada temperatur ruang. Proses

perkolasi dengan cara melewatkan pelarut organik pada sampel sehingga pelarut akan

membawa senyawa organik bersama-sama pelarut (Darwis, 2000). Keuntungan

24

metode ini adalah tidak terjadi kejenuhan dan pengaliran meningkatkan difusi (zat terdorong keluar dari sel), sedangkan kekurangannya adalah cairan yang diperlukan lebih banyak dan resiko cemaran mikroba untuk penyari air karena dilakukan secara terbuka (Handa et al., 2008).

Gambar 14. Alat ekstraksi perkolasi (Irawan, 2012) 2) Ekstraksi Cara Panas

a. Sokletasi

Sokletasi adalah proses ekstraksi dengan suhu pemanasan berdasarkan titik didih

pelarut yang digunakan dan pelarut yang digunakan selalu baru akibat ekstraksi

kontinyu (berulang). Panas dari pelarut akan menyebabkan lisisnya dinding sel pada

sampel, sehingga pelarut mudah berinteraksi untuk melarutkan senyawa dan ekstrak

dibawa menuju labu distilasi. Metode ini menggunakan pemanasan pelarut berulang

dan menghasilkan pelarut yang selalu baru, sehingga kontak antara pelarut dengan

sampel lebih banyak. Akibatnya, komponen senyawa aktif yang terekstrak lebih

banyak. Kelebihan metode ini adalah jumlah sampel yang digunakan sedikit, dapat

digunakan untuk sampel dengan tekstur yang lunak dan tidak tahan terhadap

pemanasan secara langsung, digunakan pelarut yang lebih sedikit dan pemanasannya

dapat diukur, namun metode ini tidak dapat digunakan untuk mengekstrak senyawa-

senyawa yang mudah rusak akibat panas (Heinrich et al., 2012; Nikhal et al., 2010).

25

Metode sokletasi menggunakan alat soklet yang terdiri dari labu alas bulat sebagai tempat menampung pelarut dan ekstrak, tabung sifon sebagai tempat menampung sampel dan tempat terjadinya ekstraksi, pipa di samping tabung sifon sebagai jalur pelarut yang menguap kemudian didinginkan dan akan jatuh kedalam tabung sifon (Harborne, 1996). Alat soklet dapat ditunjukkan pada Gambar 15.

Gambar 15. Alat ekstraksi sokletasi (Moldoveanu, 2015) b. Refluks

Refluks merupakan ekstraksi menggunakan pelarut pada titik didihnya, selama

waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya

pendingin balik. Proses pengulangan pada residu pertama biasanya dilakukan 3-5

kali, sehingga dapat dikatakan termasuk proses ekstraksi sempurna (Handa et al.,

2008). Kelebihan dari metode refluks adalah metode ini digunakan untuk

mengekstraksi sampel-sampel yang mempunyai tekstur kasar, dan tahan pemanasan

langsung, namun membutuhkan volume total pelarut yang besar dan sejumlah

manipulasi dari operator (Handa et al., 2008).

26

Gambar 16. Alat ekstraksi refluks (Riley et al., 2014) 2.4. Spektroskopi

2.4.1. Spektrofotometri UV-Vis (UV-Visible)

Spektrofotometer merupakan instrumen yang mengukur jumlah intensitas cahaya yang diserap setelah melewati larutan sampel. Spektrofotometri adalah pengukuran berapa banyak zat kimia yang diserap atau ditransmisikan. Konsentrasi zat juga dapat ditentukan dengan mengukur intensitas cahaya yang terdeteksi dengan spektrofotometer. Spektrofotometer diklasifikasi menjadi dua jenis bergantung kisaran sumber panjang gelombang cahaya, yaitu spektrofotometer UV-Vis (200-800 nm) dan inframerah (700-15000 nm) dari spektrum radiasi elektromagnetik (Sanda et al., 2012).

Spektrofotometer UV-Vis (Gambar 17) memiliki rentang panjang gelombang

ultraviolet (200-400 nm) dan visible (400-800 nm) (Settle, 1997). Prinsip

spektrofotometri UV-Vis adalah interaksi yang terjadi antara energi yang berupa sinar

monokromatis dari sumber cahaya dengan materi yang berupa molekul pada panjang

gelombang tertentu. Spektrofotometri UV-Vis melibatkan energi elektronik yang

cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih

banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif (Rohman, 2007).

27

Gambar 17. Skema spektrofotometer UV-Vis (Owen, 2000)

Kolimator (lensa) pada spektrofotometri UV-Vis mentransmisi berkas sumber cahaya (foton) yang melewati monokromator (prisma) untuk dibagi menjadi beberapa komponen panjang gelombang (spektrum). Panjang gelombang yang diinginkan ditransmisi melalui celah dan melewati larutan sampel. Kemudian fotometer akan mendeteksi jumlah foton yang diserap dan mengirimkan sinyal ke sebuah galvanometer atau tampilan digital (Sanda et al., 2012).

