ANALISA KOMPONEN BIOAKTIF PANGAN FUNGSIONAL

ANALISA KOMPONEN BIOAKTIF

PANGAN FUNGSIONAL

Kompetensi yang diharapkan :

•

Mahasiswa

mampu

menjelaskan

metode

pengujian

komponen

bioaktif pangan fungsional

METODE ANALISIS

Tipe Analisis Ruang Lingkup

Metode Parameter

Micro of trace Konstituen mikro

Kromatografi dan Spektroskopi

Sifat kimia dari komponen

Macro Konstituen

Major

Fisiko-kimia, analisis termal

Sifat kimia, perilaku termal

Bulk Produk Reologi Tekstur,

viskositas

Pengembangan Metode

Analisis sesuai Metode

Dokumentasi

Kontrol Mutu secara Statistik

Jaminan Mutu

Tidak diperlukan pengulangan setiap kali analisis dilakukan

Variasi dari satu lab dengan lab yang lain harus dihindari dan hasilnya harus dapat diulang

Dapat dilakukan pengembangan dengan perubahan sesuai kebutuhan

Korelasi fungsi dan konstituen kimia dikembangkan

Memberi keuntungan bagi konsumen

We Do So that

ANALISIS MIKRO

• Langkah-langkah yang harus dikerjakan adalah :

– Defenisi masalah

– Persiapan sampel yang mewakili

– Persiapan sampel atau ekstraksi

– Seleksi alat dan kondisi analisis

– Analisis berdasarkan metode yang dipilih

– Kompilasi hasil

– Metode

Pengembangan metode : Cara-cara ekstraksi :

Presipitasi Ekstraksi Solvent Ekstraksi fase padat Hati-hati dalam memilih :

Ekstraksi Analit dari Matriks

Sistem Metodologi Relefansi Keterangan

Cair Pemisahan

Cair-cair

Isolasi komponen dari matriks

Pemecahan emulsi dengan cara presipitasi atau desalting

Padat Ekstraksi

Soxhlet

Jangan ada kebocoran untuk mencegah kehilangan

KOMPONEN FENOLIK TANAMAN

• Fenoilk : komponen yang memiliki 1 atau lebih cincin

aromatik dengan 1 atau lebih gugus hidroksil.

• Terdistribusi secara luas pada hampir semua jenis tanaman sebagai metabolit sekunder

• Saat ini lebih dari 8000 struktur fenolik yang dikenal, dari mulai molekul yang sederhana seperti asam fenolat hingga struktur polimer seperti tanin.

• Fenoiik tanaman biasanya terbentuk untuk melawan radiasi matahari, patogen, parasit dan ppredator, juga berkontribusi terhadap warna pada tanaman.

• Terdapat pada hampir semua bagian tanaman  merupakan bagian dari diet manusia

• Berkontribusi terhadap karakteristik organoleptik, misalnya rasa pahit, astrigen (sepat) yang disebabkan interaksi

• Bereaksi dengan oksigen dan merupakan faktor kritis pada pengawetan, pematangan dan aging dari anggur (wine)

FENOLIK TANAMAN

•

Asam fenolat

•

Flavonoid

•

Tanin

•

Stilbenes

•

lignan

FLAVONOID

• Struktur : inti flavon tdd 15 atom C dengan 3 cincin (C6-C3-C6) yang disebut dengan A,B,C

• Tdd 6 sub kelompok : 1. Flavone 2. Flavonol 3. Flavanol 4. Flavanon 5. Isovlavon 6. Antosianin

FLAVONOID

• Quercitin adalah flavonol terdapat pada bawang, brokoli, apel

• Katekin adalah flavanol yang terdapat pada beberapa jenis buah

• Naringin  flavanon yang terdapat pada grapefruit (jeruk besar)

• Cyanindin-glikosida  antosianin yang terdapat pada buah2 beri seperti black currant, rasberi, blackberry dll

• Daidzein, genistein dan glisitin  isoflavon pada kedelai

ASAM FENOLAT

• Tdd 2 kelas :

1. Turunan asam benzoat : asam galat

2. Turunan asam sinamat : asam kumarat, asam kafeat dan asam ferulat

• Asam kafeat :

Diesterifikasi dengan asam quinat  asam klorogenat yaitu komponen fenolik pada kopi

• Asam ferulat :

Terdapat pada serealia

Diesterifikasi menjadi hemiselulosa pada dinding sel

TANIN

• Tdd atas 2 kelompok : 1. Hydrolyzable tannin 2. Condensed tannin

• Hydrolyzable Tannin :

