TESIS
KARAKTERISTIK MOLEKULER DAN FILOGENI
LALAT BUAH Bactrocera occipitalis
(Diptera:Tephritidae) DI BALI BERDASARKAN
SEKUEN NUKLEOTIDA GEN COI
DWI MARTININGSIA
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
TESIS
KARAKTERISTIK MOLEKULER DAN FILOGENI
LALAT BUAH Bactrocera occipitalis
(Diptera:Tephritidae) DI BALI BERDASARKAN
SEKUEN NUKLEOTIDA GEN COI
DWI MARTININGSIA NIM 1390861007
PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
KARAKTERISTIK MOLEKULER DAN FILOGENI
LALAT BUAH Bactrocera occipitalis
(Diptera:Tephritidae) DI BALI BERDASARKAN
SEKUEN NUKLEOTIDA GEN COI
Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister
pada Program Magister, Program Studi Bioteknologi Pertanian,
Program Pascasarjana Universitas Udayana
DWI MARTININGSIA NIM 1390861007
PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN
PROGRAM PASCASARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
2016
Lembar Pengesahan
TESIS INI TELAH DISETUJUI PADA
TANGGAL 15 JUNI 2016
Pembimbing I, Pembimbing II,
Prof. Dr. Ir. I Nyoman Wijaya, MS. I Putu Sudiarta, SP.,M.Si.,Ph.D NIP. 19561207 198403 1 001 NIP. 19791107 200501 1 002
Mengetahui
Ketua Program Studi Bioteknologi Pertanian Direktur
Program Pascasarjana Program Pascasarjana Universitas Udayana, Universitas Udayana,
Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, M.P. Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp. S(K) NIP. 19621009 198803 1 002 NIP. 19590215 198510 2 001
Tesis Ini Telah Diuji pada Tanggal 15 Juni 2016
Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor
Universitas Udayana, No. : 2658/UN14.4/HK/2016, Tanggal 9Juni 2016
Ketua : Prof. Dr. Ir. I Nyoman Wijaya, MS. Anggota :
1. I Putu Sudiarta, SP., M.Si.,Ph.D 2. Prof. Dr. Ir. I Made Sudana, MS.
3. Dr. G.N. Alit Susanta Wirya, S.P. M.Agr. 4. Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, MP.
SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT
Saya yang bertanda tangan di bawah ini:
Nama : Dwi Martiningsia
NIM : 1390861007
Program studi : Bioteknologi Pertanian
Judul Tesis : KARAKTERISTIK MOLEKULER DAN FILOGENI LALAT BUAH Bactrocera occipitalis (Diptera:Tephritidae) DI BALI BERDASARKAN SEKUEN NUKLEOTIDA GEN COI
Dengan ini menyatakan bahwa karya ilmiah tesis ini bebas plagiat.
Apabila dikemudian hari terbukti plagiat dalam karya ilmiah ini, maka saya
bersedia menerima sanksi sesuai peraturan Mendiknas RI No. 17 Tahun 2010 dan
Peraturan Perundang-undangan yang berlaku.
Denpasar, 15 Juni 2016 Yang membuat pernyataan
(Dwi Martiningsia)
UCAPAN TERIMA KASIH
Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadapan Tuhan Yang Maha Esa yang
telah melimpahkan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang
berjudul KARAKTERISTIK MOLEKULER DAN FILOGENI LALAT
BUAH Bactrocera occipitalis (Diptera:Tephritidae) DI BALI
BERDASARKAN SEKUEN NUKLEOTIDA GEN COI.
Tesis ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Pertanian pada program studi Bioteknologi Pertanian Universitas
Udayana. Penulis menyampaikan ucapan terima kasih dengan rasa tulus kepada
Prof. Dr. Ir. I Nyoman Wijaya, MS. dan I Putu Sudiarta, SP., M.Si.,Ph.D selaku
dosen pembimbing yang senantiasa sabar memberikan bimbingan, masukan, dan
saran-saran kepada penulis. Prof. Dr. Ir. I Made Sudana, MS., Dr. G.N. Alit
Susanta Wirya, S.P. M.Agr. dan Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, MP.
selaku dosen penguji yang telah memberikan arahan dan saran yang bermanfaat
kepada penulis. Ucapan terima kasih juga penulis tujukan kepada Rektor
Universitas Udayana Prof. Dr. dr. Ketut Suastika, Sp.PD., KEMD dan Ibu
Direktur PascasarjanaUniveristas Udayana Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp.
