Penetapan kadar/potensi antibiotik dengan cara mikrobiologi. Slamet Ibrahim Marlia Singgih School of Pharmacy ITB

(1)

Penetapan kadar/potensi

antibiotik dengan cara

mikrobiologi

Slamet Ibrahim Marlia Singgih

(2)

Pendahuluan

• Antibiotik : sintetik, semi-sintetik • Kasus retensi mikroba patogen 

menaikkan dosis nya atau mengganti dengan antibiotik baru

•  banyak penemuan2 antibiotik baru, sehingga perlu ditetapkan potensi nya

(3)

Acuan

• Farmakope Indonesia • CLSI

• USP (United States Pharmacopoeia),

• EP (European Pharmacopoeia), • BP (British Pharmacopoeia), • JP (Japanese Pharmacopoeia), • AOAC (American Association of

Analytical Chemists),

• US-CFR (Code of Federal Registry) and a custom single plate method.

(4)

(5)

Pengertian kadar vs potensi

• Kadar  jumlah per satuan berat/volume • Potensi  ukuran kekuatan /daya hambat

atau daya bunuh zat aktif terhadap mikroorganisme tertentu

(6)

Mengapa harus dengan cara

mikrobiologi?

• Respons mikroba terhadap antibiotik berbeda-beda

• Spesifik • Sensitif

(7)

Metode penetapan potensi suatu

senyawa

• Antibiotik • Hormon • Vitamin

(8)

Penetapan Potensi Antibiotik

Secara Mikrobiologi

• Dilakukan untuk senyawa antibiotik baru atau untuk tujuan konfirmasi

• Tidak semua antibiotik ditentukan potensinya secara mikrobiologi

• Penetapan dilakukan terhadap Bahan baku dan sediaan

(9)

Estimasi dari potensi antibiotik melalui perbandingan langsung antara sampel

(antibiotik uji) dengan antibiotik standar yang telah disahkan penggunaannya, terkalibrasi dengan baik, dan umum digunakan sebagai rujukan.

Prinsip uji potensi antibiotik berdasarkan

Farmakope Indonesia edisi IV 1995

(10)

Metode Umum

1. Lempeng (silinder / kertas cakram)

(11)

(12)

Metode Lempeng Silinder

Difusi antibiotik dari silinder yang dipasang tegak lurus pada lapisan agar padat dalam cawan petri atau lempeng yang berisi biakan

mikroba uji pada jumlah tertentu

(13)

(14)

(15)

Desain pengujian 5+1

• Larutan baku pembanding yang dibuat pengenceran S1, S2, S3, S4 dan S5 dengan tingkat perbandingan 1,25.

• Dosis tengah ditetapkan dulu, misalnya 10 IU/mL, maka: S2=8,0 IU/mL, S1=6,4

(16)

Dosis baku Dosis sampel

(17)

• Masing-masing larutan dimasukkan ke dalam selinder atau serapkan pada kertas cakram

sebanyak 100 μL di atas media agar yang telah diinokulasikan mikroba uji.

• Pre-inkubasi selama 1 jam, lalu inkubasi pada 35-37 ºC selama 18-24 jam.

• Setelah masa inkubasi, daerah hambat yang terbentuk diukur garis tengahnya.

(18)

Pola letak uji pada desain (5+1)

Dosis S3 Dosis lainnya S3 S1 S3 S3 S3 _S3 S2 _S4 S5 _U

(19)

Desain pengujian (5+1)

• Sebelum menghitung potensi , dilakukan terlebih dahulu koreksi garis tengah rata-rata diameter daerah hambat dosis larutan baku S1, S2, S4 dan S5

(20)

• Hitung diameter rata-rata S3 di semua cawan (Y_3T)

• Hitung diameter rata-rata S3 pada masing-masing cawan larutan baku S1,2,4 dan 5 (Y₃₁, Y₃₂, Y₃₄ dan Y₃₅)

• Hitung diameter S1,2,4 dan 5 (Y₁, Y₂, Y₄ dan Y₅)

(21)

Maka diameter koreksi masing-masing larutan baku adalah :

• S1 (a) = Y₁ + (Y_3T – Y₃₁) • S2 (b) = Y₂ + (Y_3T – Y₃₂) • S3 (c) = Y_3T

• S4 (d) = Y₄ + (Y_3T – Y₃₄) • S5 (e) = Y₅ + (Y_3T – Y₃₅)

(22)

Untuk kurva baku, dihitung diameter dosis terendah dan tertinggi yaitu :

YT = (3e + 2d + c – a ) 5 YR = (3a + 2b + c – e ) 5 YR = diameter hambat dosis terendah YT = diameter hambat dosis tertinggi

(23)

• Selanjutnya dibuat kurva baku pada kertas semilog :

• Sumbu X : log dosis

• Sumbu Y : diameter hambat

• Hubungkan titik-titik untuk S1 (YR) sampai S5 (YT)

(24)

Sebelum Perhitungan potensi sediaan uji,

dilakukan koreksi diameter larutan sampel U: Y_U koreksi = Y_S + (Y_U – Y_3U)

