PEMERIKSAAN BAKTERI LEPTOSPIRA PADA SAMPEL DARAH MANUSIA SUSPECT
LEPTOSPIROSIS MENGGUNAKAN METODE PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
EXAMINATION OF LEPTOSPIRA BACTERIA IN LEPTOSPIROSIS SUSPECT HUMAN BLOOD SAMPLES USING PCR METHOD (POLYMERASE CHAIN REACTION)
* Sefrita Tri Utami,Dyah Fitri Kusharyati, Hendro Pramono *
Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto Jl. Dr. Soeparno No. 63 Grendeng, Purwokerto
E-mail: http://bio.unsoed.ac.id
Accepted:26/8/2013 Reviewed:28/8/2013 Reviewed:8/10/2013 Revised:21/10/2013
ABSTRAK
Leptospirosis adalah penyakit zoonosis yang disebabkan oleh bakteri Leptospira. Kasus leptospirosis sering tidak menunjukkan gejala klinis yang spesifik dan sulit didiagnosis tanpa pengujian sampel di laboratorium. Pengujian dengan menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) dinilai lebih akurat dibandingkan dengan metode yang lain. Komponen-komponen yang dibutuhkan dalam pemeriksaan bakteri Leptospira pada sampel darah manusia menggunakan metode PCR adalah DNA template, enzim polymerase, Primer PU 1 dan
2+
Primer SU 1, Primer Lep R1, air, Mg , dan dNTP. Pemeriksaan bakteri Leptospira pada sampel darah manusia meliputi pengambilan sampel, isolasi DNA, pemeriksaan dengan metode PCR, dan running elektroforesis. Kata kunci: leptospirosis, Leptospira, metode PCR
ABSTRACT
Leptospirosis is a zoonotic disease, which is caused by leptospira. Leptospirosis cases often show no specific clinical symptoms and is difficult to diagnose without testing samples in the laboratory. Testing using PCR (Polymerase Chain Reaction) is considered more accurate than the other methods. Components required in the examination Leptospira bacteria in human blood samples using PCR method is DNA template, DNA polymerase
2 +
enzyme, forward primer (PU1 and SU1) and reverse primer (Lep R1), nuclease free water, Mg , and dNTPs. Examination of Leptospira bacteria in human blood samples include sampling, DNA isolation, examination by PCR, and electrophoresis running.
Key words: leptospirosis, Leptospira, PCR methods
PENDAHULUAN Gejala penyakit ini sangat bervariasi mulai
dari demam, ikterus, hemoglobinuria, pada hewan Leptospirosis adalah penyakit zoonosis,
yang hamil dapat terjadi abortus dan janin lahir mati, disebabkan oleh infeksi bakteri yang berbentuk
Leptospira. bahkan dapat menyebabkan kematian pada spiral dari genus Leptospirosis tersebar
1
penderitanya. Tingkat keganasan serangan luas di seluruh dunia, terutama pada daerah tropis.
leptospirosis tergantung dari serovar Leptospira dan Penularan leptospirosis pada manusia terjadi
spesies hewan yang terinfeksi pada daerah melalui kontak langsung dengan hewan terinfeksi
3,4,5
Leptospira atau secara tidak langsung melalui tertentu. Leptospirosis pada manusia dapat berupa penyakit ringan sampai berat tergantung genangan air yang terkontaminasi urin yang
Leptospira serovar yang menginfeksi. Penderita penyakit terinfeksi . Bakteri ini masuk ke dalam
leptospirosis yang kronis dapat bertindak sebagai tubuh melalui kulit yang luka atau membran
2
karier karena bakteri dapat bersarang di dalam ginjal mukosa.