 Komponen yang terdiri dari gugus inti glukosa atau poliol teresterifikasi lain dengan asam galat  disebut gallotannin

 Jika dengan hexahydoxilpenat  disebut elagitannin

• Condensed Tannin :

 Oligomer atau polimer dari flavon 3-ol yang berikatan dengan ikatan karbon interflavon

 Dikenal sebagai asam proantosianin  didekomposisi membentuk antosianin melalui reaksi oksidasi yang dikatalis asam melalui pemanasan larutan alkohol asam

Gambar. Struktur Flavonoid, Asam Fenolat dan tanin

Gambar. Struktur Stilbenes dan Lignan

EKSTRAKSI FENOLIK

• Dapat diekstrak dari sampel segar, beku atau yang dikeringkan

• Perlakuan sebelum ekstraksi : Milling, grinding, homogenisasi  didahului dengan pengeringan duara atau freeze drying

• Metode ekstraski yang banyak digunakan solvent  rendemen tergantung pada :

Polaritas pelarut Waktu ekstraksi Suhu

Rasio sampel : pelarut

Komposisi kimia dan sifat fisik sampel

EKSTRAKSI FENOLIK (2)

• Jenis pelarut : Metanol Etanol Aseton Etil asetat Kombinasi pelarut

Kombinasi dengan air pada berbagai proporsi

• Metanol  efisien untuk komponen polifenol dengan BM rendah

• Aseton aqueous  untuk flavanol dengan BM tinggi

EKSTRAKSI FENOLIK (3)

• Ekstraksi fenolik dari tanaman yang kaya akan antosianin : Pelarut organik yang diasamkan

Sistem pelarut akan mendenaturasi membran sel  melarutkan antosianin dan menstabilkannya

Penambahan asam harus hati-hati karena kelebihan asam akan menghidrolisis antosianin

Asam yang digunakan : asam organik lemah : asam formiat, asam asetat, asam sitrat, asam tartarat dan asam posporik, atau asam kuat dengan konsentrasi rendah misalnya asam trifluroasetat 0.5-3%, HCl <1%

Air yang disulfurisasi dapat digunakan untuk mengurangi pelarut organik dan biaya ekstraksi

EKSTRAKSI FENOLIK (3)

• Ekstraksi fenolik dari tanaman yang kaya akan antosianin : Pelarut organik yang diasamkan

Sistem pelarut akan mendenaturasi membran sel  melarutkan antosianin dan menstabilkannya

Penambahan asam harus hati-hati karena kelebihan asam akan menghidrolisis antosianin

Asam yang digunakan : asam organik lemah : asam formiat, asam asetat, asam sitrat, asam tartarat dan asam posporik, atau asam kuat dengan konsentrasi rendah misalnya asam trifluroasetat 0.5-3%, HCl <1%

Air yang disulfurisasi dapat digunakan untuk mengurangi pelarut organik dan biaya ekstraksi

EKSTRAKSI FENOLIK (4)

• Suhu ekstraksi : 20-50o_{C, suhu diatas 70}o_{C akan mendegradasi}

antosianin

• Metode ekstraksi : Soxhlet Maserasi Mikrowave

Ultrasound-assisted extraction (UAE) Subcritical water extraction (SWE) Pressurized Fluid Extraction (PFE) Accelerated Solvent Extraction (ASE)

Efisiensi rendah dan berpotensi mencemari lingkungan

Ultrasound-Assisted Extraction (UAE)

• Berpotensi dikembangkan  tidak membutuhkan peralatan yang kompleks dan relatif murah

• Dapat digunakan untuk skala kecil maupun besar • Mekanisme :

Gaya geser akan timbul akibat kavitasi gelembung oleh propagasi gelombang akustik.

Gelembung akan kolaps melalui pengaruh fisik, kimia dan mekanis yang mengakibatkan rusaknya membran bo=iologis  memudahkan ekstraksi komponen dan penetrasi pelarut ke dalam sel serta meningkatkan laju pindah massa. • Digunakan secara luas untuk ekstraski komponen fenolik dari

Pressurized Liquid Extraction (PLE)

•Istilah dalam industri Accelerated solvent extraction (ASE)

•Teknologi yang realtif baru dengan suhu dan tekanan tinggi

•Tekanan diaplikasikan untuk meningkatkan ekstraski pelarut  ekstraksi pelarut > jika digunakan suhu yang lebih tinggi dari titik didih normal.

