BAB III
BAHAN DAN METODE
3.1 Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni-Juli 2009 (perlakuan, sampling sampai dengan embedding), Februari 2010 (sectioning), dan Juni-Desember 2010 (pewarnaan dan analisis data) di Animal Laboratory Seafast Center IPB dan Laboratorium Histologi Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan IPB.
3.2 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian antara lain cawan petri, wadah penampung, kapas, kertas tissue, alummunium foil, alat bedah (gunting, pinset, alas bedah), gelas kimia, gelas ukur, erlenmeyer, exhause fan, pipet tetes, pipet mohr, tissue basket, blok kayu, pemanas bunsen, embedding tissue console, spatula, mikrotom putar (rotatory mikrotom), waterbath, ultrasonic cleaner, object glass, cover glass, kotak preparat, inkubator, mikropipet, tabung ependorf, mikroskop cahaya (Olympus CH-20), dan kamera (Nikon E600).
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian antara lain tikus putih jantan Albino Norways Rats (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley umur 5-6 minggu sebanyak 90 ekor dengan berat badan 140-240 gram, Bakteri Asam Laktat (BAL) indigenus isolat lokal yaitu Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus fermentum, kultur enteropathogenic E. coli (EPEC), ransum tikus percobaan (kasein, minyak jagung, mineral mix, vitamin mix, carboximethylcelulose, air, dan maizena), eter, NaCl fisiologis 0.9%, larutan Bouin (asam pikrat jenuh, formalin, dan asam asetat glasial dengan perbandingan 15:5:1), alkohol (70%, 80%, 90%, dan 100%), larutan clearing (xylol), parafin, akuades, pewarna Hematoksilin-Eosin (HE), entelan, neophren in toluene 0.2%, Phosphate Buffer Saline (PBS), metanol, H2O2, serum normal, antibodi primer/monoklonal Cu,Zn-SOD (SIGMA S2147), antibodi sekunder terkonjugasi Dako Envision Peroksidase System (K1491), larutan kromogen Diamino Benzidine (DAB), air bebas ion (MiliQ), dan label.
3.3 Metode penelitian
Secara keseluruhan, alur penelitian yang akan dilakukan digambarkan dalam skema pada Gambar 4.
Penelitian Pendahuluan:
---
Penelitian Utama
Isolasi BAL golongan Lactobacillus, Lactococcus, dan Streptococcus dari daging sapi bangsa peranakan Ongol yang dijual di berbagai pasar tradisional di daerah Bogor
Pengujian kemampuan bakterisidal dari 10 isolat BAL terhadap bakteri enteropathogenic E. coli (EPEC) secara in vitro
Didapatkan 10 jenis BAL isolat indigenus yang mempunyai kemampuan bertahan pada pH asam lambung yaitu pH 2 dan pH usus 7.2 serta pada kondisi garam empedu 0.5% sesuai dengan kondisi saluran pencernaan (Arief et al. 2008)
Didapatkan 2 spesies BAL yang mempunyai kemampuan terbaik dalam melawan EPEC, yaitu Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus fermentum
Penelitian Utama:
Gambar 4 Diagram alir alur penelitian yang akan dilakukan.
Pengujian BAL ( Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus farmentum ) pada kelompok tikus dengan perlakuan:
A: kontrol negatif : cekok ransum standar dan akuades (H1-H21) B: cekok Lactobacillus plantarum (H1-H21)
C: cekok Lactobacillus fermentum (H1-H21)
D: cekok Lactobacillus plantarum (H1-H21) dan EPEC (H8-H14) E: cekok Lactobacillus fermentum (H1-H21) dan EPEC (H8-H14) F: kontrol positif: cekok EPEC (H8-H14)
Terminasi Hari perlakuan H0 H22 Cekok EPEC: D,E,F T1 T2 T3
Analisa kandungan antioksidan intraselular (Cu,Zn-SOD) di jaringan
ginjal tikus percobaan
H8 H15
Persiapan hewan percobaan
Hewan percobaan
Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih jantan Albino Norway Rats (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley umur 5-6 minggu hasil pengembangbiakan dari Badan POM RI sebanyak 90 ekor dengan berat badan 140-240 gram.
Kandang dan perlengkapan
Kandang yang digunakan adalah kandang yang berukuran 17.5 x 23.75 x 17.5 cm, dengan jumlah sesuai dengan jumlah tikus yang digunakan. Kandang terbuat dari stainless steel. Kandang tikus berlokasi pada tempat yang bebas dari suara ribut dan terjaga dari asap industri serta polutan lainnya. Lantai kandang mudah dibersihkan dan disanitasi. Suhu optimum ruangan untuk tikus adalah 22-24 oC dan kelembaban udara 50-60% dengan ventilasi yang cukup (namun tidak ada jendela terbuka).