minggu pertama setelah infeksi dan berlangsung monosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih sampai beberapa bulan. Kasus leptospirosis kasar perlu diperlakukan dengan detergen yang seringkali tidak menunjukkan gejala klinis yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium spesifik dan sulit didiagnosis tanpa pengujian dodesil sulfat (SDS). Langkah ini harus disertai sampel di laboratorium. Pengujian dengan dengan perusakan membran nukleus. Sel menggunakan metode PCR (Polymerase Chain mengalami lisis, remukan-remukan sel harus Reaction) dinilai lebih akurat apabila dibandingkan dibuang. Pembuangan remukan sel dilakukan
6
dengan metode yang lain. dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform, selanjutnya
METODE disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis
Bahan penulisan artikel ini adalah literatur dengan protease. DNA yang telah dibersihkan dan cara yang digunakan dalam penulisan ini adalah dari protein dan remukan sel masih tercampur studi literatur dari berbagai sumber baik berupa buku dengan RNA sehingga perlu ditambahkan
7 maupun artikel ilmiah yang berhubungan dengan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. pemeriksaan bakteri Leptospira menggunakan
Prinsip utama sentrifugasi adalah metode PCR.
memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul. DNA kromosom dan plasmid yang kemurniannya cukup tinggi akan diperoleh PEMBAHASAN
dengan menjalankan prosedur secara benar, Pemeriksaan bakteri Leptospira pada sampel
d a p a t d i l i h a t d a r i p e n a m p a k a n h a s i l darah penderita suspect leptospirosis melalui
elektroforesis yang baik. Tujuan dilakukannya beberapa tahapan berikut:
lima kali sentrifugasi adalah agar dalam proses
1. Isolasi DNA isolasi DNA akan didapatkan DNA murni yang
Isolasi DNA adalah memisahkan DNA bebas dari kotoran-kotoran sel, maupun RNA kromosom atau DNA genom dari komponen - dan protein. Ketelitian dan kecermatan dalam komponen sel lain. Sumber DNA bisa berasal pelaksanaan penelitian, sangat menentukan hasil 8 dari tanaman, kultur mikroorganisme, atau sel kemurnian DNA kromosom dan plasmid. manusia. Membran sel dilisis dengan Presipitasi merupakan tahap terakhir dalam menambahkan detergen untuk membebaskan isolasi DNA. Presipitasi bertujuan untuk isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut mengendapkan protein histon, sehingga untai-ditambahkan protease, yang berfungsi untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan mendegradasi protein dan RNAse, yang berikatan dengan protein histon, yang
9 berfungsi untuk mendegradasi RNA, sehingga menyebabkan DNA menjadi terlihat.
yang tinggal adalah DNA. Ekstrak tersebut B e r d a s a r k a n h a s i l i s o l a s i D N A 0
selanjutnya dipanaskan sampai suhu 90 C untuk m e n g g u n a k a n s a m p e l d a r a h m a n u s i a , menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA menunjukkan adanya kabut putih, hal ini dapat (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dikatakan bahwa isolasi DNA berhasil, sesuai
10
dengan etanol dan bisa dilarutkan kembali pernyataan, pekat atau tidaknya larutan DNA menggunakan air, akhirnya didapatkan DNA tergantung dari preparasinya, ditunjukkan
7
murni. dengan adanya kabut putih. Semakin baik
Isolasi DNA diawali dengan perusakan preparasinya, seringkali menghasilkan DNA dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat yang pekat. Hasil DNA yang didapatkan kurang dilakukan baik dengan cara mekanis seperti pekat, maka diperlukan adanya pemekatan untuk sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh, maupun meningkatkan konsentrasi DNA.
dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Isolasi DNA bakteri Leptospira Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan- menggunakan alat-alat, seperti sarung tangan bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah digunakan untuk menghindari hasil isolasi diresuspensi di dalam medium buffer terkontaminasi DNAse dari keringat atau
kontaminan lain pada tangan, serta menjaga mikroliter dan 40 mikroliter Proteinase K tangan dari larutan yang berbahaya. Tabung ditambahkan ke dalam eppendorf, kemudian eppendorf (tube) digunakan untuk menampung dihomogenkan dengan menggunakan vortex. larutan hasil ekstraksi, sedangkan vortex Selanjutnya, diinkubasi dalam waterbath selama
0
digunakan untuk menghomogenkan larutan 10 menit pada suhu 70 C. setelah diinkubasi, dengan prinsip menggunakan bantuan energi ditambahkan 100 mikroliter isopropanol dan listrik. Waterbath digunakan untuk inkubasi dihomogenkan menggunakan vortex. Larutan sampel DNA. Ice pack berfungsi untuk yang sudah homogen dipindah ke tabung high menyimpan DNA hasil isolasi. Microsentrifuge pure filter, kemudian disentrifugasi selama satu digunakan untuk sentrifugasi, mikropipet dan tip menit dengan kecepatan 8000 x g. Cairan berupa digunakan untuk memindahkan larutan secara kotoran yang terdapat di tabung koleksi dibuang. akurat, lemari pendingin digunakan untuk proses 500 mikroliter inhibitor removal buffer kondensasi. Tabung high pure filter berfungsi ditambahkan, kemudian disentrifugasi dengan untuk memisahkan natan dan supernatan yang kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. diperoleh ketika proses sentrifugasi. DNA Selanjutnya, cairan berupa kotoran yang terdapat sampel tidak luruh bersama kotoran, protein, di tabung koleksi dibuang. Wash buffer sebanyak maupun RNA, karena DNA akan menempel 500 mikroliter ditambahkan, kemudian pada filter yang terdapat dalam tabung tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 8000 x g selama (bagian yang berwarna putih). Pasangan dari 1 menit. Cairan berupa kotoran yang terdapat di tabung high pure filter ini dinamakan tabung tabung koleksi dibuang kembali, kemudian 500 koleksi (collection tube), yang berfungsi untuk mikroliter inhibitor removal buffer ditambahkan, menampung cairan berupa kotoran, protein, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 8000 maupun RNA pada saat proses sentrifugasi. x g selama 1 menit. Cairan berupa kotoran yang Tabung vakum digunakan untuk menampung terdapat di tabung koleksi dibuang, dan
7
sampel darah manusia. disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 x g selama 10 menit. Tabung koleksi dibuang, Sementara bahan yang digunakan
tabung mikro di masukkan ke dalam tabung meliputi sampel darah manusia. Binding buffer
eppendorf dan ditambahkan 200 mikroliter berfungsi untuk melisiskan sel sampel yang
0
elution buffer (70 C). Sentrifugasi selama 1 digunakan, sedangkan Proteinase K berperan
menit dengan kecepatan 8000 x g. Akhirnya, dalam perusakan protein yang terdapat dalam sel
purifikasi DNA template dihasilkan. darah manusia yang digunakan. Isopropanol
digunakan untuk presipitasi DNA setelah
disentrifugasi, yaitu pembuangan remukan sel 2. Pemeriksaan dengan PCR atau protein maupun RNA. Larutan inhibitor
Polymerase Chain Reaction (PCR) removal buffer berfungsi untuk menjaga agar
merupakan suatu metode yang digunakan untuk natan (sampel DNA) tetap menempel pada filter
amplifikasi urutan basa DNA tertentu (selektif). dan digunakan juga sebagai pencuci dan langkah
Metode yang ditemukan oleh Kary Mullis pada awal protokol elusi. Wash buffer digunakan
tahun 1987 ini dapat digunakan untuk sebagai pencuci dan langkah kedua dan ketiga
menggandakan urutan basa nukleotida tertentu pada protokol elusi. Larutan elution buffer
secara in vitro. Penggandaan urutan basa berfungsi untuk menghasilkan purifikasi DNA
nukleotida berlangsung melalui reaksi yang ditambahkan sebelum sentrifugasi terakhir
polimerisasi yang dilakukan berulang-ulang 7
agar didapatkan DNA yang benar-benar murni.
secara berantai selama beberapa putaran (siklus). Pemeriksaan DNA bakteri Leptospira Tiap reaksi polimerisasi membutuhkan untuk pemeriksaan High Pure PCR Template komponen-komponen sintesis DNA seperti untai Preparation Kit (Roche, Cat. No. 11 858 874 DNA yang akan digunakan sebagai cetakan 001). Langkah-langkah isolasi DNA diawali (template), molekul oligonukleotida untai dengan pengambilan 200 mikroliter sampel tunggal dengan ujung 3'-OH bebas yang darah manusia dan kemudian diletakkan dalam berfungsi sebagai prekursor (primer), sumber tabung eppendorf. Binding buffer sebanyak 200
basa nukleotida berupa empat macam dNTP tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), dan enzim DNA akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada dua buah polimerase. Langkah pertama dalam metode ini primer yang masing-masing menempel pada
11
adalah membuat DNA template. untai tunggal DNA template. Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer maju (forward DNA template adalah DNA untai ganda
primer) dan primer mundur (reverse primer). yang membawa urutan basa fragmen atau gen
Setelah menempel pada untai DNA template, yang akan digandakan. Urutan basa ini disebut
primer mengalami polimerisasi mulai dari tempat juga urutan target (target sequence).
