PENGARUH LEVEL GLUTATHIONE DALAM PENGENCER TRIS-KUNING TELUR TERHADAP MEMBRAN PLASMA UTUH DAN RECOVERY RATE
SPERMA KAMBING PERANAKAN ETAWAH POST THAWING
EFFECT OF GLUTATHIONE LEVEL IN TRIS-EGG YOLK ON INTACT PLASMA MEMBRANE AND RECOVERY RATE OF POST THAWED
ETAWAH CROSSBRED SPERM
Riga Pradistya Hardian*, Nurcholidah Solihati**, Rangga Setiawan**
Universitas Padjadjaran
*Alumni Fakultas Peternakan Unpad Tahun 2016
**Staf Pengajar Fakultas Peternakan Unpad e-mail : [email protected]
ABSTRAK
Penelitian mengenai pengaruh level glutathione dalam pengencer tris-kuning telur terhadap membran plasma utuh dan recovery rate sperma kambing PE post thawing telah dilaksanakan di Laboratorium Reproduksi Ternak dan Inseminasi Buatan, Fakultas Peternakan, Universitas Padjadjaran, Jatinangor, Sumedang. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh penambahan glutathione dalam pengencer tris-kuning telur dan mengetahui level penggunaan glutathione yang paling baik terhadap membran plasma utuh dan recovery rate sperma kambing PE post thawing. Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan lima perlakuan yang terdiri dari 5 kelompok yaitu tanpa penambahan glutathione (P0), glutathione 4 mM (P1), glutathione 6 mM (P2), glutathione 8 mM (P3) dan glutathione 10 mM (P4). Setiap perlakuan diulang sebanyak 1 kali. Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa penggunaan level glutathione pada sperma kambing PE post thawing berpengaruh nyata (P < 0,05) terhadap peningkatan persentase membran plasma utuh dan recovery rate (P0 = 54,60 %; 40,55 %), (P1 = 58,20 %; 49,02 %), (P2 = 61,50 %;
54,36 %), (P3 = 65,20 %; 57,87 %), (P4 = 57,50 %; 44,33 %). Dapat disimpulkan bahwa penambahan glutathione berpengaruh terhadap membran plasma utuh dan recovery rate sperma kambing PE post thawing.
Kata Kunci: Glutathione, kambing PE, membran plasma utuh, recovery rate.
ABSTRACT
Research on the effect of glutathione levels in tris-yolk diluent to the plasma membrane intact and goat sperm recovery rate post thawing had been carried out in the Laboratory of Animal Reproduction and Artificial Insemination, Faculty of Animal Husbandry, Padjadjaran University, Jatinangor, Sumedang. Research aims to review the influence of additional glutathione in diluents tris-egg yolk and know the level glutathione use the best plasma against membrane intact and recovery rate sperm goat PE post thawing. This study used a rand omized block design (RAK) with five treatments consisted of five groups ie without the addition of glutathione (P0), 4 mM glutathione (P1), 6 mM glutathione (P2), 8 mM glutathione (P3) and 10 mM glutathione (P4). Each treatment was repeated one times.
Statistical analysis showed that the use of glutathione levels in post-thawing sperm goats give significant effect (P < 0,05) on the percentage of intact plasma membrane and recovery rate (P0 = 54,60 %; 40,55 %), (P1 = 58,20 %; 49,02 %), (P2 = 61,50 %; 54,36 %), (P3 = 65,20 %;
57,87 %), (P4 = 57,50 %; 44,33 %). It can be concluded that the addition of glutathione gave effect on the intact membran plasma and recovery rate of frozen-thawed PE goat sperm.
Keywords : Glutathione, PE goat, intact plasma membrane, recovery rate.
PENDAHULUAN
Salah satu upaya yang ditempuh untuk mempertahankan dan meningkatkan mutu genetik kambing lokal di Indonesia adalah melakukan persilangan dengan kambing bergenetik unggul melalui teknologi Inseminasi Buatan. Kualitas semen beku merupakan salah satu faktor pembatas terhadap keberhasilan program Inseminasi Buatan pada kambing.