•Kombinasi tekanan tinggi (3.3-20.3 MPa) dan suhu tinggi (40-200°C) mempercepat proses dan membutuhkan sedikit pelarut (contoh : 20 menit menggunakan 10–50 mL pelarut jika dibandingkan ekstraksi tradisional yang butuh waktu 10–48 jam dan > 200 ml pelarut.

•Suhu dan tekanan tinggi meningkatkan kelarutan analit dan kinetika desporpsi dari matriks.

Subcritical Water Extraction (SWE)

•Sama dengan PLE tapi pelarut yang digunakan adalah air

•Air dipanaskan hingga suhu200°C dan terjadi perubahan konstanta dielektrik air sehingga air bersifat sebagaimana pelarut organik.

•Contoh konstanta dielektrik air pada suhu 200°C = 36 yang mendekati konstanta dielektrik metanol.

• PLE (80–100°C) menggunakan air yang diasamkan asam efektifnya dengan metanol 60% yang diasamkan untuk mengekstraksi antosianin dari kulit anggur.

•Komponen fenolik lebih mudah teroksidasi pada suhu tinggi, sehingga perlu dicegah degradasi pada kondisi PLE.

•PLE efektif digunakan untuk ekstraksi komponen fenolok pada biji anggur, apel, bayam, terung dan tepung barley.

Microwave Assited Extraction (MAE)

• Ekstraksi dengan menggunakan energi gelombang mikro untuk memudahkan pemisahan analit dari matriks sampel ke dalam pelarut.

• Keuntungan : mengurangi waktu ekstraksi dan volume pelarut jika dibandingkan metode ekstraksi konvensional.

• Digunakan untuk ekstraski fenolik : asam galatm elagat, quersitin, isoflavon dan trans-resveratrol  menggunakan mikrowave pada suhu 100 °C selama 20 menit.

• Komponen fenolik yang dihasilkan memiliki susbtituen hydroksil dengan jumlah tinggi (misal tanin) dan sensitif terhadap kenaikan suhu  antosianin tidak dapat diekstraksi dengan MAE

Extraction of

Extraction of phlorotannins

phlorotannins

Bubuk Bubuk AlgalAlgal (0.5 g)(0.5 g)

  Pengadukan dengan

Pengadukan dengan shaker shaker menggunakan menggunakan methanol (2 ml) methanol (2 ml) pada suhu ruang selama 2 jampada suhu ruang selama 2 jam

  Penambahan

Penambahan CHClCHCl3 3 (4 ml) (4 ml) pengadukan dengan tangan selama 5 menitpengadukan dengan tangan selama 5 menit 

 Filtratra

Filtratrasi menggunakan kapas bebas lemaksi menggunakan kapas bebas lemak

  Penambahan air bebas ion

Penambahan air bebas ion 1.5 ml 1.5 ml dan pengadukan dengan tangan selama 5 menitdan pengadukan dengan tangan selama 5 menit

 

Pemisahan campuran antara bagian atas dan bagian bawah, lapisan atas merupakan fraksi non Pemisahan campuran antara bagian atas dan bagian bawah, lapisan atas merupakan fraksi non

lemak dikumpulkan lemak dikumpulkan

  Diekstraksi 2 kali menggunakan

Diekstraksi 2 kali menggunakan ehylehyl ether (3 ml) ether (3 ml) dan ambil lapisan atas (2 kali)dan ambil lapisan atas (2 kali)

  Fraksi

Fraksi ethyl ether ethyl ether dievaporasi menggunakan blower dievaporasi menggunakan blower nitrogennitrogen

 

P

Pemurnian

Pemurnian phlorotannins

phlorotannins

••

Analisa secara quantitatif menggunakan

Analisa secara quantitatif menggunakan

HPLC

HPLC

••

Sistem

Sistem HPLC

HPLC tdd

tdd Waters 600 pump,

Waters 600 pump,

detektor

detektor UV dan kolom

UV dan kolom and C 18.

and C 18.

••

Laju aliran

Laju aliran 1.0

1.0 mL

mL/m

/menit

enit

••

Gradien linier

Gradien linier 30

30--100% methanol

100% methanol

••

Detektor

Detektor UV

UV diatur pada

diatur pada 290 nm

290 nm

25 25

PEMISAHAN DAN PEMURNIAN

•

Dilakukan dengan kombinasi beberapa teknik

kromatografi yaitu TLC (

Thin Layer

Chromaography

) dan kromatografi kolom

(

Column Chromaography

).

KROMATOGRAFI KOLOM

• Terdiri dari fase stasioner (fase diam) dan fase mobil (fase bergerak).

