BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli 2010 sampai dengan Mei 2011. Koleksi sampel dilakukan pada beberapa lokasi di Jawa Tengah, Daerah Istimewa Yogyakarta (DIY), Jawa Timur, dan Bali. Analisis DNA dan analisis data dilakukan di Bagian Fungsi Hayati dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, FMIPA, Institut Pertanian Bogor.
Objek Penelitian
Objek penelitian yang digunakan yaitu penggerek batang padi kuning S. incertulas yang dikoleksi dari beberapa lokasi pengambilan sampel. Fase perkembangan S. incertulas yang digunakan untuk analisis DNA yaitu fase dewasa. Sampel S. incertulas dikoleksi dengan menggunakan jaring serangga dan secara manual dengan menggunakan bantuan tabung reaksi. Sampel S. incertulas yang diperoleh disimpan di dalam tabung 1.5 ml yang berisi etanol absolut.
Tahapan Analisis DNA S. incertulas
Ekstraksi DNA
Sebelum ekstraksi DNA, sampel S. incertulas yang disimpan di dalam etanol absolut dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml yang berisi 500 µl Tris HCl-EDTA (TE) 0.5 mM (Tris HCl 2 M; HCl-EDTA 0.2 M; air destilata) untuk menggantikan etanol absolut dari jaringan sampel. Metode ekstraksi DNA yang digunakan adalah metode Cetyl Trimetil Ammonium Bromide (CTAB) dan presipitasi alkohol (Sambrook et al. 1989) dengan modifikasi berdasarkan Raffiudin dan Crozier (2007). Sumber DNA yang diekstraksi yaitu jaringan bagian toraks S. incertulas. Bagian toraks S. incertulas dengan bagian tubuh lain (kepala, abdomen, dan tungkai) dipisahkan menggunakan scalpel steril. Kemudian, toraks dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml dan tabung direndam di dalam kotak berisi nitrogen cair (15 menit). Nitrogen cair berfungsi untuk membekukan jaringan, sehingga mempermudah proses penghancuran toraks.
Toraks di dalam tabung digerus menggunakan grinder steril. Selanjutnya, toraks di dalam tabung ditambahkan 300 µl larutan CTAB 0.2 % (b/v) (7.5 ml 1M Tris-HCl pH 8; 3 ml 0.5 M NaEDTA pH 8; 6.135 g NaCl; 1.5 g CTAB; air hingga 75 ml). Proses berikutnya, supernatan ditambahkan 10 µl Proteinase K (5mg/ml). Fungsi Proteinase K yaitu untuk menghancurkan protein. Kemudian, sampel diinkubasi pada suhu 55 oC (2 jam). Setelah inkubasi, campuran disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (10 menit). Supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml baru.
Supernatan yang berisi DNA ditambahkan 300 µl larutan Phenol Chloroform Isoamyl alcohol (PCI) di dalam ruang asam, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (5 menit). Larutan PCI dibagian bawah tabung dibuang, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit). Supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml baru. Selanjutnya, supernatan tersebut ditambahkan kembali 240 µl larutan PCI, putar perlahan lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (3 menit). Larutan PCI dibagian bawah tabung dibuang dan disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit), lalu supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml baru dan disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit) untuk memastikan tidak ada lagi fenol. Tahap berikutnya, supernatan yang berisi DNA ditambahkan 240 µl larutan Chloroform Isoamyl Alcohol (CIAA), lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (3 menit). Kemudian, larutan CIAA di bagian bawah tabung dibuang, sentrifugasi kembali dengan kecepatan 13 000 rpm (1 menit). Supernatan yang berisi DNA di bagian atas tabung dipindahkan ke tabung 1.5 ml baru dan ditambahkan 360 µl isopropanol murni untuk proses presipitasi DNA.
Proses presipitasi DNA dilakukan pada suhu -4 oC (overnight). Selanjutnya, supernatan disentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (30 menit) pada suhu 4 oC, lalu isopropanol dibuang. Endapan DNA ditambahkan 300 µl alkohol 70% (v/v) steril, sentrifugasi dengan kecepatan 13 000 rpm (10 menit). Kemudian, etanol 70% steril dibuang dan endapan DNA dikeringkan dengan cara divakum (30 menit). Endapan DNA yang diperoleh dilarutkan dalam TE 0.5 mM, lalu disimpan pada suhu -4 0C.
Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA hasil ekstraksi dilakukan untuk dua individu S. incertulas dari tiap lokasi pengambilan sampel. Proses amplifikasi menggunakan mesin PCR (ESCO). Amplifikasi fragmen gen COI S. incertulas menggunakan primer forward Mt D4 dan reverse Mt D9 (Simon et al. 1994). Sedangkan amplifikasi fragmen gen COII S. incertulas menggunakan primer forward A-298 dan reverse Bt-LYS (Liu & Beckenbach 1992; Simon et al. 1994) (Tabel 1, Gambar 4). 100 pb A-298 Bt-LYS Mt D4 Mt D9 tRNA-Leu tRNA-Tyr tRNA-Lys 1442 2977 Gen COI 3040 3721 Gen COII
Gambar 4 Posisi primer forward Mt D4 dan primer reverse Mt D9 untuk amplifikasi gen COI S. incertulas serta primer forward A-298 dan primer reverse Bt-LYS untuk amplifikasi gen COII S. incertulas. Tabel 1 Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen COI dan gen COII S.
incertulas dan posisi primer berdasarkan mtDNA O. furnacalis
Primer Sekuen 5’-3’ Posisi primer pada mtDNA O. furnacalis (No. Akses GenBank: NC003368) Gen COI Mt D4 TACAATTTATCGCCTAAACTTCAGCC 1339-1365 Mt D9 CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC 2131-2157 (Simon et al. 1994) Gen COII A-298 ATTGGACATCAATGATATTGA 3337 - 3357 Bt-LYS GTTTAAGAGACCAGTACTTG 3739 - 3758
Total volume pereaksi PCR yang digunakan adalah 20 µl. Pereaksi tersebut terdiri atas 7.4 µl air destilata steril, 0.8 µl primer forward 10 µM, 0.8 µl primer reverse 10 µM, 1 µl DNA cetakan, dan 10 µl 2x Ready Mix (Kapa Taq DNA Polymerase (1 U per 20 µl), bufer Mg2+ 1.5 mM, dan dNTP 0.4 mM). Amplifikasi DNA pada mesin PCR terdiri atas pra-denaturation pada suhu 95 oC (2 menit), denaturation pada suhu 95 oC (1.5 menit), annealing pada suhu 50 oC (1-1.5 menit), elongation pada suhu 72 oC (1 menit), dan elongation akhir pada suhu 72 oC (2 menit). Tahap denaturation, annealing, dan elongation masing-masing 30 siklus.
Elektroforesis dan visualisasi DNA
Hasil amplifikasi DNA S. incertulas dimigrasikan sebanyak 1 µl pada polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6% dengan menggunakan buffer 1x TBE (Tris 0.5 M, Asam Borat 0.65 M, EDTA 0.02 M). Visualisasi DNA menggunakan pewarnaan perak nitrat (Byun et al. 2009).
Sekuen DNA
Sekuen DNA S. incertulas dilakukan pada gen COI dan gen COII mtDNA menggunakan primer yang sama dengan primer yang digunakan pada amplifikasi DNA. Proses sekuen DNA dilakukan untuk dua individu S. incertulas dengan menggunakan jasa pelayanan sekuen. Selanjutnya, hasil sekuen DNA berupa kromatogram di-edit secara manual.
Analisis Data DNA S. incertulas
Database hasil perunutan DNA gen COI dan gen COII S. incertulas disimpan pada program Genetyx Win versi 4.0. Selanjutnya, database sekuen DNA tersebut diedit secara manual dengan menggunakan program Genetyx Win dan program BioEdit Versi 7.0.9.0.
Analisis Homologi DNA S. incertulas
Gen COI
Analisis homologi dilakukan pada sekuen gen COI S. incertulas penelitian ini dengan data GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Analisis homologi tersebut menggunakan program Basic Local Alignment Seacrh Tool-Nucleotide (BLAST-N) dari website National Center for Biotechnology Information (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Sekuen nukleotida gen COI S. incertulas pada penelitian ini di-alignment dengan data sekuen nukleotida gen COI ngengat anggota Crambidae yang diperoleh dari GenBank. Data sekuen nukleotida untuk gen COI S. incertulas yang sudah ada diperoleh dari GenBank (Tabel 2). Analisis homologi sekuen nukleotida gen COI menggunakan program Clustal X (Thompson 1997) dan program MEGA 5 (http://www.megasoftware.net/mega.php).
Gen COII
Sekuen gen COII S. incertulas penelitian ini dilakukan analisis homologi menggunakan program BLAST-N dari situs NCBI. Selanjutnya, sekuen gen COII S. incertulas pada penelitian ini di-alignment terhadap data sekuen gen COII hasil penelitian Raffiudin dan Samudra (2010) (Tabel 3). Analisis alignment mengunakan program Clustal X (Thompson 1997) dan program MEGA 5.