S(K). Bapak Suharibut, Ibu Beng Amiyati, Rony Widyastono (Suami),
Anak-anak tercinta Armadhata Surya dan Armitha Asa Yasyifa, Ika Desiarti, Trio
Maidiantoro, Catur Noviani, Bapak Asmai Hadi, Ibu Widayati atas dukungan
semangat, perhatian, dan doa yang telah diberikan kepada penulis selama kuliah
di Universitas Udayana. Staf Bioteknologi Pertanian Ni Made Intan M., keluarga
besar Bioteknologi Pertanian angkatan 2013 Ni Nengah Putri Adnyani, Putu
Shinta D., Putra Wiratama, Tinny L., Agung D., N. Diyah, Febri, Nisa S., Irsan
N., Kade K., Rahde, dan Adit terima kasih atas semangatnya selama kuliah.
Keluarga Besar BKP Kelas I Denpasar, BKP Kelas I Tarakan, dan BKP Kelas I
Balikpapan. Seluruh dosen dan staf Bioteknologi Pertanian, Terima kasih juga
untuk seluruh pihak dan teman-teman yang telah turut membantu penulisan tesis
ini, maaf jika ada beberapa pihak yang belum disebutkan.
Penulis sangat menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan
untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun
sehingga tesis ini bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Denpasar, Juni 2016
Dwi Martiningsia
ABSTRAK
KARAKTERISTIK MOLEKULER DAN FILOGENI LALAT BUAH
Bactocera occipitalis (Diptera:Tephritidae) DI BALI BERDASARKAN
SEKUEN NUKLEOTIDA GEN COI
Bactrocera occipitalis merupakan salah satu spesies dari kelompok B. dorsalis
komplek. Inang utama dari B. occipitalis adalah mangga (Mangifera indica), jambu (Psidium guajava), jeruk (Citrus sp), sawo (Achras zapota) dan belimbing (Averrhoa carambola). B. dorsalis kompleks memiliki morfologis serupa dan memiliki karakter yang kurang khas untuk identifikasi taksonomi, barcode
berbasis DNA bisa memecahkan masalah ini. Berdasarkan karakter morfologi, spesies Bactrocera dorsalis komplek yang baru ditemukan di Bali merupakan B. occipitalis, dan memiliki karakter morfologi yang sama dengan B. occipitalis dari Tarakan. Identifikasi molekuler B. occipitalis Bali dan Tarakan berhasil dilakukan dengan gen COI yaitu teramplifikasi pada 642 pb. Berdasarkan tingkat homologi sekuen COI B. occipitalis Bali memiliki tingkat similaritas yang tinggi dengan B. occipitalis Tarakan dan Filipina yaitu 94,5%-95,2%. Analisa Filogenetika dan jarak genetik sekuen DNA berdasarkan sekuen gen COI juga menunjukkan kedekatan genetik dengan B. occipitalis Tarakan dan Filipina.
Kata kunci : Bactrocera occipitalis, gen COI
ABSTRACT
MOLECULER CHARACTERISTICS AND PHYLOGENY OF FRUIT FLIES
Bactocera occipitalis (Diptera: Tephritidae) IN BALI BY GENE NUCLEOTIDE SEQUENCE COI
Bactrocera occipitalis is one species of group B. dorsalis complex. The main host of B. occipitalis is mango (Mangifera indica), guava (Psidium guajava), orange (Citrus sp), sapodilla (Achras zapota) and star fruit (Averrhoa). B. dorsalis
complex has similar morphological and have a less distinctive character for taxonomic identification, barcode-based DNA could solve this problem. Base on morphological characters, Bactrocera dorsalis complex species in new coming in Bali is B. occipitalis, and had the same morphological characters with B. occipitalis of Tarakan. B. occipitalis Bali and Tarakan were successfully identified by on molecular character using PCR and amplified on 642 bp. Based on sequence homology COI B. occipitalis Bali has a high of similarity with B. occipitalis Tarakan and the Philippines is 94.5% -95.2%. The phylogenetic analysis of DNA sequences and genetic distance based on COI gene sequences showing too genetic closeness with B. occipitalis Tarakan and the Philippines.