Ransum
Komposisi ransum basal disusun berdasarkan standar AOAC (2005) yaitu mengandung karbohidrat, protein, lemak, mineral, vitamin, dan air. Komposisi ransum untuk tikus percobaan adalah sebagai berikut :
Tabel 1 Komposisi campuran ransum basal tikus
Bahan-bahan Jumlah (%)
Protein kasein X=1.60 x 100%N sampel (10% port)
Minyak jagung [(8-X) x % ekstrak eter] / 100
Campuran mineral [(5-X) x % kadar abu] / 100
Campuran vitamin 1
CMC [(1-X) x % kadar serat kasar] / 100
Air [(5-X) x % kadar air] / 100
Perlakuan terhadap hewan percobaan
Awalnya dilakukan adaptasi tikus terhadap lingkungan selama lima hari dengan pemberian makanan berupa ransum basal pada semua tikus. Tikus dibagi dalam 6 kelompok perlakuan. Setiap kelompok perlakuan terdiri dari 5 ekor tikus. Kelompok tersebut terbagi atas kelompok perlakuan kontrol negatif (ransum normal), kontrol positif (cekok EPEC), perlakuan cekok BAL, dan perlakuan cekok BAL ditambah EPEC (Tabel 2).
Jumlah BAL yang diberikan disesuaikan dengan petunjuk Zoumoupopoulou et al. (2008). Dua kultur BAL terpilih yaitu Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus fermentum berumur satu hari pada media MRS broth sebanyak 1 ml dengan populasi 108 cfu diberikan sesuai dengan perlakuan pada tikus percobaan. Sedangkan populasi Enteropathogenic E.coli penyebab diare yang diberikan adalah 105 cfu/ml menurut Oyetayo (2004). BAL dan EPEC diberikan secara oral menggunakan sonde. Semua kelompok tikus perlakuan diberi pakan ransum dan akuades ad libitum.
Tabel 2 Kelompok tikus perlakuan
Kelompok Tikus Perlakuan
A Tikus kontrol negatif yaitu tikus tanpa perlakuan, hanya diberi ransum standar dan akuades mulai hari ke-1 sampai hari ke-21
B Tikus yang diberi Lactobacillus plantarum mulai hari ke-1 sampai hari ke-21
C Tikus yang diberi Lactobacillus fermentum mulai hari ke-1 sampai hari ke-21
D Tikus yang diberi Lactobacillus plantarum mulai hari ke-1 sampai hari ke-21 dan pemberian EPEC pada hari ke-8 sampai hari ke-14
E Tikus yang diberi Lactobacillus fermentum mulai hari ke-1 sampai hari ke-21 dan pemberian EPEC pada hari ke-8 sampai hari ke-14
F Tikus yang diberi EPEC selama 7 hari (hari ke-8 sampai hari ke-14)
Setelah perlakuan, dilakukan proses terminasi, ada tiga kali terminasi dengan selang waktu 7 hari. Hari ke-8 dilakukan terminasi terhadap keenam kelompok perlakuan dengan kode T1, hari ke-15 dilakukan terminasi terhadap keenam kelompok perlakuan dengan kode T2, hari ke-22 dilakukan terminasi terhadap keenam kelompok perlakuan dengan kode T3 (Gambar 5).
Gambar 5 Skema terminasi pada kelompok tikus perlakuan.
Pemrosesan Jaringan
Pengambilan Sampel (Sampling), Fiksasi, dan Pemotongan Organ
Pengambilan sampel ginjal dilakukan setelah tikus diberi perlakuan. Tikus dimatikan dengan cara cervicalis dislocatio lalu abdomen tikus dibedah dan organ ginjal diambil dengan sangat hati-hati untuk menghindari kerusakan jaringan. Sampel ginjal dicuci dengan menggunakan NaCl fisiologis 0.9% untuk menghilangkan darah kemudian direndam dengan larutan Bouin yang telah diberi label dan catatan waktu masuknya sampel ke dalam larutan. Larutan Bouin yang terdiri dari larutan asam pikrat jenuh, formalin (37% - 40%), dan asam asetat glasial disiapkan terlebih dahulu dengan perbandingan 15:5:1. Organ ginjal difiksasi dengan larutan Bouin selama 24 jam kemudian larutan Bouin diganti dengan alkohol 70% (stopping point). Organ ginjal yang telah difiksasi kemudian dipotong kecil berbentuk dadu dan dimasukkan ke dalam tissue basket serta diberi label.