Tabel 2 Database haplotipe gen COI S. incertulas yang ada di GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov)
No Sampel Haplotipe Lokasi No. Akses
Sampel GenBank
1 Lep.12062007 Lep.12062007.H1 Dieng, Wanasaba, Jateng AB495265 2 Lep.20032007 Lep.20032007.H1 Pakembinangun, Sleman, DIY AB495267
3 Lep.16042007 Lep.16042007.H1 Magetan, Jatim AB495268
4 Lep.23032006 Lep.23032006.H1 Karangmangu, Baturaden, Jateng AB495272
5 Lep.10062005 Lep.10062005.H1 Garut, Jabar AB495273
6 Lep.10042007 Lep.10042007.H2 Baluran National Park, Jatim AB495269 7 Lep.13042007 Lep.13042007.H3 Alas Purwo National Park, Jatim AB495270
8 Lep.20052006 Lep.20052006.H4 Ciamis, Jabar AB495271
9 Lep.10022006 Lep.10022006.H5 Wates, Kulon Progo, DIY AB495266 10 Lep.28052006 Lep.28052006.H6 Halimun-Salak National Park, Jabar AB495274 Keterangan:
H = Haplotipe; Jabar = Jawa Barat; Jateng = Jawa Tengah; DIY = Daerah Istimewa Yogyakarta; Jatim = Jawa Timur
Analisis Homologi Asam Amino Putataive S. incertulas
Sekuen nukleotida gen COI dan gen COII S. incertulas penelitian ini masing-masing ditranslasi ke dalam asam amino dengan mengunakan program Genetyx Win versi 4.0. Tahap berikutnya, sekuen asam amino putative gen COI dan gen COII S. incertulas penelitian ini dilakukan analisis homologi dengan data GenBank. Analisis homologi tersebut menggunakan program Basic Local Alignment Search Tool-Protein (BLAST-P) dari situs NCBI. Selanjutnya, sekuen asam amino putative di-alignment terhadap individu S. incertulas untuk masing-masing gen COI dengan gen COII.
Analisis Jarak Genetik
Analisis jarak genetik dilakukan antara gen COI S. incertulas dan S. innotata (Si; No. Akses GenBank: AB495264). Sedangkan, analisis jarak genetik gen COII S. incertulas dilakukan antara S. excerptalis asal Papua Nugini dan India (Se.PNG dan Se.India; berturut-turut No. Akses GenBank: AY320508 dan AY320507). Proses analisis jarak gen COI dan COII S. incertulas menggunakan program MEGA 5.
Tabel 3 Database haplotipe gen COII S. incertulas berdasarkan penelitian Raffiudin dan Samudra (2010)
No Sampel Haplotipe Lokasi Titik Koordinat Sampel
1 Sc7Bg Sc7Bg.H1 Bogor, Jabar L: -6,872
2 Sc9Bg Sc9Bg H1 Bogor, Jabar A: 109,359
3 Sc22Kr Sc22Kr.H1 Karawang, Jabar L: -6,256 A: 107,322 4 Sc8Id Sc8Id.H1 Indramayu, , Jabar L: - 5 Sc10Id Sc10Id.H1 Indramayu, Jabar A: -
6 Sc11Bg Sc11Bg.H2 Bogor, Jabar L: -6,872
A: 109,359
7 Sc24Kr Sc24Kr.H3 Karawang, Jabar L: -
8 Sc1Cb Sc1Cb.H4 Cirebon, Jabar A: -
Keterangan:
H = Haplotipe; Bg = Bogor; Kr = Karawang; Id = Indramayu; Cb = Cirebon L= Latitude, A= Altitude; = tidak ada data latitude dan altitude
Analisis Filogeni
Konstruksi pohon filogeni dilakukan antar gen COI S. incertulas (ingroup) dan spesies ngengat lain kelompok Crambidae (outgroup) yaitu S. innotata, C. suppressalis, dan O. furnacalis (Tabel 4). Pada gen COII, konstruksi pohon filogeni dilakukan antar S. incertulas (ingroup) spesies ngengat lain kelompok Crambidae (outgroup) yaitu S. excerptalis, C. suppressalis, dan O. furnacalis (Tabel 5). Proses analisis filogeni tersebut menggunakan metode Neighbor Joining (NJ) dengan bootstrap 1000x pada program MEGA 5.
Tabel 4 Database gen COI Crambidae (outgroup) yang diperoleh dari GenBank untuk analisis filogeni pada penelitian ini
No Spesies Lokasi No. Akses GenBank Sampel
1 S. innotata Indonesia AB495264 Si.AB495264
2 C. suppressalis Cina EU362114 Cs.H1.EU362114
Cina EU362115 Cs.H2.EU362115
3 O. furnacalis Cina NC003368 Of.NC003368
Tabel 5 Database gen COII Crambidae (outgroup) yang diperoleh dari GenBank untuk analisis filogeni pada penelitian ini
No Spesies Lokasi No. Akses GenBank Sampel
1 S. excerptalis India AY320507 Se.India.AY320507
Papua Nugini AY320508 Se.PNG.AY320508
2 C. suppressalis Cina EU362116 Cs.H1.EU362116
Cina EU362117 Cs.H2.EU362117