Y_3U= diameter rata-rata S₃ pada pengujian larutan U

Y_U= diameter rata-rata U pada cawan larutan U

Y_S = Hasil interpolasi S₃ pada kurva baku

(25)

Perhitungan Potensi sampel

• Potensi sediaan uji ditentukan dengan

menginterpolasi Y_U pada sumbu Y ke garis kurva baku dan tarik garis ke sumbu X

(diperoleh X_U)

• Dosis U = X_U/S3 x dosis S3

(26)

Linearity (Kelinieran)

(lanjutan) Perhitungan Kadar Diameter Hambat Log Ci x x x x x

a. Menggunakan persamaan garis D = b log C + a

log Cs = Ds – a/ b dimana :

Cs = kons. analit dlm sampel Ds = Diameter hambat

b. Menggunakan satu larutan baku dan larutan blangko

log Cs = (Ds – a)/(Db – a) . log Cb dimana :

(27)

Membandingkan hasil pengukuran

diameter hambat

Limit value mm 20 15 10 5 11 14 11 14 DIFFERENT SAME

(28)

(29)

(30)

(31)

Contoh

BMC Clin Pharmacol. 2009; 9: 1.

Published online 2009 January 16. doi: 10.1186/1472-6904-9-1. PMCID: PMC2640365

Application of microbiological assay to determine

pharmaceutical equivalence of generic intravenous antibiotics

Andres F Zuluaga,1,2_{Maria Agudelo,}1_{Carlos A Rodriguez,}1,2_{and Omar}

Vesga1,3

1_{GRIPE: Grupo Investigador de Problemas en Enfermedades Infecciosas, University of Antioquia, Medellín, Colombia} 2_{Department of Pharmacology and Toxicology, University of Antioquia, Medellin, Colombia}

3_{Section of Infectious Diseases, Department of Internal Medicine, University of Antioquia, Medellin, Colombia}

Corresponding author.

Andres F Zuluaga: andreszuluaga@une.net.co ; Maria Agudelo: mariaag10@yahoo.com ; Carlos A Rodriguez: andreios@yahoo.com ; Omar Vesga: omar.vesga@siu.udea.edu.co

(32)

Metode

• Pengujian dilakukan berdasarkan variasi konsentrasi terhadap efek inhibisi pada bakteri uji : Bacillus subtilis

ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 6538p dan

Staphylococcs epidermidis ATCC 12228, yang ditumbuhkan pada media agar (Difco™ Antibiotic Media), menghasilkan hubungan linear antara

konsentrasi zat -respons e linear dengan dua parameter : y-intercept (concentration) and slope (potency).

• Dibandingkan dua parameter tersebut dari 22 product generik (amikacin 4, gentamicin 15, and vancomycin 3 produk) dengan sediaan pembanding by Overall Test for Coincidence of the Regression Lines (Graphpad Prism 5.0).

(33)

Pengolahan data dalam proses

validasi

• Ditentukan linearity, limit of quantification, precision, accuracy, dan specificity utk

menvalidasi method for testing pharmaceutical equivalence.

• Untuk tujuan tersebut, log-transformed

concentrations (x-axis, log₁₀mg/L) dari setiap

produk diplot terhadap masing-masing diameter hambat nya (y-axis, rata-rata diameter dalam

mm); intercept (perpotongan dan kemiringan/slope garis regresi linear yang diekspresikan dengan

persamaan y = b + mx, dengan b sebagai nilai y-intercept dan m sebagai nilai kemiringan nya

(34)

• 5 Konsentrasi yang digunakan untuk masing-masing antibiotik : 0.5 – 256 mg/L (amikacin), 0.125 – 64 mg/L (gentamicin), dan 0.25 – 128 mg/L (vancomycin)

• The goodness of fit to the model (linearity) : dinyatakan dalam coefficient of determination (r2) dan standard error of estimate (S_yx).

• Dihitung pula x-intercept (log₁₀mg/L) dan

kemiringan garis regresi dengan kepercayaan 95%  confidence intervals (95% CI)

(35)

Results

• Validasi metode menghasilkan linearitas (r2 ≥ 0.98),

precision (intra-assay variation ≤ 11%; inter-assay

variation ≤ 10%), accuracy, and specificity tests , sesuai dengan syarat international pharmacopoeial .

• Kecuali pada vancomycin yang ditambahkan 25% API

(P_y_-_intercept= 0.001), penentuan potensi antibiotik

menunjukkan hasil yang ekuivalen. 21 sediaan generik memberikan undistinguishable slopes dan intercepts (P > 0.66).

• Estimasi potensi antibiotik: amikacin 99.8 - 100.5 ,

(36)

Vancomycin concentration (mg/L) Inhibition zone diameters (mean in mm ± SD) Coefficient of variation (%) Intra-day Coefficient of variation (%) Inter-day 128 18.00 ± 0.04 8.3 10.3 64 16.33 ± 0.02 5.6 10.5 32 14.16 ± 0.11 11.0 1.0 16 11.62 ± 0.37 7.4* 2.3 8 9.59 ± 0.00 4.6 6.5

Precision of the vancomycin bioassay

*An outlier value was excluded from the calculations (we only used five data to compute the CV)

BMC Clin Pharmacol. 2009; 9: 1.

(37)

(38)