ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila Isolat AIR DARI BEBERAPA KOTA BERDASARKAN SIKUEN GEN (gyr B).

(1)

Fitri Rohmasari, 2015

ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR

KOLAM DARI BEBERAPA KOTA BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Sebagian dari Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Sains

Program Studi Biologi

Departemen Pendidikan Biologi

Oleh:

Fitri Rohmasari

1006348

PROGRAM STUDI BIOLOGI

DEPARTEMEN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU

PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA

(2)

ANALISIS FILOGENETIKA BAKTERI

Aeromonas

hydrophila

ISOLAT

AIR KOLAM DARI BEBERAPA

KOTA BERDASARKAN SIKUEN GEN

gyr B

Oleh

Fitri Rohmasari

Sebuah skripsi yang diajukan untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar

Sarjana pada Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Pendidikan Indonesia

Januari 2015

Hak Cipta dilindungi undang-undang.

Skripsi ini tidak boleh diperbanyak seluruhya atau sebagian,

(3)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu LEMBAR PENGESAHAN

ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR

DARI BEBERAPA KOTA BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B

Oleh

Fitri Rohmasari

1006348

DISETUJUI DAN DISAHKAN OLEH:

Pembimbing I

Dr. Topik Hidayat, M.Si

NIP. 197004101997021001

Pembimbing II

Diah Kusumawaty, M.Si

NIP.19708112001122001

Mengetahui,

Ketua Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI

Dr. Riandi, M.Si

(4)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul “Analisis Filogenetik Bakteri Aeromonas hydrophila Isolat Air Kolam dari Beberapa Kota Berdasarkan

Sikuen Gen gyr B” ini beserta seluruh isinya adalah benar-benar karya sendiri, dan saya tidak melakukan penjiplakan atau pengutipan dengan cara-cara yang tidak sesuai

dengan etika keilmuan yang berlaku dalam masyarakat keilmuan. Atas pernyataan ini,

saya siap menanggung sanksi yang dijatuhkan kepada saya apabila kemudian ditemukan

adanya pelanggaran terhadap etika keilmuan dalam karya saya ini atau klaim dari pihak

lain terhadap keaslian karya saya ini.

Bandung, November 2014

Yang membuat pernyataan,

Fitri Rohmasari

(5)

ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila Isolat AIR

DARI BEBERAPA KOTA BERDASARKAN SIKUEN GEN (gyr B)

ABSTRAK

Air merupakan pelarut universal, sehingga tidak semua air dapat dikatakan murni Air dapat menjadi perantara bakteri patogen untuk menginfeksi penyakit. Salah satunya adalah bakteri Aeromonas spp. Bakteri Aeromonas hydrophila umum ditemukan di perairan. Aeromonas memiliki taksonomi yang kompleks dengan karakter yang berbeda-beda, bahkan di level intraspesies. Tujuan penelitian ini yaitu untuk mengetahui karakteristik Aeromonas hydrophila isolat air beberapa kota secara biokimia dan molekular dan mengetahui hubungan kekerabatan Aeromonas hydrophila yang didapat dari beberapa kota berdasarkan sikuen gen gyr B.. Pada penelitian ini dilakukan pengujian morfologi dan biokimia untuk menskrining sampel bakteri yang diisolasi dari beberapa kota. Selain itu, dilakukan pengujian molekuler yaitu pendeteksian gen lip sebagai gen spesifik Aeromonas hydrophila dan pengujian secara literarur dengan perbandingan hasil penelitian sebelumnya. Hasil skrining dengan pengujian morfologi, biokimia, dan molekuler, dari 9 isolat bakteri yang diuji, hanya 6 isolat bakteri yang dapat disekuensing dengan baik menggunakan gen gyr B, dan isolat tersebut kemungkinan besar merupakan Aeromonas, keenam isolat tersebut merupakan bakteri gram negatif dengan bentuk basil, positif terhadap uji oksidase, merupakan bakteri fakultatif anaerob, bersifat motil dan

memiliki kemampuan β hemolisis. Hasil dari pendeteksian gen lip pada seluruh isolat Aeromonas, 50% isolat menunjukkan amplikon pada ukuran 760 pb. Sedangkan hasil dari analisis bioinformatika menggunakan sikuen gen gyr B menunjukan lima isolat bakteri tersebut berkerabat dekat satu dengan yang lainnya.