Dehidrasi
Dehidrasi bertujuan untuk mengeluarkan air dari dalam jaringan dengan menggunakan seri alkohol bertingkat yaitu alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 90%, alkohol 95% (masing-masing 24 jam), alkohol absolut I, alkohol absolut II, dan alkohol absolut III (masing-masing 1 jam).
H0 H8 T1 T2 T3 H22 H15 Cekok EPEC: D,E,F Cekok BAL: B, C, D, E
Penjernihan (Clearing)
Penjernihan bertujuan menggantikan tempat etanol dalam jaringan. Reagen yang dipergunakan adalah xylol. Jaringan dipindahkan dari alkohol absolut III ke larutan penjernih (xylol). Penjernihan dilakukan dalam xylol I (1 jam), xylol II (1 jam), dan xylol III (30 menit pada suhu kamar dan 30 menit pada inkubator).
Infiltrasi Parafin
Infiltrasi parafin bertujuan untuk menggantikan kedudukan dehidran dalam jaringan dan bahan penjernih dengan parafin cair. Jaringan dimasukkan dalam parafin cair I, parafin cair II, dan parafin cair III (masing-masing 1 jam di dalam oven).
Penanaman Jaringan (Embedding)
Bahan dan alat yang digunakan dalam proses ini adalah inkubator, embedding tissue console, pinset, parafin cair, gliserin, blok kayu, pinset, pemanas bunsen, tutup pagoda, spatula, dan kertas film (untuk label).
Tahap pertama tutup pagoda diolesi gliserin dan tetap dalam kondisi hangat (pengerjaan dilakukan diatas hot plate bersuhu 67 0C), kemudian parafin cair pada embedding tissue console dituangkan ke dalam tutup pagoda perlahan-lahan sampai permukaannya cembung. Jaringan secara hati-hati diletakkan ke dalam parafin dengan menggunakan pinset. Kemudian letaknya diatur sesuai dengan posisinya terhadap jaringan yang lain untuk mempermudah proses pemotongan. Pada setiap sampel diberikan label dengan nama sampelnya ditulis menggunakan pensil di atas kertas film.
Setelah jaringan ditanam, tutup pagoda dipindahkan dari keadaan hangat ke bagian dingin (cold plate) untuk beberapa saat agar membeku lalu dipindahkan ke dalam air sampai parafin membeku sempurna. Jika parafin telah membeku sempurna, parafin dikeluarkan dari pagoda dengan cara mengungkit salah satu sisi pagoda dengan pisau. Potongan parafin yang membungkus jaringan ditrimming sampai membentuk kotak lalu ditempelkan pada balok kayu yang telah disediakan.
Pembuatan Blok Parafin
Pisau dipanaskan diatas pemanas bunsen dan parafin di sekitar sampel dirapikan dengan cara dipotong. Kayu tempat penempelan sampel diletakkan pada alas agar statis. Potongan- potongan parafin diletakkan diatas pisau kemudian pisau dipanaskan sampai parafin cair. Parafin cair pada pisau diteteskan ke balok kayu. Sampel yang ada diletakkan diatas pisau panas dan secara perlahan diletakkan di balok kayu yang telah dialasi parafin cair. Blok parafin disimpan dalam lemari es sebelum dipotong menggunakan mikrotom.
Penyayatan (Sectioning) dan Penempelan ke Gelas Objek
Blok parafin dipasang pada mikrotom dan diatur agar posisinya sejajar dengan posisi pisau. Blok parafin dipotong dengan ketebalan 4 µm. Pada awal pemotongan dilakukan trimming karena jaringan yang terpotong masih belum sempurna. Setelah didapatkan hasil sayatan yang terbaik, hasilnya diambil dengan kertas yang basah pada bagian ujung lalu diapungkan diatas air dingin. Jika hasil potongan membentuk pita maka jaringan dipisahkan dengan jarum satu persatu. Potongan jaringan yang telah terpisah ditempatkan pada air hangat dengan suhu 37 0C untuk menghilangkan kerutan lalu ditempatkan pada gelas objek. Sediaan pada gelas objek lalu dilihat di bawah mikroskop untuk melihat ada tidaknya luka pisau dan ketebalan potongan, jika belum maka dicari potongan lain. Gelas objek dengan sediaan jaringan terpilih diberi label sesuai dengan perlakuan dan dikeringkan. Sediaan disimpan pada inkubator dengan suhu 37 0C selama semalam lalu siap diwarnai dengan pewarnaan HE. Untuk pewarnaan immunohistokimia, gelas objek dilem dahulu dengan neofren. Sebelum pengeleman, gelas objek dibersihkan terlebih dahulu dengan ultrasonic cleaner menggunakan larutan pembersih (20 menit) kemudian secara berurutan larutan pada ultrasonic cleaner diganti dengan akuades sebanyak 3 kali (masing-masing selama 20 menit). Gelas objek yang telah bersih disimpan dalam inkubator dengan suhu 37 oC selama semalam lalu dilem dengan neofren.