penempelannya hingga ujung 5' DNA template. Penggandaan urutan target pada dasarnya
Dengan demikian, pada akhir putaran reaksi merupakan akumulasi hasil polimerisasi molekul
pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA, primer. Primer adalah molekul oligonukleotida
jika DNA template awalnya berupa sepasang untai tunggal yang terdiri atas sekitar 30 basa.
12 untai DNA. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena
adanya penambahan basa demi basa dari dNTP Pasangan-pasangan untai DNA yang yang dikatalisasi oleh enzim DNA polimerase. diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi akan Namun, pada PCR enzim DNA polimerase yang menjadi template pada putaran reaksi berikutnya. digunakan harus termostabil karena salah satu Begitu seterusnya hingga pada putaran yang ke n tahap reaksinya adalah denaturasi untai ganda diharapkan akan diperoleh fragmen DNA pendek DNA yang membutuhkan suhu sangat tinggi sebanyak 2n – 2n. Fragmen DNA pendek yang (sekitar 95ºC). Salah satu enzim DNA polimerase dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya yang umum digunakan adalah taq DNA sama dengan jarak antara kedua tempat polimerase, yang berasal dari bakteri termofilik penempelan primer. Fragmen pendek inilah yang
11
thermus aquaticus. merupakan urutan target yang memang 13 dikehendaki untuk digandakan (diamplifikasi). Tiap putaran reaksi PCR terdiri atas tiga
tahap, yaitu denaturasi template, penempelan Alat-alat yang digunakan dalam primer, dan polimerisasi primer, yang masing- pemeriksaan dengan menggunakan metode PCR masing berlangsung pada suhu lebih kurang antara lain, PCR tube 0,2 ml yang bebas nuclease 95ºC, 50ºC, dan 70ºC. Pada tahap denaturasi, digunakan sebagai tempat pembuatan PCR mix pasangan untai DNA templat dipisahkan satu dengan komposisi sebagai berikut:
sama lain sehingga menjadi untai tunggal. Pada
Serba Serbi Parasit
Komponen Volume tabung, jika perlu dapat disentrifus sebentar. PCR mix selanjutnya dimasukkan ke dalam thermal
2x Reaction Mix 10 l
cycler, kemudian alat dijalankan sesuai dengan Primer PU 1 (Forward) 2 l
program sebagai berikut: (i) Sintesis cDNA 1 0
Primer SU 1 (Forward) 2 l siklus : 60 C selama 45 menit; (ii) Predenaturasi 0
1 siklus : 94 C selama 1 menit; (iii) Amplifikasi Primer Lep R1 (Reverse) 2 l
0
30-35 siklus ; 94 C selama 1 menit (denaturasi),
DNA 4 l 0 0
60 C selama 30 detik (annealing), 68 C selama 1 PCR tube ini harus bebas dari nuclease menit (ekstensi); (iv) Ekstensi akhir 1 siklus :
0
dengan tujuan agar DNA hasil isolasi tidak rusak 68 C selama 5 menit. Untuk mengetahui hasil oleh enzim nuklease. Tujuan PCR mix disentrifus akhirnya, selanjutnya digunakan metode sebentar adalah untuk memastikan agar tidak ada elektroforesis.
sisa remukan sel, protein, maupun RNA.