(6)

ANALYSIS PHYLOGENETIC OF Aeromonas hydrophila WATER POND

ISOLATES FROM SOME CITIES BASED ON gyr B GENE SEQUENCE

ABSTRACT

Water can be an intermediary factor for pathogenic bacteria to infect the disease, one of which is Aeromonas. This bacterium is pathogenic to either humans or animals especially fish. Phylogenetic relationship between Aeromonas

spp. need to describe to know the diversity and distribution of strains in water, so

it can be used to test water quality accurately and quickly. This study aimed to determine the characteristics, and phylogenetic relationships of Aeromonasspp. Morphology test (Gram staining); biochemical tests include RS+Novobiocin, motility, oxidation, OF, indole, VP, citrate, lactose fermentation, hemolysis detection; and detection of lipase gene were determined from 9 isolates. Then 5 selected isolates and 1 control isolates were sequenced based on gyr B gene. Phylogenetic trees obtained using Clustal X and MEGA 5. The results of the screening test morphological, biochemical, and molecular, from isolates tested, are likely to be Aeromonas is a gram-negative bacteria in the form of bacillus , positive for oxidase test, a facultative anaerobic bacteria, are motile and have the

ability to β hemolysis. Results of detection of gene lip on all isolates of

Aeromonas, 50% of isolates showed 760 bp amplicon in size. While the results of

bioinformatics analysis using gene sequence Gyr B shows the five isolates closely related to one another.

(7)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu DAFTAR ISI

C. Pertanyaan Penelitian ... 4

D. Batasan Masalah... 5

E. Tujuan Penelitian ... 5

F. Manfaat Penelitian ... 5

BAB II KARAKTERISTIK BAKTERI Aeromonas hydrophila DAN STUDI ANALISIS FILOGENETIKA MENGGUNAKAN SIKUEN GEN Gyr B ... 6

A. Deskripsi Bakteri A. hydrophila ... 6

B. Aeromonas spp. dan Air ... 7

C. Patogenitas Aeromonas hydrophila ... 8

D. Karakterisasi dan Identifikasi Morfologi dan Biokimia Bakteri Aeromonas hydrophila ... 9

J. Tahapan Dalam Analisis Filogenetika Molekuler... 24

BAB III METODE PENELITIAN ... 27

(8)