Keywords: Bactrocera occipitalis, COI gene
RINGKASAN
Lalat buah Bactrocera occipitalis merupakan salah satu spesies dari kelompok lalat buah B. dorsalis komplek. B. dorsalis kompleks memiliki morfologis serupa dan memiliki karakter yang kurang khas untuk identifikasi taksonomi. B. dorsalis komplek adalah hama polifag dan sangat invasif sehingga merupakan spesies hama penting dalam pertanian. Lalat buah B. dorsalis komplek secara signifikan menyebabkan kerugian ekonomi, kerusakan buah, penurunan produksi buah dan hilangnya pasar ekspor yang terkait dengan pembatasan karantina.
Berdasarkan hasil identifikasi lalat buah Bactrocera yang baru ditemukan di Bali memili ciri spesifik morfologi B. occipitalis yang membedakan dibandingkan spesies yang lain yang termasuk B. dorsalis komplek yaitu costal band overlapping R2+3 dan dengan jelas melebar di bagian apeks sayap, cubital streaks yang meruncing;abdomen terga III-Vdengan band yang melintang dibagian anterior dan melebar menutupi bagian lateral. Terga IV gelap hingga hitam dengan rectangular marking anterolateral kadan-kadang continue menutupi hingga bagian posterolateral terga ini. Terga V juga gelap kecoklatan dengan bagian sudut anterolateral. Medial longitudinal lebar dan hitam pada terga II-V. Ceromae berwarna coklat orange terang.
B. dorsalis kompleks memiliki morfologis serupa dan pada tahap perkembangan awal memiliki karakter yang kurang khas untuk identifikasi taksonomi, barcode berbasis DNA bisa memecahkan masalah ini. Barcoding DNA secara bertahap merupakan alat yang efektif untuk mengidentifikasi spesies dalam kisaran yang luas pada grup taksonomi, dan beberapa publikasi melaporkan bahwa penanda DNA rata–rata efektif dan cepat untuk identifikasi lalat buah. Identifikasi molekuler B. occipitalis Bali dan Tarakan berhasil dilakukan dengan gen COI yaitu teramplifikasi pada 642 bp.
Berdasarkan tingkat homologi sekuen COI B. occipitalis Bali memiliki tingkat similaritas yang tinggi dengan B. occipitalis Tarakan dan Filipina yaitu 94,5%-95,2%. Analisa Filogenetika dan jarak genetik sekuen DNA berdasarkan sekuen gen COI juga menunjukkan kedekatan genetik B. occipitalis Bali dengan
B. occipitalis Tarakan dan Filipina. Berdasarkan analisa filogenetik B. occipitalis
Bali berada satu clade dengan B.occipitalis Tarakan dan B. occipitalis Filipina yaitu berada pada kelompok monofiletik. Jarak genetik sekuen gen COI B. occipitalis Bali dengan B. occipitalis Tarakan dan Filipina sekitar 0,043-0,052.
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Kabupaten Bondowoso Jawa Timur pada tanggal 21 Maret 1980 dari pasangan Bapak Suharibut dan Ibu Beng Amiyati. Penulis merupakan anak kedua dari empat bersaudara. Penulis menikah dengan Rony Widyastono dan memiliki dua anak yaitu Armadhata Surya dan Armitha Asa Yasyifa.
Tahun 1998 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Bondowoso dan pada tahun 2004 penulis menyelesaikan program sarjana di UPN “Veteran” Jawa Timur
program studi Hama Penyakit Tanaman. Penulis bekerja di Balai Karantina Pertanian Kelas I Denpasar dan pada tahun 2013 penulis melanjutkan kuliah
dengan mengambil program magister Bioteknologi Pertanian di Pascasarjana Universitas Udayana.