Thermal cycler digunakan untuk tahap 3. Elektroforesis pemeriksaan PCR. Alat thermal cycler ini
Elektroforesis adalah teknik yang disesuaikan dengan program yang telah
digunakan untuk memisahkan DNA berdasarkan 12
dijelaskan pada langkah kerja.
ukuran (berat molekul) dan struktur fisik Bahan-bahan yang digunakan antara lain molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara Primer PU 1 (Forward) digunakan untuk lain agarosa. Dengan gel agarosa dapat mendeteksi Leptospira patogen dengan produk dilakukan pemisahan sampel DNA dengan PCR sebesar 615 bp. Primer SU 1 (Forward) ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang digunakan untuk mendeteksi Leptospira saprofit basa (pb). Molekul DNA bermuatan negatif dengan produk PCR sebesar 316 bp. Primer Lep sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi R1 digunakan sebagai reverse yang digunakan melalui matriks gel menuju kutub positif untuk membuat PCR mix. DNA hasil isolasi (anode). Makin besar ukuran molekulnya, berfungsi sebagai komposisi utama dalam makin rendah laju migrasinya. Berat molekul pembuatan PCR mix. Hasil PCR selanjutnya di suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan running dengan elektroforesis untuk mengetahui membandingkan laju migrasinya dengan laju jenis bakteri Leptospira yang berasal dari migrasi fragmen-fragmen molekul DNA
sampel darah manusia. strandar (marker) yang telah diketahui
ukurannya. Visualisasi DNA selanjutnya Langkah-langkah yang dilakukan dalam
dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet metode PCR diawali dengan pembuatan PCR
setelah terlebih dulu gel direndam di dalam mix dalam PCR tube 0,2 ml yang bebas nuclease,
14 larutan etidium bromid. dan dikerjakan di dalam es menggunakan dua
kali reaksi pencampuran dengan komposisi Metode elektroforesis adalah metode sebagai berikut: Primer PU 1 sebagai forward untuk mengidentifikasi suatu zat berdasarkan sebanyak 2 mikroliter, primer SU 1 (forward) pada sifa tkelistrikan zat tersebut, khususnya sebanyak 2 mikroliter, primer Lep R1 sebagai berdasar besarnya berat molekul (BM) dan reverse sebanyak 2 mikroliter, dan DNA 4 s t r u k t u r f i s i k ( u k u r a n ) z a t t e r s e b u t . mikroliter. Komponen-komponen tersebut Elektroforesis dalam dunia medis biasa dicampur perlahan-lahan, dan dipastikan semua digunakan dalam proses pencucian darah, komponen berada di bagian bawah atau dasar diagnosis penyakit, dan digunakan dalam bidang
Tabel 1. Primer untuk Pemeriksaan Bakteri Leptospira dengan Metode PCR
Jenis Primer Leptospira Sekuens Primer Ukuran Pita
Forward:
PU 1 Patogen 5’-TAT CAG AGC CTT TTA ATG G- 3’ PU 1 – Lep R1= 615
SU 1 Saprofit 5’-TTT AGG GTT AGC GTG GTA- 3’ SU 1 – Lep R1= 316
Reverse:
1. Ukuran molekul DNA farmasi untuk identifikasi DNA dalam
15
pembuatan antibiotik. Molekul DNA kecil akan melintasi gel lebih
cepat karena ruang gerak yang tersedia untuk Marker adalah segmen DNA yang
melintasi gel lebih banyak. spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker
berfungsi untuk mengetahui ukuran DNA hasil 2. Konsentrasi gel
amplifikasi. Marker DNA (fermentas) berfungsi Konsentrasi agarosa yang semakin tinggi sebagai penanda posisi molekul DNA yang menyebabkan molekul-molekul DNA sukar bermigrasi, untuk menentukan perkiraan ukuran melewati gel. Konsentrasi gel tinggi basa-basanya. Fragmen DNA yang letaknya mempermudah DNA berukuran kecil paling dekat dari sumuran adalah fragmen DNA melewati gel, sedangkan konsentrasi gel yang memiliki berat molekul terbesar. Fragmen rendah mempermudah molekul DNA DNA marker yang laju migrasinya paling cepat berukuran besar untuk melintasi gel.
atau paling jauh dari sumuran adalah fragmen
3. Bentuk molekul marker yang memiliki berat molekul atau ukuran
16 Molekul yang berbentuk supercoil atau elips
fragmen terkecil.