Cahaya yang mempunyai energi sama dengan perbedaan energi tereksitasi yang

jatuh pada senyawa, elektron-elektron pada tingkat dasar dieksitasi ke tingkat

eksitasi. Elektron yang tereksitasi melepaskan energi dengan proses radiasi panas dan

kembali ke tingkatan dasar asal. Karena perbedaan energi antara tingkat dasar dan

tingkat tereksitasi spesifik untuk tiap-tiap bahan atau senyawa, maka frekuensi yang

diserap juga tertentu. Jika foton yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama

dengan yang dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan energi, maka

serapan dapat terjadi (Sastrohamidjojo, 2001).

28

Hukum Lambert-Beer menyatakan bahwa ada hubungan linear antara absorbansi dan konsentrasi sampel (Atkins and Paula, 2006). Metode yang paling sering digunakan secara kuantitatif untuk menentukan konsentrasi dari spesi yang diabsorbsi dalam larutan menggunakan hukum Lambert-Beer:

A = log

10 𝐼𝑜

𝐼

=  . l . c di mana A adalah absorbansi diukur

I

o

adalah intensitas cahaya insiden pada panjang gelombang tertentu, I adalah intensitas ditransmisikan,

l adalah panjang jalur yang melalui sampel, dan

c adalah konsentrasi spesies menyerap (Sanda et al., 2012).

2.4.2. Liquid Chromatography-Mass Spectroscopy (LC-MS)

Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS) atau High Pressure Liquid

Chromatography-Mass Spectrometry (HPLC-MS) adalah teknik analisis yang

menggabungkan pemisahan kromatografi cair resolusi tinggi dengan deteksi

spektrum massa yang sensitif dan spesifik (Parasuraman et al., 2014). Liquid

Chromatography memisahkan komponen senyawa nonvolatil dan termal tidak stabil,

sedangkan Mass Spectrometry memberikan informasi rinci struktural pada

kebanyakan senyawa, sehingga dapat diidentifikasi dengan tepat, tetapi tidak mudah

dipisahkan (Humbert et al., 2007; Hussain and Maqbool, 2014). LC-MS bekerja pada

suhu ruang, sehingga cocok untuk senyawa yang tidak tahan panas atau tidak mudah

menguap.

29

LC-MS dapat memberikan informasi tentang berat molekul, struktur, identitas dan kuantitas komponen sampel tertentu. LC-MS mampu menentukan senyawa dengan berat molekul tinggi (>100.000 Da), seperti biopolimer dan senyawa dengan berat molekul rendah (<1000 Da) seperti obat-obatan dan metabolit. LC-MS dapat digunakan secara luas di bidang industri makanan, farmasi dan industri kimia untuk analisis kuantitatif dan kualitatif (Ardrey, 2003; Parasuraman et al., 2014).

Gambar 18. Diagram skematik LC-MS (Parasuraman et al., 2014)

Instrumen LC-MS terdiri dari seperangkat kromatografi cair, sumber ionisasi, mass analyzer dan spektrometri massa (Gambar 18). Prinsip kerja LC-MS adalah komponen sampel dipisahkan oleh LC, kemudian disemprotkan ke sumber ion dengan tekanan atmosfer dan dikonversi menjadi ion dalam fasa gas. Kemudian ion- ion tersebut dilewatkan melalui suatu penganalisa massa (mass analyzer) yang berfungsi secara selektif untuk memisahkan ion menurut rasio massanya (m/z).

Spektrum massa yang diperoleh, dibandingkan dengan spektrum pada library MS,

sehingga akan diketahui bobot molekul dan struktur kimia dari analat tersebut (Skoog

30

et al., 2004; Parasuraman et al., 2014).

Umumnya LC-MS menggunakan analyzer TOF dengan teknik ionisasi ESI.

Pembacaan spektrum dengan metode ESI tidak terjadinya fragmentasi tetapi peak yang dihasilkan berupa kelipatan dari ion-ion yang ditembakkan. Berbeda dengan pembacaan spektrum pada metode EI yang dapat menfragmentasi senyawa menjadi fragmen yang khas, sehingga memudahkan dalam menentukan senyawa (Ardrey, 2003). Metode ESI berguna menganalisa ion molekul yang bersifat polar, nonvolatil dan memiliki bobot molekul yang lebih besar (Supratman, 2010).

2.5.3. Gas Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS)

Gas Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS) adalah suatu metode analisis yang menggabungkan kromatografi gas-cair dan spektrometri massa untuk mengidentifikasi zat yang berbeda dalam suatu sampel uji. Kromatografi gas dapat memisahkan senyawa volatil dan semi-volatil dengan resolusi besar, tetapi tidak dapat diidentifikasi, sedangkan MS memberikan informasi rinci struktural pada kebanyakan senyawa, sehingga dapat diidentifikasi dengan tepat, tetapi tidak mudah memisahkannya (Hussain and Maqbool, 2014).

