BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Nematologi, Laboratorium Virologi Tumbuhan Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Fitopatologi Balai Uji Terap Teknik dan Metode Karantina Pertanian (BUTTMKP) Bekasi, sejak Oktober 2011 hingga Maret 2012.
Metode Penelitian Pengamatan Gejala Penyakit Tanaman
Pemilihan lahan dan pendataan. Lahan yang digunakan untuk pengambilan sampel krisan adalah sentra produksi krisan di daerah Jawa Barat, yaitu: Bogor, Cianjur dan Sukabumi. Pada saat pengambilan sampel dilakukan pendataan untuk mendapatkan informasi tentang lokasi kebun, luas kebun, ketinggian tempat, jenis tanah, suhu, kelembaban, varietas krisan yang ditanam dan teknik budidaya.
Pengambilan sampel tanaman krisan. Pengambilan sampel tanaman krisan dilakukan untuk mengetahui kejadian penyakit akibat infeksi NPA pada lahan pertanaman dan untuk identifikasi nematoda dari tanaman bergejala NPA.
Sampel tanaman diambil secara sistematis (Gambar 3) berdasarkan pola pengambilan sampel menurut Coyne et al. (2007).
Keterangan: = sampel tanaman krisan = tanaman krisan dalam bedengan
Jumlah sampel yang diambil untuk masing-masing varietas krisan sebanyak 20 tanaman, dari setiap sentra produksi yang mewakili kondisi lahan pada pertanaman krisan.
Sampel yang diambil berupa akar dan tanah di daerah perakaran. Tanaman yang bergejala dicabut kemudian dipisahkan antara bagian akar dan tanahnya. Selanjutnya sampel dimasukkan dalam polybag, diberi label yang berisi keterangan tentang lokasi kebun, umur tanaman, varietas dan tanggal pengambilan sampel kemudian diletakkan dalam tempat terlindung untuk mencegah terjadinya kerusakan akibat fluktuasi suhu dan kelembaban selama perjalanan ke laboratorium Nematologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian IPB.
Menghitung kejadian penyakit akibat infeksi Meloidogyne spp. Kerusakan tanaman oleh infeksi nematoda merupakan kerusakan mutlak atau yang dianggap mutlak. Penilaian kejadian penyakit tanaman menurut Agrios (2005):
Kejadian penyakit =
Jumlah sampel tanaman yang terifeksi
x 100% Jumlah semua sampel tanaman
Tingkat keperidian Meloidogyne spp. Pengamatan terhadap tingkat keperidian NPA bertujuan untuk mengetahui kemampuan nematoda dalam menghasilkan keturunan. Tingkat keperidian diamati dengan menghitung jumlah paket telur (massa telur) yang terdapat pada akar tanaman krisan. Penghitungan paket telur pada akar tanaman krisan dengan mencuci akar perlahan-lahan untuk membersihkan tanah yang menempel pada bagian akar kemudian direndam dalam pewarna phloxine-B 0.15 g/l (15 mg phloxine B/100 ml aquades) selama 15 menit (Luc et al. 2005). Selanjutnya akar tanaman dibilas dengan aquades dan ditiriskan. Matriks gelatin paket telur akan terlihat berwarna merah jambu sampai merah kemudian jumlah paket telur tersebut diamati menggunakan mikroskop stereo dan dihitung dengan digital counter (Shoutey 1985). Hasil penghitungan dimasukkan ke dalam tabel skala jumlah massa telur (Shurtleff dan Averre 2000) sehingga didapatkan nilai indeks massa telur dari masing-masing varietas krisan.
Tabel 1 Indeks massa telur Meloidogyne spp. berdasarkan jumlah massa telur per tanaman (Shurtleff & Averre 2000)
Jumlah massa telur Indeks massa telur
0 0 1-2 1 3-10 2 11-30 3 31-100 4 >100 5
Ekstraksi sampel untuk mendapatkan nematoda Meloidogyne spp. Sampel akar dan tanah yang didapatkan dari sentra produksi krisan diekstraksi dengan metode pengabutan (Mistifier technique) dan metode corong Baermann (Baermann Funnel) yang dimodifikasi (Luc et al. 2005).
Metode corong Baermann yang dimodifikasi dilakukan dengan mengambil sampel tanah sebanyak 100 gram kemudian diletakkan di atas kertas tisu pada corong Baermann. Selanjutnya diisi air bersih secara perlahan-lahan sampai seluruh tanah di atas kertas tissue terendam dan diinkubasikan selama 48 jam. Setelah 48 jam klem pada ujung selang dibuka dan air rendaman ditampung ke dalam gelas Beaker. Apabila jumlah air terlalu banyak maka nematoda dapat disaring melalui saringan Ø 20 µm (625≠), nematoda yang terperangkap pada saringan diambil dengan cara menyemprotkan air dengan botol semprot, dan airnya ditampung pada gelas beaker.