• Fase diam berupa adsorben berbentuk bubuk yang dimasukkan ke dalam kolom gelas vertikal. Sampel yang akan dianalisa dimasukkan di bagian atas dari kolom ini.

• Fase bergerak adalah pelarut yang dialirkan dari atas ke kolom sehingga komponen dari bahan akan terdistribusi di antara adsorben dan pelarut dan terjadi pemisahan komponen, sedangkan pelarut akan mengalir ke bagian bawah kolom.

• Pada pemisahan ini ada komponen yang lebih cepat terelusi dan ada yang lebih lambat.

• Prinsip dasar kromatografi adalah komponen yang berbeda akan mempunyai kelaurtan dan adsorpsi yang berbeda di antara 2 fase sehingga dapat dipisahkan. Fase mobil kemudian dipaksa melalui sebuah fase sasioner yang tidak bergerak dan tidak dapat bersatu.

KROMATOGRAFI KOLOM

• Pemilihan fase didasarkan pada kelarutan komponen pada tiap fase.

THIN LAYER CHROMATIGRAPHY (TLC)

• Teknik pemisahan padat-cairan dimana fase stasioner berupa bahan padat sedangkan fase bergeraknya adalah cair.

• Bahan padat yang biasa digunakan dalam kromatografi adalah silika gel (SiO2xH2O) dan alumina (AL2O3xH2O). Kedua

adsorben ini merupakan adsorben yang bersifat polar, tetapi alumina lebih polar dibandingkan silika gel.

• Silika bersifat asam, sedangkan alumina terdapa dalam bentuk netral, basa atau asam.

• TLC merupakan teknik kromatografi yang sensitif, cepat, sederhana, murah, membutuhkan sampel dalam jumlah kecil (1-20 mg/ml), dan dengan visualisasi kimia yaitu mengekspos plate agar terjadi reaksi kimia dengan komponen akan terbentuk warna yang dapat dilihat dengan sinar ultraviole pada panjang gelombang tertentu.

THIN LAYER CHROMATIGRAPHY (TLC)

• Digunakan untuk menentukan :

banyaknya komponen di dalam campuran idenifikasi dua substansi/komponen  memonitor terjadinya reaksi Efektivitas proses pemurnian

Kondisi yang sesuai untuk pemisahan dengan kolom kromatografi

Memonitor kromatografi kolom

Ekstraksi Komponen Bioaktif dari Kedele dan Tempe

•

Bahan-Bahan :

bubuk kedele kering, tempe pelarut (hexan, etanol)

pelarut/eluen untuk kromatografi kolom (hexan, etil asetat, metanol)

eluen untuk TLC (hexan, eil asetat, dikloromettan, metanol)

silika gel

Reagen untuk visualisasi (larutan sulfur atau pospomolibdat dalam etanol)

TLC

Ekstraksi Komponen Bioaktif dari Kedele dan

Tempe

• Alat-alat :

Vacuum filter funnel

Kromatografi kolom

Lampu UV (254, 365 nm)

Botol

Sprayer

Hotplate/oven

Ekstraksi Komponen Bioaktif dari Kedele dan Tempe

• Cara kerja :

Sampel dalam bentuk bubuk diekstraksi/maserasi dengan hexan dan etanol sebanyak 3 kali.

Hasil ekstraksi dievaporasi sehingga diperoleh ekstrak kasar Siapkan TLC yang dilengkapi dengan indikator fluorescense

yang akan bervisualisasi dengan lampu ulraviolet pada panjang gelombang 254 nm, dengan dua atau lebih pelarut untuk menentukan pelarut yang terbaik.

Teteskan hasil ekstraksi/maserasi pada TLC

Ambil 3 ml pelarut (MeOH, etil asetat, hexan dan lain-lain) Masukkan ke dalam beaker glass

Letakkan TLC di dalamnya, tutup dan tunggu. Jika pelarut sudah sampai 0.5 cm di bagian atas TLC, angkat TLC. Beri anda dengan pensil, kemudian dikering anginkan. Lihat di bawah lampu UV

Solvent Depan

Origin Solvent Depan

Origin

Hexan:EtOAc Hexan:DOM 1 : 1 1 : 2

Gambar. Penentuan pelarut terbaik

Metode Analisa Antioksidan

• Pengujian kapasitas antioksidan suatu senyawa dilakukan secara bertahap sebagai berikut :bertahap sebagai berikut :

1. Uji in vitro menggunakan reaksi kimia misalnya metil-linoleat, DPPH (1,1-diphenyl -2- pycrylhydrazyl)

2. Uji in vitro menggunakan materi biologis, misalnya mengukur viabilitas sel (teknik kultur sel), pembentukan dien terkonjugasi dan kadar TBARS dari isolat LDL, dll 3. Uji in vivo pada model hewan percobaan, misalnya

aktifitas enzim antioksidan, kadar TBARS 4. Uji in vivo pada manusia

Metode Analisa Antioksidan (2)

Pengujian in vitro menggunakan reaksi DPPH atau ABTS

• DPPH dan ABTS merupakan senyawa radikal yang relatif stabil.