Pada saat proses pembekuan aktivitas metabolisme spermatozoa meningkat sehingga dapat menyebabkan penurunan kualitas semen secara keseluruhan. Hasil dari metabolisme tersebut menghasilkan asam lemak jenuh yang sangat rentan terkena Reactive Oxygen Soecies (ROS).
Proses ini dapat memicu terjadinya peroksidasi lipid yang akan merusak membran plasma utuh. Rusaknya membran plasma utuh akan menyebabkan terjadinya penurunan motilitas.
Turunnya motilitas akan berdampak pada nilai persentase Recovery Rate (RR). Hal tersebut dapat dicegah dengan menambahkan antioksidan untuk mencegah terjadinya peroksidasi lipid akibat dari rantai radikal bebas.
Glutathione merupakan antioksidan yang berfungsi untuk menangkal radikal bebas sehingga dapat mencegah kerusakan sel akibat peroksidasi lipid. Penambahan glutathione perlu diperhatikan karena peningkatan konsentrasi terlalu banyak atau berlebih dapat menimbulkan efek toksik bagi sperma. Penggunaan level glutathione yang tepat diharapkan dapat mengurangi dan mencegah timbulnya radikal bebas yang dapat merusak membran plasma.
Penelitian mengenai penambahan glutathione ke dalam bahan pengencer yang membahas secara khusus terhadap membran plasma utuh dan recovery rate pada semen kambing Peranakan Etawah masih terbatas. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk mengetahui Pengaruh Level Glutathione dalam Pengencer Tris Kuning-Telur terhadap Membran Plasma Utuh dan Recovery Rate (RR) Sperma Kambing Peranakan Etawah Post Thawing.
BAHAN DAN METODE
Objek penelitian yang digunakan adalah semen yang berasal dari kambing PE dengan umur 2 tahun sebanyak 5 ekor kambing. Volume semen yang digunakan didapat dari 1 kali ejakulasi jika volume tidak mencukupi maka dilakukan hingga 3 kali ejakulasi dengan selang waktu penampungan 5 hingga 10 menit. Alat dan bahan yang digunakan yaitu vagina buatan, tabung penampung semen, pompa udara, object glass, cover glass, batang pengaduk, pipet haemocytometer, kamar hitung neubauer, mikroskop, counter, straw, styrofoam, rak besi, corong plastik, goblet, canister, container, pinset, NaCl fisiologis, NaCl 3%, pewarna eosin, host test, larutan tris, dan lainya. Semen segar yang telah ditampung segera dilakukan pengamatan makroskopik meliputi volume, bau, pH, warna, dan konsistensi dan pengamatan mikroskopik meliputi gerakan massa, konsentrasi sperma total, motilitas, membran plasma utuh dan abnormalitas. Semen yang telah dievaluasi kemudian diencerkan dalam pengencer tris-kuning telur dengan komposisi 3,634 gram tris aminomethane, 0,5 gram kristal fruktosa, asam sitrat sebanyak 1,99 gram, aquabidestilata sebanyak 100 ml, kuning telur 20%, 100.000 IU penicillin, 1 mg streptomycin, dan gliserol 6%.
Semen cair dibagi menjadi lima bagian untuk masing-masing perlakuan. Pada pengencer pertama tidak diberi tambahan antioksidan sebagai kontrol, pengencer kedua, ketiga, keempat dan kelima masing-masing diberi tambahan glutation sebanyak 4 mM, 6 mM, 8 mM dan 10 mM. Semen cair yang sudah diencerkan dan ditambahkan antioksidan kemudian dikemas dengan straw IMV 0,25 ml yang selanjutnya straw berisi semen disimpan dalam lemari es dengan temperatur 50C selama 4 jam untuk proses ekuilibrasi.