Metode pengabutan dilakukan untuk mendapatkan NPA. Bagian akar tanaman yang telah diberi perlakuan pewarna phloxine-B, kemudian dimasukkan ke saringan yang diletakkan diatas corong. Aliran air berupa kabut halus disemprotkan di atas akar tanaman. Nematoda yang keluar dari akar ditampung dalam gelas. Sampel tersebut diinkubasi selama empat hari di dalam mistifier chamber. Metode ini memerlukan waktu lama tetapi proses pertukaran oksigen yang terjadi lebih baik dan jika terdapat getah, tanah, atau kotoran yang menempel di akar akan tercuci dan melunakkan jaringan akar sehingga memudahkan pada saat mengeluarkan nematoda betina dari dalam jaringan tanaman.
Identifikasi Spesies Meloidogyne Berdasarkan Karakter Morfologi
Hasil ekstraksi puru akar tanaman krisan diperiksa menggunakan mikroskop stereo. Identifikasi diawali dengan mengumpulkan massa telur yang tampak berwarna merah setelah diberi pewarna phloxine-B sehingga memudahkan dan memperjelas dalam identifikasi. Sebanyak 25 massa telur diambil kemudian dibuat preparatnya. Bagian akar yang membengkak dibedah dengan jarum pengait untuk mendapatkan nematoda betina.
Pembuatan preparat untuk nematoda betina sebanyak 25 slide dengan cara memotong bagian anterior dan posterior dengan scalpel kemudian bagian posterior dibersihkan dengan 45% asam laktat menggunakan jarum pengait nematoda. Setelah itu potongan nematoda betina dipindahkan ke atas gelas objek yang telah ditetesi dengan lactophenol blue dan ditutup dengan gelas penutup. Gelas penutup direkat dengan cat kuku kemudian preparat diamati menggunakan mikroskop kompon dengan perbesaran 400 x (Southey 1985).
Pembuatan preparat untuk fase telur, larva dan nematoda jantan dilakukan dengan mengumpulkan masing-masing 25 preparat untuk telur, larva dan nematoda jantan pada tempat terpisah, kemudian nematoda jantan dan larva difiksasi dengan formalin acetic acid (FAA) dan diletakkan pada gelas objek yang telah ditetesi lactophenol blue atau lactoglycerol lalu ditutup dengan gelas penutup. Gelas penutup direkat dengan cat kuku kemudian preparat diamati menggunakan mikroskop kompon dengan perbesaran 400 x (Shouthey 1985).
Identifikasi spesies Meloidogyne secara morfologi berdasarkan bentuk dan ukuran dari telur, larva, nematoda jantan dan pola perineal (perineal pattern) nematoda betina dewasa. Karakter morfologi yang digunakan adalah panjang dan lebar telur; panjang tubuh dan panjang stilet larva; serta panjang tubuh, spikula, stilet, knob stilet dan lebar knob stilet nematoda jantan. Pengukuran karakter morfologi (morfometri) dilakukan dengan mikroskop kompon Zeiss type Scope. A1-Axio dengan program Axio vision Release 4.8.2.
Hasil pengukuran larva dan nematoda jantan dianalisis dengan sidik ragam. Jika diantara varietas terdapat perbedaan dilanjutkan dengan uji Tukey pada taraf nyata 5% dengan bantuan program Minitab 16. Sedangkan identifikasi nematoda betina dewasa berdasarkan bentuk lengkungan dari pola perineal. Konfirmasi
spesies nematoda berdasarkan kunci identifikasi pada http://nematode.unl.edu, kunci identifikasi Meloidogyne spp. oleh Eisenback et al. (1981) dan kunci identifikasi NPA oleh Eisenback et al. (1991).
Identifikasi Spesies Meloidogyne Berdasarkan Karakter Molekuler
Identifikasi NPA berdasarkan karakter molekuler dilakukan dengan metode PCR. Tahapan identifikasi terdiri dari ekstraksi dan isolasi DNA, PCR, sikuen hasil PCR.