• DPPH berwarna ungu, namun apabila DPPH tereduksi oleh suatu antioksidan akan mengakibatkan penurunan intensitas warna ungu (memudar).

Metode Analisa Antioksidan (3)

Pengujian in vitro menggunakan reaksi kimia

Dien Terkonjugasi

Oksidasi asam lemak tidak jenuh mengubah ikatan rangkap menjadi konfigurasi dien terkonjugasi atau konfigurasi trien terkonjugasi.

Konfigurasi-konfigurasi ini dapat diukur dengan spektrofotometer UV langsung atau melalui kompleks turunan dengan spektra absorpsi.

Untuk pengujian antioksidan suatu senyawa uji, senyawa tersebut diinkubasi bersama-sama dengan asam linoleat, kemudian dioksidasi oleh CuSO4. Kadar dien terkonjugasi diukur pada 245 nm setiap

interval waktu tertentu sejak penambahan CuSO4 sehingga

membentuk kurva oksidasi. Semakin besar aktivitas antioksidan ditunjukkan oleh semakin panjangnya fase lag (dalam menit) oksidasi.

Metode Analisa Antioksidan (4)

Pengujian in vitro menggunakan materi biologis

Teknik Kultur Sel

Senyawa uji dikultur bersama sel limfosit yang diisolasi dari hewan atau manusia, kemudian diukur tingkat proliferasi sel hewan atau manusia, tersebut setelah masa inkubasi tertentu.

Sebagai pembanding digunakan model yang sama namun diberi stres oksidatif menggunakan senyawa oksidator (misalnya H2O2), dan sebagai kontrol adalah model tanpa penambahan senyawa uji.

Agar dapat menerima respon/sinyal untuk berpoliferasi, sel harus memiliki membran utuh. Adanya oksidasi pada lipid penyusun struktur membran sel, mengakibatkan sel tidak dapat merespon sinyal sehingga tingkat proliferasi sel menurun.

Dengan kultur sel dapat juga diukur TBARS sebagai indikator peroksidasi lipid

Metode Analisa Antioksidan (5)

Pengujian in vitro menggunakan materi biologis

LDL Teroksidasi

Model ini menggunakan LDL yang diisolasi dari hewan atau manusia.

Senyawa uji diinkubasi bersama-sama dengan LDL, kemudian dioksidasi oleh CuSO4. Kadar dien terkonjugasi diukur pada 245 nm setiap interval waktu tertentu sejak penambahan CuSO4 sehingga membentuk kurva LDL teroksidasi.

Semakin besar aktivitas antioksidan ditunjukkan oleh semakin panjangnya fase lag (dalam menit) oksidasi.

Sebagai pembanding digunakan model yang sama namun tanpa penambahan senyawa uji

Metode Analisa Antioksidan (6)

Pengujian in vivo (menggunakan hewan percobaan atau manusia)

Mula--mula senyawa uji diberikan kepada subyek, kemudian diukur keberadaan beberapa komponen yang terlibat dalam sistem antioksidan tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, sistem antioksidan tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, aktivitas enzim antioksidan dan lainnya)

Indikator lainnya yaitu dari pernafasan (hidrokarbon volatil, H2O2), dari

urin (TBARS, eikosanoids) dan dari darah, dari urin (TBARS, eikosanoids) dan dari darah (TBARS, LDL teroksidasi, H (TBARS, LDL teroksidasi, H2O2), glutation dan lainnya.

Metode Analisa Antioksidan (7)

Pengujian in vivo (menggunakan hewan percobaan atau manusia)

Mula--mula senyawa uji diberikan kepada subyek, kemudian diukur keberadaan beberapa komponen yang terlibat dalam sistem antioksidan tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, sistem antioksidan tubuh (vitamin E, glutation, askorbat, aktivitas enzim antioksidan dan lainnya)

Indikator lainnya yaitu dari pernafasan (hidrokarbon volatil, H2O2), dari

urin (TBARS, eikosanoids) dan dari darah, dari urin (TBARS, eikosanoids) dan dari darah (TBARS, LDL teroksidasi, H (TBARS, LDL teroksidasi, H2O2), glutation dan lainnya.

