171
ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIBAKTERI
JAMUR ENDOFIT DARI DAUN DAN RIMPANG
Zingiber ottensii Val.
Noverita, Dinah Fitria, Ernawati Sinaga Fakultas Biologi Universitas Nasional
Korespondensi: Prof. Dr. Ernawati Sinaga, MS, Apt.
Fakultas Biologi Universitas Nasional, Jalan Sawo Manila, Pejaten, Pasar Minggu, Jakarta Selatan
ersinaga2003@yahoo.com.sg
ABSTRACT
Endophytic fungi is cluster of fungi lives in the plant tissues for a few time or entire of its life. This kind of fungi usually produces secondary metabolites which have significant bioactivity, such as anti cancer, anti virus, or antibacterial agents. Endophytic fungi can be isolated from many kinds of plants, especially medicinal plant such as Zingiber ottensii Val. (Ghost Bangle), which is abundant in Indonesia. The objective of this research is to isolate endophytic fungi from leaves and rhizomes of Zingiber ottensii Val. and investigate its antibacterial activity towards Escherichia coli and Staphylococcus aureus. From the experiments we could obtain 10 endophytic fungi isolates from leaves and rhizomes of Zingiber ottensii Val., and experiments showed that all of the endophitic fungi have significant antibacterial activity towards Escherichia coli and Staphylococcus aureus.
Keywords: antibacterial, endophytic, fungi, Zingiber ottensii
ABSTRAK
Jamur endofit merupakan sekelompok jamur yang sebagian atau seluruh hidupnya berada dalam jaringan tumbuhan hidup dan biasanya tidak merugikan pada inangnya. Jamur-jamur endofit umumnya memproduksi metabolit sekunder yang memiliki aktivitas biologis yang bermanfaat seperti misalnya senyawa-senyawa anti kanker, anti virus, atau antibakteri. Jamur endofit dapat ditemukan pada berbagai jenis tumbuhan, terutama pada tumbuhan obat, seperti misalnya Zingiber ottensii Val. (Bangle hantu), salah satu tumbuhan obat yang banyak terdapat di Indonesia. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh isolat jamur endofit dari daun dan rimpang Zingiber ottensii Val., serta menguji aktivitas antibakteri dari isolat jamur yang diperoleh terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Dari penelitian yang dilakukan diperoleh 10 isolat jamur endofit dari daun dan rimpang Zingiber ottensi Val. Kesepuluh isolat jamur endofit tersebut memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan kedua jenis bakteri uji, dengan kekuatan yang berbeda-beda. Kata kunci : anti-bakteri, jamur, endofit, bangle hantu, Zingiber ottensii Val.
PENDAHULUAN
Jamur endofit merupakan
mikroorganisme yang terdapat di dalam suatu sistem jaringan tumbuhan seperti
biji, daun, bunga, ranting, batang dan akar. Berbagai senyawa fungsional dapat dihasilkan oleh jamur endofit. Senyawa yang dihasilkan jamur endofit tersebut dapat berupa senyawa anti
172
kanker, antivirus, antibakteri, antifungi,
hormon pertumbuhan tanaman,
insektisida dan lain-lain (1).
Penelitian terhadap aktivitas suatu
senyawa baik sebagai antibakteri
maupun antijamur merupakan suatu
langkah awal untuk mengetahui
kegunaan senyawa tersebut. Adanya senyawa aktif antibakteri dan antifungi
dibidang kesehatan merupakan
informasi penting untuk
penanggulangan suatu penyakit yang disebabkan oleh bakteri atau jamur (2). Selain itu, pencarian jamur endofit yang
banyak terdapat pada tumbuhan
dilakukan untuk menambah atau
memperkaya koleksi mikroba.
Selanjutnya mikroba tersebut perlu diidentifikasi untuk mengetahui sifat pertumbuhan dan jenisnya, sehingga lebih lanjut dapat dimanfaatkan di
bidang kesehatan. Mengingat
kebutuhan bahan baku obat yang
semakin meningkat baik jumlah
maupun macamnya maka potensi
sumber daya alam Indonesia
khususnya jamur endofit perlu digali dan dikembangkan.