B. Populasi dan Sampel ... 27

C. Waktu dan Tempat Penelitian ... 27

D. Alat dan Bahan ... 27

E. Prosedur Penelitian ... 27

1. Persiapan Penelitian dan Pra Penelitian ... 27

2. Subkultur A. hydrophila Pada Medium RS ... 28

3. Pemurnian Koloni Bakteri Biokimia ... 28

4. Uji Morfologi dan Biokimia Bakteri ... 28

5. Pembuatan Cryo Bakteri ... 31

6. Identifikasi Aeromonas hydrophila Secara Molekular ... 32

F. Pra Sikuensing ... 33

1. Identifikasi Gen gyrB dengan Metode PCR ... 33

2. Mengukur Kemurnian dan Konsentrasi DNA Hasil Amplikon ... 34

G. Elektroforesis Hasil PCR Gen Lipase dan Gen gyr B ... 35

H. Sikuensing ... 35

I. Analisis Data Bioinformatika ... 36

J. Alur Penelitian ... 37

BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN ... 38

A. Karakterisasi dan Sub Kultur Bakteri A. hydrophila ... 39

B. Karakterisasi Morfologi dan Biokimia A. hydrophila (SNI 7303) ... 42

C. Karakterisasi Morfologi dan Biokimia Tambahan ... 51

D. Karakterisasi Molekular Bakteri A. hydrophila ... 63

E. Pra Sekuensing ... 67

F. Analisa Hasil Sikuensing ... 69

G. Analisa Filogenetik Gen gyr B ... 80

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 91

A.Kesimpulan ... 91

B.Saran ... 91

DAFTAR PUSTAKA ... 92

(9)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

3.1 Komposisi Reaksi Amplifikasi Gen Lipase pada A. hydrophila ... 32

3.2 Primer yang Digunakan Dalam PCR Sekuen Gen gyr B ... 33

3.3 Komposisi Reaksi Amplifikasi Gen gyr Penelitian ... 34

4.1 Hasil Sub Kultur Bakteri pada Medium RS ... 41

4.2 Hasil Uji Morfologi dan Biokimia (SNI 7303) Isolat Bakteri ... 43

4.3 Hasil Uji Morfologi dan Biokimia Tambahan Isolat Bakteri ... 51

4.4 Tabel Rekapan Hasil Identifikasi Biokimia Isolat Bakteri ... 62

4.5 Hasil Spektrofotometer DNA Isolat A. hydrophila ... 64

4.6 Hasil Spektrofotometer Amplifikasi Gen gyr B Isolat A. hydrophila ... 68

4.7 Hasil Sikuensing Pada Aeromonas Isolat Air Kolam ... 71

4.8 Hasil Blast Sikuen Isolat Aeromonas Isolat ATCC 7966 ... 73

4.9 Hasil Blast Parsial Sikuen Isolat Aeromonas ATCC 7966 ... 74

4.10 Hasil Blast Parsial Sikuen Isolat Aeromonas Air Kolam ... 76

4.11 Hasil Uji Biokimia dan Molekular Isolat Aeromonas Air Kolam ... 79

4.12 Karakteristik Aeromonas Isolat Air Beberapa Kota Secara Biokimia Maupun Molekuler ... 88

(10)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

2.1 Bakteri Aeromonas hydrophila ... 7

2.2 Infeksi Bakteri Aeromonas spp. pada kulit Ikan ... 8

2.3 Beberapa Hasil Uji pada Bakteri Aeromonas ... 10

2.4 Hasil Isolasi Bakteri Aeromonas pada Medium RS ... 11

2.5 Penampakan Koloni Bakteri Pada Medium ... 11

2.6 Penentuan Bakteri Gram Negatif Pada Aeromonas Spp ... 12

2.7 Produksi ß-Hemolysis Oleh A. Hydrophila Pada Tryptone Soy Agar ... 13

2.8 Uji Motilitas Dan Produksi H2S Pada Bakteri Aeromonas Spp ... 14

2.9 Uji Oksidasi Pada Aeromonas Spp ... 15

2.10 Reaksi Positif Isolat Bakteri Aeromonas Spp. Pada Uji Oksidatif-Fermentatif ... 15

2.11 Reaksi Fermentasi Lakosa Pada Medium Mac Conkey ... 16

2.12 Hasil Uji Sitrat pada isolat Aeromonas spp ... 17

2.13 Hasil uji indol terhadap isolat bakteri Aeromonas ... 17

2.14 Hasil pengujian V-P pada isolat bakteri Aeromonas ... 18

2.15 Rekonstruksi Pohon filogenetika ... 24

3.1 Program PCR Gen Lipase ... 33

3.2 Program PCR Geng gyr B ... 34

3.3 Rumus Perhitungan Konsentrasi DNA ... 35

3.4 Bagan Alur Penelitian ... 37

4.1 Koloni Isolat Aeromonas Pada Mediu RS ... 39

4.2 Penampakan Morfologi Aeromonas sp diatas Medium RS ... 40

4.3 Hasil Pewarnaan Gram Isolat Bakteri Aeromonas ... 44

4.4 Indikator lengket yang ditunjukan oleh bakteri Aeromonas (gram negatif) dalam KOH string test ... 44

4.5 Uji Motilitas Dan Produksi H2S Isolat Bakteri ... 46

(11)

4.7 Hasil Uji Oksidatif Isolat Bakteri Dalam Penelitian ... 48

4.8 Reaksi Positif Isolat Bakteri Pada Uji Oksidatif-Fermentatif ... 49

4.9 Hasil uji OF ... 49

4.10 Kemampuan Hemolisis Isolat Bakteri A. hydrophila ... 52

4.11 Kemampuan Hemolisis Isolat Bakteri A. hydrophila ... 53

4.12 Kemampuan Hemolisis Isolat Bakteri A. hydrophila dari Isolat Air ... 53

4.13 Hasil Uji Vouges-Praukover A. hydrophila ... 55

4.14 Hasil Uji VP Isolat Bakteri A. hydrophila ... 55

4.15 Hasil uji fermentasi Lactosa isolat Aeromonas Air Kolam pada medium Mac konkey ... 57

4.16 Hasil Uji Positif Fermentasi Laktosa ... 57

4.17 Hasil Uji negatif Fermentasi Laktosa ... 57

4.18 Hasil Uji Indole ... 59

4.19 Hasil Uji Indol ... 59

4.20 Hasil Uji Simons Sitrat ... 60

4.21 Elektroforesis Gen Lipase Isolat Aeromonas ... 64

4.22 Elektroforesis Hasil Amplifikasi Gen gyr B... 67

4.23 Elektrogram (Peak) Sikuen Isolat Aeromonas ATCC ... 70

4.24 Elektrogram (Peak) Sikuen Isolat Aeromonas AKC ... 70

4.25 Aligmnent sikuens gen gyr B ... 77

4.26 Urutan Aligment sikuen gen gyr B Isolat Aeromonas ... 77

4.27 Rekonstruksi Pohon Filogentika ... 85

(12)

Lampiran Halaman

1. Daftar Alat Penelitian ... 101

2. Daftar Bahan Penelitian ... 103

3. Protokol Pembuatan Medium ... 105

4. Hasil Sikuensing Gen gyr B Bakteri Aeromonas Isolat Air ... 110

5. Pohon Filogenetik 16s rRNA ... 118