Apabila menggunakan hewan percobaan dapat dibandingkan dengan model yang diberi stres oksidatif dengan model yang diberi stres oksidatif.

Metode Uji Aktivitas Antimikroba

Metode Dilusi cair atau dilusi padat

• Pada prinsipnya, antibiotik diencerkan hingga diperoleh beberapa konsentrasi. Pada dilusi cair, masing-masing konsentrasi senyawa bioaktif ditambah suspensi kuman dalam media. Pada dilusi padat, tiap konsentrasi senyawa bioaktif dicampur dengan media agar, lalu ditanami kuman. Metode Difusi

• Cara Kirby Bauer

• Cara Sumuran (Cup Plate)

• Cara Pour Plate

•Skema penyiapan suspensi bakteri

Diambil 1 koloni bakteri dari stok bakteri (Staphylococcus aureus atau Escherichia coli)



Dimasukkan dalam BHI 1 ml



Diinkubasi 18-24 jam pada suhu 37ºC



Diambil 100 µl, dimasukkan dalam 1 ml BHI Diinkubasi 4-8 jam pada suhu 37ºC



Diencerkan dengan NaCl 0,9% sampai konsentrasi bakteri 108 _CFU/ml

(Kekeruhan disamakan dengan Standar Mc Farland)



Diencerkan sampai 106 _{CFU/ml dengan BHI DS}

(diperoleh suspensi bakteri dg konsentrasi 106 _CFU/ml)

CONTOH

1 2 3 4 K1 K2 K3 K4

Tabung uji

+ suspensi bakteri 106 _CFU/ml

Tabung kontrol

K1 : Kontrol media K2 : Kontrol pelarut K3 : Kontrol sampel K4 : Kontrol suspensi bakteri

Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C

Diamati kejernihan dalam tabung uji (Menentukan KHM) Digores ke media padat

Agar darah (Staphylococcus aureus) atau Agar Mc.Conkey ( Escherichia coli)

Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C

No Tabung Perlakuan % b/v (kadar akhir) HASIL PENGAMATAN Kejernihan Koloni

1. 0,6125% K +

2. 1,25% J

-3. 2,5% J

-4. 5 % J

-5. K

-6. K

-7. K.I J

-8. K.II J

-9. K.III K

-10. K.IV K +

Contoh Hasil Uji Aktivitas

Keterangan :

KK = Kekeruhan + = Ada koloni bakteri J = Jernih - = Tidak ada koloni bakteri K = Keruh

Kadar akhir = kadar ekstrak awal dibagi 2 Jadi, KHM = 1,25% b/v

KBM = 1,25% b/v

Kontrol (data dan gambar belum ditampilkan) K.I (Kontrol media)

K.II (Kontrol pelarut) K.III (Kontrol sampel) K.IV (Kontrol bakteri)

1 2 3 4

1 2 3 4 KHM KBM

8 4 2 1 0

Tetracycline (μg/ml)

MIC = 2 μg/ml

Determination of MIC

1 2 3 4 K1 K2 K3 K4

Petri uji

suspensi bakteri 106 _CFU/ml

Dg cara spread plate

Petri kontrol

K1 : Kontrol media K2 : Kontrol pelarut K3 : Kontrol sampel K4 : Kontrol suspensi bakteri

Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C

Diamati tumbuh tidaknya koloni bakteri di atas media agar (Menentukan KHM/KBM)

Metode Dilusi Padat

No No growth growth

Kirby

Kirby--Bauer

Bauer

Susceptible

Susceptible Not susceptibleNot susceptible

Bacterial Bacterial lawnlawn

Growth Growth

Antibiotic disk Antibiotic disk

Chl Amp Ery Str

Tet

Disk Diffusion Test

Size of zone of inhibition depends on

sensitivity, solubility, rate of diffusion. Compare

results to MIC tables generated using

standards.