Berbagai jenis tanaman terutama
tanaman obat, dapat digunakan
sebagai sumber isolat jamur endofit. Tumbuhan yang banyak digunakan oleh masyarakat sebagai bahan baku obat-obatan tradisional antara lain dari suku Zingiberaceae. Salah satu jenis yang banyak digunakan adalah Bangle
hantu (Zingiber ottensii Val.).
Tumbuhan tersebut memiliki
kandungan senyawa utama yang
dikenal dengan minyak atsiri dan memiliki aktivitas sebagai antimikroba yang berspektrum luas. Tanaman tersebut biasanya digunakan sebagai analgetik, obat demam (antipiretik), obat batuk, antikonvulsan (obat kejang) terutama anak-anak, dan obat untuk ibu setelah melahirkan (3).
Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini merupakan flora normal dalam tubuh manusia, tetapi pada keadaan tertentu dapat berpotensi
membahayakan dan menjadi patogen. Bakteri ujinya adalah Escherichia coli
dan Staphylococcus aureus yang
menyebabkan penyakit yang berkaitan dengan eksotoksin dan produksi enzim yang dihasilkan (4). Bakteri Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif
berbentuk batang yang tidak
membentuk spora dan merupakan flora normal di usus dan sebagai penyebab
penyakit diare, sedangkan
Staphylococcus aureus merupakan
bakteri Gram positif (5).
Berdasarkan latar belakang dan permasalahan di atas, maka penelitian ini dilakukan dengan tujuan :
1. Memperoleh isolat jamur endofit dari tanaman Zingiber ottensii Val. 2. Menguji aktivitas antibakteri dari
isolat jamur endofit hasil isolasi
terhadap pertumbuhan bakteri
Escherichia coli dan
Staphylococcus aureus. METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di
Laboratorium Mikrobiologi dan
Genetika Fakultas Biologi Universitas Nasional, Jl. Harsono RM, Ragunan, Jakarta Selatan, pada bulan Mei hingga Juli 2008.
Alat
Alat yang digunakan dalam
penelitian ini antara lain: oven (WTB Binder), autoklaf (Delixi), laminar air flow, rotary shaker (Model VRN-210),
refrigerator, inkubator (Memmert),
sentrifus (Hittech), tabung sentrifuse, timbangan digital, kompor listrik, pH universal, gelas piala, labu Erlenmeyer (Pyrex), cawan Petri (Pyrex), tabung reaksi, rak tabung, pembakar Bunsen, gelas ukur, kain saring, kertas saring, plastik pembungkus, aluminium foil, swab, pipet volumetrik, pinset, spatula, gunting, pisau, koran, plastik, core borer (pembolong gabus), vortex mixer,
173 kapas, kertas label, bulb, spidol, scalpel,
ose, dan penggaris.
Isolasi Jamur Endofit: Isolasi jamur
endofit dilakukan dengan metode
tanam langsung, yaitu setelah
perendaman terakhir menggunakan
etanol 70% selama 1 menit.
Selanjutnya, potongan sampel
dikeringkan di atas kertas saring steril
selama beberapa menit. Masing–
masing potongan sampel kemudian diletakkan di atas media MEA (Malt Extract Agar) yang telah ditambahkan serbuk tanaman inang dengan posisi permukaan belahan menempel pada agar médium. Sampel diletakkan di atas médium dengan diberi tekanan, dan bagian potongan berada di atas medium. Inokulasi sampel dilakukan di atas cawan petri dan dilakukan duplo, tiap cawan berisi 4 potongan sampel. Selama pekerjaan dilakukan di dalam laminar air flow, dan kemudian inkubasi selama 2-14 hari hari pada suhu
27-29oC (suhu ruang). Isolat endofit yang
menunjukkan sifat morfologi jamur dipindahkan ke media MEA .
Pemurnian Jamur Endofit: Jamur
endofit yang telah tumbuh pada media isolasi MEA, kemudian secara bertahap dimurnikan satu persatu. Masing-masing isolat murni jamur endofit yang diperoleh, kemudian dipindahkan ke dalam media dalam MEA cawan Petri.