Straw selanjutnya dilakukan proses pre-freezing dengan diuapkan di atas permukaan nitrogen cair selama 7 menit dengan suhu -80 sampai dengan -100 0C. Setelah proses pre- freezing straw dimasukan ke dalam cairan nitrogen dengan suhu mencapai -196°C selama 30 menit. Straw beku kemudian dicairkan kembali (thawing) dalam bejana berisi air hangat dengan suhu 37°C selama 30 detik.
Semen hasil thawing kemudian dievaluasi dibawah mikroskop dengan parameter membran plasma utuh dan recovery rate sperma. Perlakuan diulang sebanyak 1 kali. Data yang diperoleh dianalisis dengan metode Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan uji lanjut jarak berganda Duncan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Semen Segar Hasil Penelitian
Karakteristik semen segar dilakukan sebagai standar kelayakan semen untuk diproses lebih lanjut. Sifat karakteristik kualitatif dan kuantitatif semen segar kambing PE yang dijadikan bahan penelitian diperoleh dari hasil evaluasi makroskopik meliputi volume, pH, warna, bau, dan viskositas serta evaluasi mikroskopik meliputi gerakan massa, konsentrasi sperma, motilitas, abnormalitas, MPU dan TAU yang disajikan pada Tabel 3 berikut ini :
Tabel 3. Karakteristik Semen Segar Kambing PE Penelitian
Karakteristik Semen Kambing (Kelompok)
1 2 3 4 5
Volume (ml) 0,7 0,5 1,1 0,6 0,5
pH 6,7 6,7 6,5 6,5 6,5
Warna Krem Krem Krem Krem Krem
Bau Khas Khas Khas Khas Khas
Viskositas Kental Kental Kental Kental Kental
Gerakan Massa +++ +++ +++ +++ +++
Konsentrasi Sperma
(juta sel/ml) 2560 3260 4080 2260 4120
Motilitas (%) 75,7 85,2 79,9 81,4 77,2
MPU (%) 84,5 87 89 88 81
Abnormalitas (%) 1 1,5 2 1,5 1,5
TAU (%) 82,5 82 84,5 88,5 85,5
Pengaruh Glutathione terhadap Membran Plasma Utuh Sperma Kambing Peranakan Etawah Post Thawing
Evaluasi MPU dilakukan dengan metode Hypoosmotic Sweeling (HOS test). Data hasil penelitian berdasarkan pengamatan secara mikroskopis, didapatkan nilai MPU sperma kambing PE setelah pembekuan hasil dari masing-masing perlakuan mengenai pengaruh penambahan glutathione disajikan pada Tabel 4 berikut ini :
Tabel 4. Persentase Membran Plasma Utuh Sperma Kambing PE Post Thawing
Kelompok Perlakuan Level Glutathione (mM) Total
Kelompok
P0(0) P1(4) P2(6) P3(8) P4(10)
...%...
K1 53,00 57,00 60,50 64,50 54,50 289,50
K2 58,50 61,00 63,50 66,00 62,00 311,00
K3 56,00 59,50 63,00 65,50 58,00 302,00
K4 55,00 57,50 61,00 66,50 60,00 300,00
K5 50,50 56,00 59,50 63,50 53,00 282,50
Jumlah 273,00 291,00 307,50 326,00 287,50 1485,00
Rata-rata 54,60±2,71 58,20±1,81 61,50±1,52 65,20±1,08 57,50±3,35 297,00
Berdasarkan hasil analisis ragam menunjukkan bahwa level glutathione dalam pengencer tris-kuning telur memberi pengaruh yang berbeda nyata (P < 0,05) terhadap membran plasma utuh sperma kambing Peranakan Etawah (PE) post thawing.
Masalah yang sering terjadi pada saat proses pengenceran dan pembekuan semen adalah rusaknya membran plasma utuh spermatozoa akibat terbentuknya peroksidasi lipid.