DAFTAR ISI
Halaman
SAMPUL DALAM ... i
PRASYARAT GELAR ... ii
LEMBAR PERSETUJUAN ... iii
PENETAPAN PANITIA PENGUJI ... iv
SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT ... v
UCAPAN TERIMAKASIH ... vi
ABSTRAK……… viii
ABSTRACT……….. ix
RINGKASAN……….. x
DAFTAR ISI……… .... xi
DAFTAR TABEL……… xiii
DAFTAR GAMBAR……… xiv
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Rumusan Masalah ... 3
1.3 Tujuan Penelitian ... 3
1.4 Manfaat Penelitian ... 4
BAB II KAJIAN PUSTAKA ... 5
2.1 Bactrocera ... 5
2.1.1 Bactrocera occipitalis...…….... 7
2.2 Mitokondria Citochrome Oxidase I (mtCOI) ... 8
BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS ... 11
3.1 Kerangka Berpikir Penelitian ... 11
3.2 Konsep Penelitian ... 13
3.3 Hipotesis Penelitian ... 14
BAB IV BAHAN DAN METODE .. ... 16
4.1. Waktu dan Tempat Penelitian ... 16
4.2 Bahan dan Alat Penelitian ... 16
4.3 Metode Penelitian. ... 17
4.3.1 Pemasangan Perangkap ... 17
4.3.2 Identifikasi secara morfologi………… ... 18
4.3.3 Identifikasi secara molekuler………… ... 18
4.3.3.1 Ekstraksi DNA ………… ... 18
4.3.3.2 Polymerese Chain Reaction (PCR)………… ... 19
4.3.3.3 Elektroforesis dan Sekuensing……… ... 20
4.3.3.3 Analisis sekuen dan Filogenetik………… ... 21
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN ... 22
5.1. Karakteristik Morfologi B. occipitalis... 22
5.2 Karakter Molekuler B. occipitalis berdasarkan Gen COI………... 25
BAB VI SIMPULAN DAN SARAN ... 31
6.1. Simpulan ... 32
6.2 Saran ... 32
DAFTAR PUSTAKA ... 33
RIWAYAT HIDUP ... 36
LAMPIRAN………. 37
DAFTAR TABEL
Halaman
5.1 Tingkat homolog (%) B.occipitalis Bali dengan B. occipitalis dari
Tarakan, dan spesies B.occipitalis negara lain yang terdapat di GenBank Berdasarkan Gen COI ... 26 5.2 Matriks Jarak Genetik B.occipitalis Bali dengan B. occipitalis dari
Tarakan, dan negara lain yang terdapat di GenBank Berdasarkan
Gen COI ... 29
DAFTAR GAMBAR
Halaman
2.1 Caput Bactrocera ... 6
2.2 Thorax Bactrocera ... 6
2.3 Sayap Bactrocera ... 7
2.4 Abdomen Bactrocera ... 7
2.4 Daerah Gen Mitokondria ... 10
3.1 Kerangka Berpikir ... 12
3.2 Konsep Penelitian………. 15
5.1 Karakteristik Morfologi B. occipitalis Bali... 24
5.2 Hasil amplikasi DNA B. occipitalis Bali dan B. occipitalis Tarakan .. 25
5.3 Pohon filogeni B. occipitalis Balidibandingkan dengan B. occipitalis Tarakan dan negara lain berdasarakan Gen COI ... 27
Anastrepha ludens CTGATATTAT ACAATTAACT TTATACTCAA CAACATTGAT Bac_Caryae AAGGCATTAC AGTAGCTGCG CTAGTGGGCG AAGTGTGCGA Anastrepha ludens TTCTAGTCTC ATTTTTATTC AAATAAATCA TCCATTAGCA Bac_Caryae GTCACCC-TC ACATTGGCGT --GCAAAGCA GACGCTGTCA Anastrepha ludens ATAGGATTAA TATTATTAAT -TCAAACATT ACAAAATTGT Bali
1
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Lalat buah merupakan salah satu hama hortikultura yang paling merusak di
dunia dan menimbulkan risiko bagi kebanyakan buah komersial dan sayuran
(Allwood et al., 1999; Clarke et al., 2005). Hal ini memiliki implikasi besar untuk
produksi yang berkelanjutan dan akses pasar. Di seluruh dunia ada sekitar 4000
spesies lalat buah yang termasuk famili Tephritidae dan sekitar 350 spesies
merupakan organisme penggangu tumbuhan yang menyebabkan kerugian ekonomi
(Plant Health Australia, 2011).
Lalat buah Bactrocera dorsalis komplek adalah hama polifag dan sangat
invasif sehingga merupakan spesies hama penting dalam pertanian (Stephens et al.,
2007; Advasakulchai et al., 1999). Lalat buah B. dorsalis secara signifikan
menyebabkan kerugian ekonomi, kerusakan buah, penurunan produksi buah dan
hilangnya pasar ekspor yang terkait dengan pembatasan karantina (Wan et al., 2011).