Pemurnian ini bertujuan untuk
memisahkan koloni endofit dengan morfologi berbeda untuk dijadikan isolat tersendiri. Pengamatan morfologi dilakukan kembali setelah inkubasi selama 5-7 hari, dan apabila masih ditemukan pertumbuhan koloni yang berbeda secara makroskopik maka
harus dipisahkan kembali sampai
diperoleh isolat murni. Jamur endofit diinkubasi pada suhu kamar selama 3-5 hari sesuai dengan pertumbuhannya. Setiap isolat murni dibuat duplo pada agar miring. Masing-masing sebagai kultur stok dan kultur untuk penelitian.
Fermentasi Jamur Endofit: Fermentasi
jamur endofit dilakukan dengan
fermentasi cair menggunakan media PDY (Potato Dextrose Yeast) (6). Koloni murni jamur endofit pada cawan petri MEA yang telah diinkubasi selama
5-7 hari, kemudian dengan
menggunakan core borer diambil 3 potongan biakan jamur berukuran ± 1 x 1 cm. Potongan jamur tersebut kemudian diinokulasikan ke dalam media fermentasi cair PDY sebanyak 20 mL dalam labu Erlenmeyer ukuran
100 mL. Selanjutnya dilakukan
fermentasi goyang menggunakan
rotary shaker 130 rpm (kocokan/menit) pada suhu kamar selama 14 hari. Dari
masing-masing kultur yang telah
difermentasi dimasukkan ke dalam tabung sentrifus ukuran 15 mL yang sebelumnya telah disterilisasi terlebih
dahulu, kemudian di sentrifugasi
dengan kecepatan 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan diambil dan
kemudian disaring menggunakan
kertas saring. Supernatan ini kemudian digunakan untuk uji aktivitas antibakteri sebagai larutan uji berupa supernatan suspensi koloni endofit.
Persiapan Bakteri Uji: Sebanyak satu ose koloni bakteri uji diinokulasikan dalam larutan NaCl fisiologis 0,9% sebanyak 5 mL. Kekeruhannya diseragamkan dengan menggunakan standar McFarland 0,5 (kepadatan
bakteri 1,5 x 108) pada latar belakang
hitam dan cahaya terang. Standar kekeruhan McFarland dibuat dengan
cara 0,5 mL larutan BaCl2 1% ditambah
dengan 9,5 mL H2SO4 1%
Teknik inokulasi bakteri yang
dilakukan dalam penelitian ini adalah menggunakan swab steril. Swab steril dicelupkan ke dalam campuran bakteri uji dengan NaCl fisiologis 0,9%, kemudian ditiriskan dengan cara ujung swab ditekan dan diputar pada dinding
dalam tabung untuk membuang
kelebihan cairan. Selanjutnya swab tersebut dioleskan ke permukaan agar
174
sebanyak dua kali yaitu secara
horizontal dan vertikal agar
pertumbuhan bakteri merata.
Pengujian aktivitas antibakteri:
Pengujian aktivitas antibakteri
dilakukan dengan metode Kirby-Bauer yang dikenal dengan sebutan metode cakram kertas (7). Tiap-tiap cakram kertas kosong sebelumnya dipanaskan
dalam oven pada suhu 70oC selama 15
menit, kemudian kertas cakram
dicelupkan ke dalam larutan uji. Cakram yang telah berisi supernatan, kemudian didiamkan selama 15 menit sebelum diletakkan pada media uji. Kemudian secara aseptik, setelah kertas cakram menyerap supernatan
tersebut, masing-masing diletakkan
pada permukaan medium yang telah berisi mikroba uji. Jumlah cakram kertas yang diletakkan tersebut kira-kira dalam satu cawan Petri berisi 6-7 buah, dan masing-masing jarak antara cakram diatur supaya tidak terlalu dekat.