Disk Diffusion

Zone Diameter Standards for Disk Diffusion

Tests

Antimicrobial Agent (amt.per disk) and organism

Zone Diameter (mm) Approx.MIC (g/L) for

R I MS S R S

Ampisilin (10 g/disk)

Enterobacteriaciae <11 12-13 >14 >32 <8

Harmophillus <19 >20 >4 <2

Enterococci <16 >17 >16

Measuring Antimicrobial

Sensitivity

• MIC: Minimal inhibitory concentration

E-Test method

Ekstraksi Komponen Bioaktif Kulit Buah Manggis dan Pengujian Aktivitas Antibakterinya

• Bahan : kulit buah manggis matang dari pasar

• Perlakuan terhadap kulit buah manggis :

Pencucian dengan air bersih

Dikeringanginkan

Dikeringkan pada pengering vakum suhu 50o_{C tekanan 62 cm Hg, 4}

jam

Penghancuran dengan blender  bubuk kulit biah manggis

• Kultur mikroba uji : Leuconostoc mesenteroides dan Lactobacillus plantarum  penyebab kerusakan nira

Kultur ditumbuhkan pada media MRS broth, suhu 30o_{C, 24 jam}

Diatur densitasnya dengan aquades hingga mencapai OD = 0.1 pada panjang gelombang 625 nm

Ekstraksi Komponen Bioaktif Kulit Buah Manggis dan Pengujian Aktivitas Antibakterinya (1)

• Ekstraksi :

 20 g bubuk kulit manggis kering diekstrak dengan 100 ml metanol dengan metode maserasi disertai pengadukan dengan magnetic stirer pada suhu kamar selama 3 jam.

 Campuran disaring berturut-turut dengan kertas whatman no.4 dan no.1  Filtrat I

 Residu diekstrak kembali dengan 100 ml etanol  Filtrat II

 Filtrat I dan II dicampur dan dikeringkan dengan rotary vacuum evaporator suhu 45o_C

 Ekstrak kering yang diperoleh dilarutkan kembali dengan metanol 

ekstrak metanol kulit buah manggis 5% (50g/L)

Ekstraksi Komponen Bioaktif Kulit Buah Manggis dan Pengujian Aktivitas Antibakterinya (2)

• Fraksinasi :

Menggunakan metode partisi

20 ml ekstrak metanol kulit buah manggis dikeringkan dengan rotary vacuum evaporator suhu 45o_C

Disuspensikan dengan aquades sampai volumenya 100 ml Suspensi ekstrak dipartisi berturut-turut dengan heksana, kloroform, etil asetat dan n-butanol  fraksi dari masing2 pelarut dikeringkan dengan rotary vacuum evaporator pada suhu 45o_C

Ekstraksi Komponen Bioaktif Kulit Buah Manggis dan Pengujian Aktivitas Antibakterinya (3)

• Pengujian Aktivitas Antimikroba: Menggunakan uji difusi cakram

20 L esktrak diteteskan apda cakram kertas saring  dikeringkan pada laminar flow selama 60 menit Cakram yang mengandung ekstrak ditempelkan pada

media agar yang telah diinokulasi dengan suspensi mikroba 250L/cawan.

Media diinkubasikan pada suhu 30o_{C selama 24 jam}

Kontrol : cakram kertas saring yang ditetesi 20 L pelarut. Pengamatan : zona bening di sekitar cakram (mm)  zona

penghambatan

Ekstraksi Komponen Bioaktif Kulit Buah Manggis dan Pengujian Aktivitas Antibakterinya (4)

• Analisis GC-MS

Dilakukan terhadap fraksi ekstrak yang positif menunjukkan aktivitas antimikroba

Gas pembawa : helium dengan laju aliran 30 ml/menit. Suhu GC : suhu injektor 300o_{C, suhu awal oven 100}o_C

dengan laju kenaikan suhu 10o_{C/menit, suhu akhir oven}

300o_C

Identifikasi Senyawa Ekstrak Kloroform

Penentuan Glisemik Indeks Pangan (Miller, 1996)

• Pangan tunggal yang akan ditentukan GI-nya (yang mengandung 50 gram karbohidrat) diberikan kepada relawan yang telah menjalani puasa penuh (kecuali air). Sebagai contoh, untuk menentukan GI kentang rebus diperlukan 250 gram kentang untuk menyediakan karbohidrat sebanyak 50 gram (setara dengan 3 sendok makan bubuk glukosa murni).

• Selama dua jam pasca pemberian (atau tiga jam apabila relawan menderita diabetes), sampel darah diambil untuk setiap 15 menit pada jam pertama kemudian setiap 30 menit pada jam kedua untuk diukur kadar glukosanya.

• Pada waktu yang berlainan hal yang sama dilakukan dengan memberikan 50 gram glukosa murni (sebagai pangan acuan) kepada relawan. Hal ini dilakukan sebanyak 2 kali untuk mengurangi efek ragam hari-ke-hari respon gula darah.