akan bergerak lebih cepat melewati gel. Alat-alat yang digunakan dalam tahap
4. Densitas muatan elektroforesis adalah microwave yang digunakan
untuk membuat gel agarosa. Baki gel agarosa Molekul dengan densitas tinggi akan lebih berfungsi untuk mencetak gel agarosa sebagai cepat bergerak dibandingkan molekul tempat DNA sampel akan ditempatkan dalam dengan densitas yang rendah. Densitas sumuran-sumuran, sedangkan sisir elektroforesis merupakan jumlah muatan per unit volume digunakan untuk membuat sumuran. Sisir molekul.
elektroforesis tersebut dipasang di salah satu 5. Voltase ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir
Voltase tinggi akan menyebabkan cepatnya menyentuh dasar baki. Selotip digunakan untuk
pergerakan molekul DNA. Hal tersebut melekatkan tiap ujung baki gel agarosa yang
dikarenakan oleh tingginya muatan positif bertujuan mencegah terjadinya lubang pada
yang ditimbulkan. masing-masing ujung baki. Tangki elektroforesis
berfungsi sebagai tempat running elektroforesis. 6. Larutan buffer
Mikropipet digunakan untuk memindahkan Buffer dengan kadar ion tinggi akan DNA ke dalam sumuran dengan volume 0,7 menaikkan konduktansi listrik sehingga mikroliter. UV transilluminator digunakan untuk migrasi DNA akan lebih cepat.
15 interpretasi hasil pemeriksaan PCR.
Tahapan-tahapan dalam melakukan Bahan dan larutan yang digunakan dalam elektroforesis adalah membuat gel agarosa 1% running elektroforesis memiliki fungsi masing- dibuat dengan cara menimbang agarosa 0,3 g masing. Gel agarosa merupakan matriks untuk dilarutkan ke dalam buffer TBE 1x hingga penyangga yang banyak dipakai untuk separasi volume 30 ml. Larutan agarosa dididihkan protein dan asam nukleat, digunakan sebagai hingga larut sempurna. Selanjutnya, baki gel pemadat, sebagai media elektroforesis. DNA agarosa disiapkan, selotip dilekatkan di tiap marka sebagai DNA penanda. Larutan buffer ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip TBE 1 X untuk penyangga. Akuades untuk melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-melarutkan agarosa. Pewarna Gold View bekerja masing ujung baki). Sisir elektroforesis dipasang menyisip di sela-sela basa-basa DNA, berfungsi di salah satu ujung baki gel agarosa dengan sebagai pewarna agar DNA dapat tervisualisasi posisi hampir menyentuh dasar baki. Suhu
7
0 pada UV Transilluminator. larutan agarosa ditunggu hingga sekitar 50-60 C,
Pergerakan DNA pada elektroforesis ditambahkan 1 µl etidium bromid. Sarung tangan dipengaruhi oleh beberapa faktor sebagai digunakan untuk melindungi dari EtBr yang
17
berikut: bersifat karsinogenik. Larutan agarosa
Geneva. 1982; 171. dituangkan ke dalam baki gel agarosa, dibiarkan
hingga larutan berubah menjadi gel yang padat. 3. E b r a h i m i A , N a s r Z , K o j o u r i G H A . Seroinvestigation of bovine leptospirosis in Sisir diambil dengan hati-hati, selotip dilepaskan
Shahrekord district, central Iran. Iranian. J. Vet. dari ujung-ujung baki. Baki yang telah berisi gel
Res. 2004; 5(2): 110-113. agarosa dimasukkan ke dalam tangki
4. Rad MA, Zeinali A, Yousofi JV, Tabata AH, elektroforesis yang telah diisi dengan larutan
Brokaie S. Seroprevalence and bacteriological buffer TBE 1x (dipastikan bahwa gel terendam
study of canine leptospirosis in Tchran and its seluruhnya dalam TBE). DNA hasil PCR
suburban areas. Iranian J. Vet. Res. 2004; 5(2): diambil 0,7 l menggunakan mikropipet dan
73-80. dimasukkan ke dalam sumuran. Kabel dari