Ekstraksi dan Isolasi DNA. Pada tahap ini dilakukan persiapan bahan kimia yang akan digunakan untuk PCR dan ekstraksi DNA nematoda. Isolasi DNA dilakukan dari puru akar dan nematoda betina dewasa Meloidogyne berdasarkan metode Zouhar et al. (2000) yang dimodifikasi. Bahan kimia yang digunakan adalah bufer ekstrak hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) untuk ekstraksi DNA dari puru akar. Bufer ekstrak CTAB terdiri dari : 50 mM Tris HCl pH 8.0, 0.7 M NaCl, 10 mM ethylene-diamine-tetraacetic acid (EDTA), 1% CTAB, 1% ß-mercaptoethanol. Bufer ekstrak untuk ekstraksi DNA nematoda betina terdiri dari : 200 mM Tris HCl pH 8.5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA pH 8.0 dan 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS). Cara pembuatan bufer dicantumkan pada Lampiran 1.
Puru akar sebanyak 1, 3, 5, 7 dan 9 digerus di dalam nitrogen cair, pada mortar kemudian dilisis dengan 1 ml bufer ekstrak CTAB pada suhu 60 ºC selama 2 jam. Setiap 10 menit tabung mikro dibolak-balik untuk membantu proses lisis. Tabung mikro diambil dari penangas air dan didinginkan selama 3-5 menit pada suhu ruangan. Sebanyak 750 µl Chloroform dan Isoamilalkohol (24 : 1 v/v) ditambahkan ke dalam tabung mikro untuk memisahkan DNA dari protein dan komponen lain. Suspensi divorteks selama ± 3 menit kemudian disentrifugasi selama 20 menit pada kecepatan 11000 rpm. Supernatan hasil sentrifugasi ditambah sodium asetat (CH3COONa 3 M, pH 5.2) dengan perbandingan 1 : 10 dan dihomogenkan. Sebanyak 2.5 x volume ethanol 96% ditambahkan untuk presipitasi DNA kemudian diinkubasi pada suhu -20 ºC selama 60 menit atau semalam. Setelah disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rpm selama 15 menit, cairan dibuang . Ethanol 80% sebanyak 1 ml ditambahkan untuk mencuci pelet
(endapan DNA) dan disentfifugasi pada kecepatan 12 000 rpm selama 10 menit. Cairan ethanol dibuang dan endapan DNA dikeringkan. Bufer TE pH 8.0 sebanyak 30-100 µl ditambahkan sesuai ketebalan endapan DNA kemudian DNA yang didapatkan disimpan pada suhu -20 ºC hingga digunakan.
Ekstraksi DNA dari nematoda betina dewasa dilakukan dengan memasukkan masing-masing sebanyak 1, 3, 5, 7 dan 9 nematoda betina dewasa ke dalam tabung mikro 2 ml. Sampel tersebut ditambah bufer ekstrak (200 mM Tris HCl pH 8.5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA pH 8.0 dan 0.5% SDS) sebanyak 150 µl dan digerus sampai halus menggunakan conical grinder steril. Selanjutnya ditambahkan CI sebanyak 150 µl kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 11 000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil 100 µl dimasukkan ke dalam tabung mikro baru, ditambah larutan CH3COONa 3 M, pH 5.2 sebanyak 0.5 volume, dibolak-balik kemudian disimpan pada suhu -20 ºC selama 10 menit. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 12 000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil dan ditambah isopropanol, dibolak-balik kemudian disimpan pada suhu ruang selama 30 menit. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 12 000 rpm selama 20 menit, supernatan dibuang dan ditambahkan ethanol 80%. Suspensi disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 12 000 rpm, supernatan dibuang dan endapan DNA dikeringkan. Bufer TE pH 8.0 sebanyak 30-100 µl ditambahkan sesuai ketebalan endapan DNA kemudian disimpan pada suhu -20 ºC hingga digunakan.
Polymerase Chain Reaction. Setiap reaksi PCR terdiri dari 9.5 µl air bebas
nuklease, 12.5 µl 2x GoTaq ® Green Master mix, 1 µl primer Forward 10 µM, 1 µl primer Reverse 10 µM ditambah 1 µl DNA template sehingga jumlah volume 25 µl.