• Kadar gula darah (pada setiap waktu pengambilan sampel) ditebarkan pada dua sumbu, yaitu sumbu waktu dan kadar glukosa darah.

Kategori Pangan menurut Rentang Indeks Glisemik

Perhitungan GI Makanan Campuran

Pengujian Efek Hipoglikemik (Antidiabetes)

• Pengujian Secara In vivo (menggunakan hewan percobaan)

24 ekor tikus wistar dimasukkan ke dalam kandang kolektif dengan suhu ruang 20-25o_C

Tikus diberi pakan dan minum secara ad libitum

Tikus diadaptasikan selama 1 minggu sebelum perlakuan

Berat badan tikus ditimbang setiap 3 hari sekali

Kadar gula darah diukur setiap minggu

Tikus dibagi menjadi kelompok perlakuan dan 1 kelompok kontrol

Induksi aloksan (untuk menginduksi tikus menjadi hiperglikemia) dilakukan 3 hari sebelum diberi perlakuan, kemudian kadar gula darahnya diukur  memastikan bahwa tikus sudah hiperglikemik. Tikus yang digunakan adalah tikus dengan kadar gula darah >126 mg/dl

Masing-masing kelompok diberi ransum standard, tetapi pada kelompok perlakuan diberi tambahan makanan berupa perlakuan yang ingin diuji.

Uji Aktivitas Antidiabetes Secara In Vitro

Dengan Uji aktivitas -Glukosidase

 Pembuatan Kurva Standar 4-nitrofenol

 Menggunakan 6 deret standar (15,30,45,60,75 dan 90 M), dengan cara melarutkan 4-nitrofenol dalam larutan buffer fosfat pH 7. Blanko = buffer fosfat pH 7. Diukur absorbansinya pada 400 nm

 Uji inhibisi -Glukosidase

 Menggunakan substrat p-nitrofenil--Dglukopiranosida (p-NPG) dan enzim -Glukosidase.

 Larutan enzim dibuat dengan melarutkan 1.0 mg enzim  -Glukosidase dalam larutan buffer fosfat (pH 7) yang mengandung serum bovin albumin, kemudian diencerkan 25 kali dengan puffer fosfat pH 7.

 Ekstrak sampel dilarutkan dalam DMSO.

 Penghentian reaksi enzim substrat dilakukan dengan penambahan Na2CO3 200 mM. Larutan diukur absorbansinya pada panjang

gelombang 400 nm.

Uji Aktivitas Antikanker

Preparasi kultur sel mieloma mencit

• Sel mieloma mencit di thawing setelah dibekukan pada suhu -80°C. Hasil thawing diinisiasi pada inkubator 5% CO2 pada

suhu 37 °C dan pH 7,4 -7,7 di dalam media RPMI 1640 dan FBS 10%, 100µg/ml streptomisin, 100 unit/ml penisilin. Bila kepadatan sel hasil inisiasi telah mencapai 105_{– 2.10}6 _maka

suspensi sel tersebut dapat digunakan lebih lanjut untuk uji antikanker dan induksi apoptosis.

Pengamatan aktivitas antikanker dengan metode viabilitas sel dengan pewarnaan tripan biru.

• Sebanyak 0,2 mL dari masing -masing larutan baku kerja dengan konsentrasi 1 25, 250, 500, 750, 1000 µg/mL, kontrol positif dan kontrol negatif dimasukkan ke dalam sumuran microplate. Tiap konsentrasi

dilakukan 3 pengulangan (3 lubang sumuran).

• Setelah itu, ke dalam masing -masing lubang sumuran di tambahkan suspensi sel mieloma seb anyak 0,8 ml sehingga didapatkan konsentrasi larutan uji 25, 50,100, 150 , 200 dan 300 µg/ml serta kontrol positif etoposida sebesar 10 µg/ml. Bersama-sama kemudian diinkubasi pada inkubator 5% CO2 selama 24 jam pada suhu 37 °C dan pH 7,4 -7,7. 

dilakukan panen sel dan diamati persentase viabilitasnya menggunakan pewarnaan laru tan tripan biru 0,4% dengan perbandingan susp ensi sel : tripan biru = 1:1 dihitung dengan menggunakan hemositometer, di mana sel mati akan terwarnai biru sedangkan sel hidup akan berwarna jernih.

Pendekatan terbaru studi pencernaan

• Secara In vivo :

Uji pernafasan

Scintigraf

USG

MRI (Magnetic Resonance Imaging)

• Secara in vitro :

Gastrointestinal model (GIM)  static dan dinamyc