GC-MS digunakan untuk mengidentifikasi senyawa yang tahan suhu tinggi,

seperti golongan asam lemak. Senyawa-senyawa yang terpisah dari analisis GC akan

keluar dari kolom dan mengalir ke dalam MS, kemudian senyawa-senyawa tersebut

teridentifikasi berdasarkan bobot molekul. Molekul-molekul analat yang bersifat

netral diubah menjadi ion-ion dalam fase gas. Ion-ion yang dihasilkan kemudian

dipisahkan menurut rasio massanya (m/e). Spektrum massa dari analat yang muncul

31

dibandingkan dengan spektrum pada library MS, sehingga akan diketahui bobot molekul dari analat tersebut (Skoog et al., 2004).

Gambar 19. Diagram skematik GC-MS (Hussain and Maqbool, 2014)

Instrumen GC-MS (Gambar 19) terdiri dari dua komponen utama, yaitu Gas Chromatography (GC) dan Mass Spectrometry (MS). Proses pemisahan pada GC terjadi di dalam kolom (kapiler) melibatkan dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak.

Fase diam adalah zat yang ada di dalam kolom dan fasa gerak adalah gas pembawa

(helium atau hidrogen) dengan kemurnian tinggi. Proses pemisahan terjadi karena

terdapat perbedaan kecepatan alir tiap molekul di dalam kolom. Perbedaan tersebut

disebabkan oleh perbedaan afinitas antar molekul dengan fasa diam yang ada di

dalam kolom. Proses deteksi sampel pada MS diawali dengan diubahnya sampel yang

berasal dari GC menjadi ion-ion gasnya terlebih dahulu. Kemudian ion-ion tersebut

dilewatkan melalui suatu penganalisa massa (mass analyzer) yang berfungsi secara

selektif untuk memisahkan ion dengan satuan massa atom yang berbeda. Ion-ion

tersebut dideteksi oleh electron multiplier detector (lebih peka dari detektor biasa)

(Lingga, 2004).

32

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Organik, Pusat Laboratorium Terpadu (PLT) Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta dan Laboratorium Kimia Pusat Laboratorium dan Forensik. Penelitian ini dimulai dari bulan November 2016 hingga Maret 2018.

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1.

Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian antara lain alat-alat gelas laboratorium, timbangan analitik (Ohaus), oven (Memmert), grinder (Fritsch), vortex (Thermolyne Maxi Mix Plus), penanggas listrik (Heidolph MR 3001 K), rotary evaporator (Heidolph Laborota 4000), perangkat sokletasi, inkubator (Memmert), Centrifuge (Hettich EBA 20), LC-MS/MS (Acquaty UPLC - XEVO G2-S QTOF ), GC-MS (Shimadzu QP-2010), spektrofotometer UV-Vis (Perkin Elmer Lambda 25).

3.2.2.

Bahan

Bahan tumbuhan yang digunakan sebagai sampel dalam penelitian ini adalah biji

kurma (P. dactylifera L.) jenis Al-Saad varietas Khalas yang berasal dari United Arab

Emirates. Bahan kimia yang digunakan adalah n-heksana p.a, etanol p.a, dietil eter

p.a, etil asetat p.a, kloroform p.a, aseton terdestilasi, tokoferol (Sigma), 2,2-

diphenyl-1-picrylhydrazyl (Sigma), asam linoleat (Sigma), buffer fosfat (Merck),

33

thiobarbituric acid (Merck), trichloroacetic acid (Merck), larutan 1,1,3,3- tetraetoksipropana (TEP) (Sigma), kertas saring Whatman No.41 dan akuades.

3.3. Prosedur Kerja 3.3.1. Preparasi Sampel

Biji Kurma dicuci menggunakan air bersih. Kemudian dikeringkan menggunakan oven pada temperatur 60

^o

C selama 2 jam. Selanjutnya biji kurma dihancurkan dengan grinder hingga didapatkan serbuk simplisia berukuran Ø:18 Mesh (2 mm).

3.3.2. Ekstraksi dengan Metode Sokletasi

Pembuatan ekstrak dari serbuk biji kurma dilakukan sesuai metode Ali (2015) dengan modifikasi. Serbuk biji kurma sebanyak 50 g dibungkus dengan kertas saring, diikat dengan tali dan dimasukkan ke dalam alat sokletasi. Pelarut sebanyak 250 mL

dimasukkan ke dalam labu alas bulat. Pelarut yang digunakan adalah pelarut n-heksana, dietil eter dan etanol. Sokletasi dilakukan pada temperatur masing-masing

titik didih pelarut, yaitu n-heksana sebesar 60-70

^o

C, dietil eter sebesar 34

^o

C dan etanol sebesar 70-80

^o

C dengan variasi waktu 1,5; 2; dan 2,5 jam (5 - 10 siklus/jam).

Selanjutnya, ekstrak biji kurma disaring menggunakan kertas saring Whatman No.41.

Ekstrak yang diperoleh dipekatkan menggunakan rotary evaporator pada temperatur

40

^o

C dengan kecepatan 90 rpm. Semua proses ekstraksi dilakukan triplo.