DNA diamplifikasi menggunakan tiga primer spesifik spesies M. javanica, M. incognita, dan M. arenaria (Zijlstra et al. 2000). Proses tersebut terjadi dalam mesin PCR Gene Amp PCR system 9700 (Applied biosystem). Primer forward untuk M. javanica adalah 5’-GGT GCG CGA TTG AAC TGA GC-3’dan reverse (5’-CAG GCC CTT CAG TGG AAC TAT AC-3’). Target DNA hasil amplifikasi berukuran 720 bp. Amplifikasi DNA M. javanica dilakukan dengan pemisahan rantai DNA awal pada suhu 94 ºC selama 4 menit, kemudian dilanjutkan dengan
30 siklus yang melalui tiga tahapan, yaitu pemisahan rantai DNA pada suhu 94 ºC selama 30 detik, penempelan primer pada suhu 55 ºC selama 45 detik dan sintesis DNA pada suhu 72 ºC selama 1 menit. Siklus terakhir ditambah tahapan sintesis selama 7 menit, kemudian siklus berakhir pada suhu 4 ºC.
Primer spesifik spesies untuk M. incognita adalah Finc 5’-CTC TGC CCA ATG AGC CGT TCC-3’. Rinc 5’-CTC TGC CCT CAC ATT AGG -3’ dengan target DNA hasil amplifikasi berukuran 999 bp. Amplifikasi DNA dilakukan dengan denaturasi awal pada suhu 95 ºC selama 2 menit, kemudian dilanjutkan dengan 35 siklus yang melalui tiga tahapan, yaitu pemisahan rantai DNA pada suhu 94 ºC selama 30 detik, penempelan primer pada suhu 57 ºC selama 45 detik dan sintesis DNA pada suhu 72 ºC selama 2 menit. Siklus terakhir ditambah tahapan sintesis selama 10 menit, kemudian siklus berakhir pada suhu 4 ºC.
Primer spesifik spesies untuk M. arenaria adalah Far 5’-TCG GCG ATA GAG GTA AAT GAC-3’. Rar 5’-TCG GCG ATA GAC ACT ACA AACT-3’ dengan target DNA hasil amplifikasi berukuran 420 bp. Amplifikasi DNA dilakukan dengan denaturasi awal pada suhu 94 ºC selama 4 menit, kemudian dilanjutkan dengan 35 siklus yang melalui tiga tahapan, yaitu pemisahan rantai DNA pada suhu 94 ºC selama 30 detik, penempelan primer pada suhu 55 ºC selama 45 detik dan sintesis DNA pada suhu 72 ºC selama 1 menit. Siklus terakhir ditambah tahapan sintesis selama 7 menit, kemudian siklus berakhir pada suhu 4 ºC.
DNA nematoda hasil amplifikasi dianalisis dengan elektroforesis. Larutan agarose 1% (0.4 gr agarose dimasukkan ke dalam 40 ml buffer TBE (Tris-HCl 45 mM, asam borat 45 mM, dan EDTA 1 mM) 0.5 x selanjutnya dipanaskan dengan microwave oven selama ± 2 menit agar gel agarose dapat larut dengan baik. Dalam keadaan hangat ditambahkan 2 µl ethidium bromide kemudian larutan agarose dituang ke dalam gel box yang dipasang sisir pada ujungnya untuk membuat lubang. Gel agarose dibiarkan dingin selama 10 menit pada suhu ruang. Setelah gel memadat, sisir dicabut sehingga terbentuk lubang-lubang kecil/sumuran (Yuwono 2005).
Pengukuran DNA menggunakan penanda TriDyeTM 100 bp ladder untuk primer M. javanica dan M. arenaria. TriDyeTM 1000 bp ladder untuk M.
incognita. Masing-masing sampel sebanyak 15 µl diisikan pada sumuran gel menggunakan mikro pipet dan dicatat urutan produk PCR di dalam sumuran.
Setelah DNA dimasukkan ke dalam lubang sampel, gel box ditutup dan arus listrik dialirkan. Kutub yang sejajar dengan lubang sampel DNA berupa kutub negatif, sedangkan kutub yang lainnya positif. Oleh karena DNA bermuatan negatif maka molekul-molekul DNA akan bergerak dari kutub negatif ke arah kutub positif (Yuwono 2005). Elektroforesis dilakukan pada tegangan 70 Volt selama 45 menit. Hasil elektroforesis divisualisasi dengan UV transiluminator, gambar pita-pita DNA direkam dengan kamera.
Sikuen hasil PCR. Sikuen hasil PCR dilakukan terhadap sampel yang positif. Sikuen dilakukan oleh PT. Macrogen Incorporation Seoul, Korea Selatan. Hasil sikuen dianalisis menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) dengan program optimasi untuk mendapatkan urutan basa DNA yang terdapat dalam situs National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Pembentukan pohon filogeni dengan software Clustal W (Bioedit version 7.0.5) dan program Mega version 5.05. berdasarkan pendekatan Neighbour Joining (NJ).