Pewarnaan
Pewarnaan Immunohistokimia Superoxide Dismutase (Cu,Zn-SOD)
Pewarnaan khusus imunohistokimia terhadap Cu,Zn-SOD dilakukan untuk mengamati perubahan kandungan enzim antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal. Langkah awal dilakukan deparafinisasi dengan xylol III-I, waktu untuk xylol III dan II selama 3 menit sedangkan untuk xylol I selama 5 menit. Kemudian dilakukan rehidrasi dengan alkohol absolut III-alkohol 80% masing-masing selama 3 menit dan terakhir dengan alkohol 70% selama 5 menit. Selanjutnya dimasukkan dalam akuades selama 15 menit. Setelah itu diinkubasi dalam substrat methanol yang ditambahkan H2O2 selama 15 menit untuk menghilangkan aktivitas peroksidase endogen, selanjutnya dicuci berturut-turut dengan akuades dan Phosphate Buffer Saline (PBS) masing-masing 2x10 menit. Setelah itu jaringan diinkubasi dalam serum normal-Bovine Serum Albumin (BSA) sebanyak 60 µL selama 30-60 menit pada suhu 37 oC untuk menutupi antigen non spesifik dan berikutnya jaringan dicuci dengan PBS selama 3x10 menit. Kemudian jaringan diinkubasi dalam antibodi monoklonal Cu,Zn-SOD (1:200) pada suhu 4 o
C selama 2 malam. Selanjutnya dicuci dengan PBS selama 3x5 menit dan diinkubasi dalam antibodi sekunder Dako Envision Peroxidase (Dako K 1491) selama 60 menit dalam ruang gelap. Hasil reaksi antigen dengan antibodi divisualisasikan dengan menggunakan DAB (Diamino Benzidine) dalam tris buffer yang ditambahkan H2O2 selama 25 menit (ditutup gelap), selanjutnya dicounterstain dengan hemaktosilin. Setelah itu dilakukan dehidrasi dan clearing, jaringan kemudian dimounting dengan entelan dan siap untuk diamati. Preparat yang telah siap untuk diamati menunjukkan reaksi positif apabila berwarna coklat. Warna coklat menunjukkan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD.
3.4 Parameter dan Analisis Data Parameter
Pada pewarnaan imunohistokimia dilakukan pengamatan terhadap kandungan Cu,Zn-SOD pada jaringan ginjal masing-masing kelompok perlakuan. Pengamatan dilakukan secara kuantitatif, kualitatif, dan penghitungan persentase dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 20x. Pengamatan
Cu,Zn-SOD secara kualitatif dilakukan pada seluruh bagian ginjal yaitu pada inti dan sitoplasma tubuli renalis, glomerulus, dan daerah medulla. Pengamatan kuantitatif kandungan Cu,Zn-SOD dilakukan dengan cara menghitung jumlah inti sel tubuli renalis yang memberikan reaksi positif dan negatif terhadap kandungan dari Cu,Zn-SOD per lapang pandang dengan perbesaran 20x. Semakin banyak tanda positif (+), semakin tinggi kandungan Cu,Zn-SOD. Kandungan Cu,Zn-SOD dibedakan menjadi tiga tingkat kandungan, yaitu (i) positif kuat (+++), terlihat warna coklat tua, (ii) positif sedang/lemah (++/+), terlihat warna coklat muda sampai dengan coklat kebiru-biruan, (iii) hasil reaksi negatif (-), terlihat warna biru. Profil kandungan Cu,Zn-SOD juga dilihat dari penghitungan persentase jumlah inti sel tubuli renalis yang memberikan reaksi positif dan negatif terhadap kandungan Cu,Zn-SOD.
Analisis Data
Hasil pengamatan terhadap kandungan Cu,Zn-SOD (jumlah inti sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD) dianalisis menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjutan Duncan.