Sebagai kontrol positif digunakan cakram Ampisilin 10 µg dan untuk
kontrol negatif digunakan cakram
kosong steril. Pengujian dilakukan dengan tiga ulangan. Setelah inkubasi
pada suhu 370C selama 18-24 jam,
dilakukan pengukuran diameter zona hambat, yaitu zona bening yang terbentuk di sekitar cakram, dengan menggunakan penggaris milimeter. HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolat Jamur Endofit dari Zingiber ottensii (Bangle hantu)
Jumlah total isolat jamur endofit yang diperoleh dari daun dan rimpang
tanaman Zingiber ottensii (bangle
hantu) adalah 10 isolat dengan rincian 8 isolat dari daun dan 2 isolat dari rimpang . Dilihat dari angka tersebut, ternyata jumlah isolat yang diperoleh
dari bagian daun lebih banyak
dibandingkan dari rimpang. Hal ini diduga karena sumber nutrisi yang
terdapat di bagian daun lebih
mendukung keberadaan jamur endofit. Jamur endofit yang dihasilkan dari ttumbuhan inang dapat menghasilkan jenis isolat yang berbeda-beda dan
jumlah bervariasi. Sesuai dengan
pernyataan Wahyudi (8), isolasi jamur endofit dari bagian tanaman yang berbeda dari satu tumbuhan inang, ternyata mengandung jenis isolat yang berbeda pula. Hal ini merupakan
mekanisme adaptasi dari endofit
terhadap mikroekologi dan kondisi fisiologis yang spesifik dari masing-masing tumbuhan inang. Bahkan dari satu jaringan hidup suatu tumbuhan dapat diisolasi lebih dari 1 jenis jamur endofit. Selanjutnya menurut Petrini dkk. (9), bahwa kehadiran jenis endofit
dihubungkan dengan kondisi
mikrohabitat tanaman inang dan
kecocokan genotip antara tanaman inang dan endofit, sehingga akan
berpengaruh terhadap perbedaan
dalam komposisi koloni endofit dan tingkat infeksi tanaman inang yang di tempati oleh jamur endofit pada lokasi yang sama.
Perolehan isolat jamur endofit hasil
isolasi selanjutnya dilakukan
pengamatan secara makroskopis dan
mikroskopis. Masing-masing isolat
memiliki cirri khas morfologi yang berbeda (Gambar 1).
Gambar 1. Koloni beberapa isolat endofit dari Zingiber ottensii
175 Aktivitas antibakteri isolat jamur
endofit
Hasil pengujian daya antibakteri 10 isolat jamur endofit yang diisolasi dari tanaman Zingiber ottensii terhadap pertumbuhan koloni bakteri Escherichia
coli dan Staphylococcus aureus
ditampilkan pada tabel 1 berikut ini. Tabel 1. Diameter zona hambat isolat
jamur endofit terhadap bakteri uji
No Kode
Isolat
Zona hambat rata-rata (mm)
E.a coli S. aureus
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 R1 R2 Ampisilin Kontrol 17 17 18 19 17 15 17 18 18 16 16 6 19 19 19 18 17 16 18 18 15 17 12 6
Rata-rata zona hambat yang
dihasilkan masing-masing isolat endofit hasil isolasi dari tanaman Zingiber ottensii (bangle hantu) terhadap kedua bakteri uji (tabel 1) memperlihatkan hasil yang berbeda-beda. Kisaran
zona hambat yang dihasilkan
kesepuluh isolat endofit tersebut adalah 15 mm sampai dengan 19 mm. Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada diagram batang gambar 2.
Berdasarkan gambar 2 terlihat
bahwa ke sepuluh isolat jamur endofit hasil isolasi dari tanaman Zingiber ottensii (bangle hantu) memiliki daya hambat berbeda-beda terhadap kedua bakteri uji, tetapi hampir seluruhnya lebih kuat dibandingkan dengan kontrol positif. Isolat yang memiliki rata-rata
zona hambat tertinggi terhadap
pertumbuhan E. coli adalah isolat D4 sebesar 19 mm, sedangkan yang
memiliki daya hambat tertinggi
terhadap pertumbuhan S. aureus
adalah isolat D1, D2 dan D3 dengan zona hambat masing-masing sebesar 19 mm.