5. Rocha T. A review of leptospirosis in farm s u m b e r a r u s d i h u b u n g k a n k e t a n g k i
animals in Portugal. Rev. Sci. Tech. Off. In. elektroforesis (dipastikan bahwa kabel yang
Epiz. 1998; 17 (3): 699-712. tersambung ke kutub negatif berada di dekat
6. Hartman EG, Ingh TSGAM, Rothuizen J. sumuran; jika tidak demikian, posisi baki/gel
Clinical, pathological and serological features of diubah ke arah sebaliknya). Sumber arus
spontaneous canine leptospirosis. An evaluation dinyalakan, voltase dan waktu running diatur of the IgM- and IgG- specific ELISA. Vet. hingga diperoleh angka 100 V dan 40 menit Immunol, and Immunopathol. 1986; 13:
261-271. dengan cara menekan tombol yang sesuai pada
sumber arus. Elektroforesis dijalankan (running) 7. Kositanont. Detection and differentiation dengan cara tombol run pada sumber arus between pathogenic and saprophytic Leptospira
spp. by multiplex polymerase chain reaction. ditekan. Elektroforesis dihentikan apabila
DNA-Diagnostic Microbiology and Infectious nya sudah mencapai garis ketiga. Sumber arus
Disease. 2007: 117-122. dimatikan dan baki diangkat dari tangki
8. Albert B. Biologi molekular sel Edisi ke-2. elektroforesis. Gel dikeluarkan dan diletakkan di
Jakarta:Gramedia; 1994. atas UV transluminator (selubung kaca hitam
diletakkan di atas UV transluminator). UV 9. Doyle JJ, Doyle JL. 1997. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf transluminator dinyalakan, pita-pita DNA yang
tissue. Phytochem. Bull. tervisualisasi diamati.
10. Arumingtyas EL. Isolasi DNA dan RAPD. Disampaikan pada Pelatihan Analisis DNA
KESIMPULAN Fingerprinting Tanaman dengan Metode RAPD
Tanggal 4-6 Juli 2011. Laboratorium Sentral Komponen-komponen yang dibutuhkan
Ilmu Hayati Universitas Brawijaya. Malang. dalam pemeriksaan bakteri Leptospira pada sampel
11. Jamilah. 2005. Pengaruh berbagai macam darah manusia menggunakan metode PCR adalah
detergen, penambahan enzim, dan ekstrak nanas DNA template, enzim polymerase, Primer PU 1 dan
(Ananas comusus (L) Merr) Terhadap hasil Primer SU 1 (forward), Primer Lep R1 (reverse), air,
isolasi DNA berbagai macam buah sebagai topik 2+
Mg , dan dNTP. Pemeriksaan bakteri Leptospira
p r a k t i k u m m a t a k u l i a h g e n e t i k a . pada sampel darah manusia meliputi beberapa Skripsi.Malang:Universitas Negeri Malang; teknik, yaitu pengambilan sampel, isolasi DNA, 2005.
pemeriksaan dengan metode PCR, dan running
12. Nicholl DST. An introduction to genetic elektroforesis. e n g i n e e r i n g T h i r d E d i t i o n . N e w
York:Cambridge University; 2008.
13. Sachse K, Nat R, Frey J. PCR detection of microbial pathogens. Humana Press; 2010. 14. Saiki RKS, Faloona F, Mullis F, Horn KB,Erlich
DAFTAR PUSTAKA GT, Arnheim N. Enzymatic amplification of
betaglobin genomic sequences and restriction 1. Hickey PW, Deemeks D. Leptospirosis.
site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Emedicine. 2003: 1-9.
Science. 1989; 230: 1350-54. 2. Faine S. Guidelines for the control of
15. Pratiwi R. Mengenal Metode Elektroforesis. leptospirosis. World Health Organization,
Jakarta:Puslitbang Oseanologi-LIPI; 2009. 16. Yepyhardi. 2009. Elektroforesis:pintu gerbang
penelitian biologi molekular. [diakses tanggal 2 J u n i 2 0 1 3 ] . A v a i l a b l e f r o m : http://sciencebiotech.net.
17. Martin R. Gel electrophoresis: nucleid acids. Oxford: Bios scientific Publisher; 1996.