Peroksidasi lipid pada sperma dapat terjadi selama proses pembekuan hingga pencairan kembali atau thawing (Sukmawati dkk, 2014). Keadaan ini terjadi karena membran plasma spermatozoa banyak mengandung asam lemak tak jenuh yang sangat rentan terhadap kerusakan peroksidasi (Maxwell dan Watson, 1996). Ciri kerusakan sel spermatozoa akibat peroksidasi lipid adalah rendahnya motilitas spermatozoa, kerusakan enzim intraseluler, dan kerusakan membran plasma terutama bagian akrosom (White, 1993 dalam Siti, 2012).
Salah satu cara untuk mencegah rusaknya membran plasma sel yaitu dengan menambahkan antioksidan ke dalam bahan pengencer, salah satunya dengan penambahan glutathione. Menurut Kidd (1997) glutathione adalah antioksidan sulfhydril (-SH), antitoksin dan kofaktor enzim yang mempunyai sifat menetralkan radikal bebas. Glutathione yang didistribusikan ke dalam sel, mempunyai peran penting dalam mekanisme pertahanan interselluler terhadap stres oksidatif yang disebabkan oleh produksi ROS secara berlebihan selama proses pembekuan dan thawing spermatozoa (Ansari dkk, 2010).
Pengaruh Glutathione terhadap Recovery Rate Sperma Kambing Peranakan Etawah Post Thawing
Recovery Rate dilakukan untuk mengetahui pengaruh jenis pengencer terhadap laju perunuran nilai motilitas. Hasil penelitian menunjukkan Recovery Rate semen kambing PE post thawing pada berbagai level penggunaan glutathione dalam pengencer tris-kuning telur dapat dilihat pada Tabel 6 berikut ini :
Tabel 6. Recovery Rate Sperma Kambing PE Post Thawing
Kelompok Perlakuan Level Glutathione (mM) Total
Kelompok
P0(0) P1(4) P2(6) P3(8) P4(10)
...%...
K1 40,00 53,33 60,61 59,26 40,00 253,20
K2 36,11 44,01 52,16 55,60 42,68 230,57
K3 41,72 46,11 50,06 56,89 45,89 240,67
K4 41,72 46,11 50,06 56,89 46,80 241,58
K5 43,18 55,51 58,88 60,72 46,26 264,55
Jumlah 202,73 245,08 271,78 289,35 221,63 1230,57
Rata-rata 40,55±2,43 49,02±4,53 54,36±4,50 57,87±1,85 44,33±2,60 246,11
Recovery rate (RR) adalah kemampuan pemulihan spermatozoa setelah mengalami pembekuan dengan membandingkan persentase sperma post thawing dengan semen segar (Garner dan Hafez, 2000). Hasil analisis ragam menunjukkan bahwa level glutathione dalam pengencer tris-kuning telur memberi pengaruh yang berbeda nyata (P < 0,05) terhadap recovery rate semen kambing Pernakan Etawah (PE) post thawing.
Tinggi rendahnya nilai recovery rate dapat dipengaruhi dari laju penurunan suhu dan jenis pengencer yang digunakan (Herdiawan, 2004). Pada saat ekulibrasi spermatozoa akan beradaptasi dengan pengencernya, sehingga dapat menurunkan persentase motilitas spermatozoa pada saat pembekuan (Mole dkk, 2003 dalam Zelpina dkk, 2012). Selama proses pembekuan hingga thawing sperma dapat mengalami kerusakan akibat peroksidasi lipid (Sukmawati dkk, 2014). Salah satu ciri kerusakan sel spermatozoa akibat peroksidasi lipid adalah rendahnya motilitas spermatozoa (Siti, 2012). Hilangnya daya motilitas sperma selama proses pembekuan akan berpengaruh terhadap laju pemulihan (recovery rate) sperma setelah mengalami pencairan kembali (Hafez dan Hafez, 2000).
Menurut Indria dkk. (2012) pemberian glutathione dapat menstabilkan struktur membran dengan cara meminimalkan pembentukan hasil peroksida dalam reaksi peroksidasi lipid sehingga kerusakan membran dapat dicegah dan nilai motilitas dapat dipertahankan.