Gambar 2. Zona hambat rata-rata (mm) isolat jamur endofit terhadap kedua bakteri uji
Ket: biru = E. coli dan merah = S. aureus
Bila dibandingkan kemampuan
menghambat pertumbuhan kedua
bakteri uji antara isolat jamur endofit hasil isolasi dengan kontrol positif, yaitu cakram antibiotik ampisilin 10 ug, terlihat bahwa hampir semua isolat endofit hasil isolasi ini lebih efektif dalam menghambat kedua jenis bakteri
uji dibandingkan dengan cakram
antibiotik ampisilin 10 ug yang
digunakan. Hal ini terbukti dari
besarnya zona hambat yang dihasil oleh isolat-isolat jamur endofit ini yang melebihi kemampuan cakram ampisilin
10 ug dalam menghambat
pertumbuhan kedua bakteri uji.
Melihat kemampuan kesepuluh
isolat endofit ini yang mampu
menghambat kedua jenis bakteri uji yang mewakili bakteri Gram positif (S.aureus) dan bakteri Gram negatif
(E.coli), maka dapat disimpulkan
bahwa isolat-isolat jamur endofit hasil isolasi ini memiliki daya antibakteri yang signifikan dan tampaknya bersifat broad spectrum. Data ini dapat
176
dijadikan sebagai acuan dalam
mendapatkan senyawa antibiotik baru. KESIMPULAN DAN SARAN
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan dapat diambil kesimpulan sebagai berikut :
1. Dari daun dan rimpang Zingiber
ottensii (bangle hantu) dapat
diperoleh 10 isolat jamur endofit.
2. Kesepuluh isolat jamur endofit
tersebut memiliki sifat antibakteri
yang cukup kuat terhadap
Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.
3. Daya antibakteri isolat jamur endofit yang dihasilkan berbeda-beda. Yang paling tinggi daya antibakterinya terhadap E. coli adalah isolat D4 yang diperoleh dari daun, dan yang paling tinggi daya antibakterinya terhadap S. aureus adalah isolat D1, D2, dan D3.
Dari hasil penelitian perlu diajukan beberapa saran sebagai berikut:
1. Diperlukan penelitian lebih lanjut untuk identifikasi jenis dan senyawa kimia antimikroba yang terdapat di dalam isolat jamur endofit hasil isolasi dari tanaman Zingiber ottensii (bangle hantu), terutama untuk isolat yang mempunyai aktivitas antibakteri terbaik.
2. Perlu dilakukan uji antibakteri
lanjutan menggunakan jenis-jenis bakteri patogen lainnya, agar dapat
diperoleh data antibakteri yang memadai dari hasil fermentasi jamur
endofit yang diperoleh, untuk
nantinya dapat dikembangkan
sebagai bahan obat antibakteri . DAFTAR PUSTAKA
1. Strobel GA. Natural products from endophytic microorganism. Journal of Natural Products 2004 ; 67:257-268. 2. Ganjar I, Syamsurizal W, Wutari A.
Mikologi Dasar dan Terapan. Yayasan Obor Indonesia, Jakarta, 2006.
3. Sinaga E, Rahayu SE, Wahyuningsih E dan Matondang I. Katalog tumbuhan obat di Indonesia: Zingiberaceae. Universitas Nasional Press, 2000. 4. Volk WA dan Wheeler MF. Mikrobiologi
Dasar. Jilid 1, edisi 5. Erlangga. Jakarta, 1993.
5. Budiyanto AK. Mikrobiologi Terapan. Universitas Muhammadiyah Malang, 2002.
6. Kumala S, Mangunwardoyo W, dan Budiarti P. Fermentasi diam dan goyang isolat kapang endofit dari Brucea javanica L. Merr. dan uji aktivitas antimikroba. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia 2005;.3(2): 60-63.
7. Lay BW. Analisis mikroba di laboratorium. Grasindo Persada, Jakarta, 1994.
8. Wahyudi P. Mikroba endofitik: simbion dalam jaringan tanaman. Lingkungan Manajemen Ilmiah 2001; 3(2): 45-50. 9. Petrini O, Sieber TN, Toti L, dan Viret
O. Ecology metabolite production and substrate utilization in endophytic fungi. Natural Toxins 1992. 1:185-196.