Bactrocera occipitalis merupakan salah satu spesies B. dorsalis komplek (Clarke et
al., 2005; Delomen et al., 2013; Plant Health Australia, 2011). Inang utama dari B.
occipitalis adalah mangga (Mangifera indica), jambu (Psidium guajava), jeruk
(Citrus sp) (Clarke et al., 2005; Delomen et al., 2013; Yu et al., 2005; Allwood et al.,
1999). Menurut Pujiastuti et al., 2009 dan Permentan no. 93/Kpts/H.k.060/12/2011
2
bahwa sawo (Achras zapota) dan belimbing (Averrhoa carambola) juga merupakan
inang B. occipitalis.
B. dorsalis kompleks memiliki morfologis serupa dan pada tahap
perkembangan awal memiliki karakter yang kurang khas untuk identifikasi
taksonomi, barcode berbasis DNA bisa memecahkan masalah ini (Frey et al., 2013).
Barcoding DNA secara bertahap merupakan alat yang efektif untuk mengidentifikasi
spesies dalam kisaran yang luas pada grup taksonomi, dan beberapa publikasi
melaporkan bahwa penanda DNA rata–rata efektif dan cepat untuk identifikasi lalat
buah (Jiang et al., 2014). Diagnosis secara genetik dengan mtCOI dan 16 s DNA
dapat membedakan secara spesifik antara spesies B. occipitalis dan B. philipinensis.
Deteksi dan identifikasi dengan menggunakan Polimerase Chain Reaction ( PCR)
dengan primer spesifik yang dirancang berdasarkan Mitokondria sitokrom oksidase I
(COI) telah dilakukan dan menghasilkan hasil deteksi yang cepat dan spesifik (Yu et
al., 2005).
Daerah sebar B. occipitalis menurut Drew, 2010 meliputi Filipina, Malaysia
Timur (Sabah), Brunei, Indonesia (Kalimantan). Berdasarkan Peraturan Menteri
Pertanian no. 93/Kpts/Hk.060/12/2011 tentang jenis-jenis OPTK, B. occipitalis
merupakan OPTK A2 yang artinya B. occipitalis ada di Indonesia tetapi masih di
daerah yang terbatas yaitu di Kalimantan, Jawa Barat (Bogor), dan Sumatera
(Tanjung Balai Karimun) sedangkan provinsi Bali dinyatakan masih bebas dari B.
occipitalis. Berdasarkan Larasati et al.,2013 keberadaan B.occipitalis di Bogor
3
berdasarkan Pemantauan BKP Kelas I Denpasar tahun 2012 belum ditemukannya B.
occipitalis di provinsi Bali. Hasil Pemantauan OPT/OPTK BKP Kelas I Denpasar
2013 dan 2014 ditemukan B. occipitalis. Berdasarkan hal tersebut diperlukan adanya
penelitian identifikasi B. occipitalis secara morfologi, karakteristik dan filogenetik
molekuler untuk mempelajari karakteristik B. occipitalis di Provinsi Bali.
I.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan uraian diatas, dirumuskan beberapa permasalahan yaitu :
1. Bagaimanakah karakteristik morfologi B. occipitalis dan karakteristik
molekuler yang ditemukan di Bali berdasarkan sekuen gen COI ?
2. Bagaimanakah hubungan kekerabatan (filogenetik) B. occipitalis berdasarkan
sekuen gen COI yang ada di provinsi Bali dengan B. occipitalis berdasarkan
sekuen gen COI yang ada di Kalimantan, dan negara lain berdasarkan dari
GenBank ?
I.3 Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini yaitu :
1. Mengetahui karakteristik morfologi B. ocipitalis dan karakteristis molekuler
yang ditemukan di Bali berdasarkan sekuen gen COI.
2. Mengetahui kekerabatan B. occipitalis berdasarkan sekuen gen COI di Bali
4
1.4 Manfaat Penelitian
Manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah untuk memberikan informasi
tentang karakter morfologi dan karakter genetik B. occipitalis di pulau Bali serta
filogenetik B. occipitalis di pulau Bali dengan beberapa daerah di Indonesia yang
telah diketahui terlebih dahulu ditemukan sehingga bisa digunakan untuk penentuan
kebijakan dalam manajemen pengendalain dan kebijakan Badan Karantina Pertanian
dalam lalu lintas buah di Indonesia baik yang berupa impor maupun antar wilayah di
dalam Negara Kesatuan Republik Indonesia sehingga mencegah tersebarnya OPTK
B. occipitalis.