Perlindungan sperma yang tidak optimal dapat disebabkan oleh penggunaan level glutathione yang belum optimal. Menurut Syariffudin dkk. (2012) Penambahan glutathione yang kurang sesuai mengakibatkan peningkatan ROS selama kultur in vitro yang dapat menyebabkan kerusakan sel spermatozoa.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian dapat ditarik kesimpulan bahwa :
1. Level glutathione dalam pengencer tris-kuning telur berpengaruh terhadap membran plasma utuh dan recovery rate sperma kambing Peranakan Etawah (PE) post thawing.
2. Level glutathione 8 mM menghasilkan membran plasma utuh sperma kambing Peranakan Etawah (PE) post thawing paling baik.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian penugasan ALG Laboratorium Reproduksi Ternak dan Inseminasi Buatan yang telah memberikan dukungan materi penelitian. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada Dr.
Nurcholidah Solihati, S.Pt., M.Si., sebagai Pembimbing Utama, Rangga Setiawan S.Pt., M.Sc., sebagai Pembimbing Anggota, tim Laboratorium Reproduksi Ternak dan Inseminasi Buatan, kedua orang tua penulis dan rekan-rekan yang tidak dapat disebutkan satu persatu.
DAFTAR PUSTAKA
Ansari, M. S., B. A. Rahka, N. Ullah, S. M. H. Andrabi dan S. Iqbal. 2010. Effect of exogenous glutathione in extender on the freezability of Nila-Ravi buffalo (Bubalus bubalis) bull spermatozoa. Animal Science Papers and Reports 28 (3): 235-244.
Garner, D. L. E., S. E. Hafez. 2000. Sperm and Seminal Plasma. In: B Hafez & ESE Hafez.
Reproduction in farm animal. 7th ed. Lippincott Williams & Wilkins. USA. Hal. 96- 109.
Hafez, E. S. E. and B. Hafez. 2000. Preservation and Cryopreservation of Gametes and Embryos. In : Reproduction in Farm Animals. 7th edition. Lippincot Williams and Wilkins, Baltimore. 431-442.
Herdiawan I. 2004. Pengaruh Laju Penurunan Suhu dan Jenis Pengencer terhadap Kualitas Semen Beku Domba Priangan. JITV Vol. 9 No 2 Th.2004.
Indria N. F., A. Rachmawati dan Suyadi. 2012. Pengaruh Glutathione dalam Pengencer Tris Aminomethane Kuning Telur-Gliserol terhadap Kualitas Semen Kambing Boer Setelah Pembekuan Cepat. Universitas Brawijaya. Malang.
Kidd, P. M. 1997. Glutathione: Systemic Protectant Against Oxidative and Free Radical Damage. Alternative Medicine Review. Vol. 2. No.3: 155-176.
Maxwell, W. M. C and P. F. Watson. 1996. Recent Progres in Preservation of Ram Semen.
Animal Reproluction Science. 42. Elsevier.
Siti, A. 2012. Karakteristik Spermatozoa Domba Selama Proses Pembekuan dengan Medium Pengencer yang Ditambahkan Glutathione. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Hal 8.
Sukmawati, E., R. I. Arifiantini dan B. Purwantara. 2014. Daya Tahan Spermatozoa terhadap Proses Pembekuan pada Berbagai Jenis Sapi Pejantan Unggul. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Syariffudin, A., N. D. I. L. Desak dan B. Wayan. 2012. Efektivitas Penambahan Berbagai Konsentrasi Glutathione terhadap Daya Hidup dan Motilitas Spermatozoa Sapi Bali Post Thawing. Indonesia Medicus Veterinus. ISSN : 2301-7848: 173-185.
Zelpina, E, B. Rosadi dan T. Sumarsono. 2012. Kualitas Sperma Post Thawing dari Semen Beku Sapi Perah. Jurnal Ilmu-Ilmu Peternakan Vol. XV No.2 : 94-102.
