7
3 METODE
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilangsungkan pada bulan Maret sampai dengan Agustus 2012. Tempat penelitian dilangsungkan pada Peternakan Sapi Tapos, Laboratorium Kandang – Fakultas Peternakan IPB, Laboratorium Mikrobiologi – Fakultas Kedokteran Hewan IPB dan Laboratorium Center for Hazard Chemical Studies (CHCS) – Bogor.
3.2 Persiapan dan Evaluasi Jus Silase 3.2.1 Fermentasi Silase dan Produksi Jus Silase
Fermentasi silase dalam penelitian ini dilakukan dengan tanpa perlakuan pelayuan dan penambahan bahan additive. Bahan silase yang digunakan berasal dari jagung muda ditandai dengan warna biji yang belum kuning. Seluruh jagung yang terdiri atas batang, daun dan biji dipanen pada pagi hari (pukul 09.00 WIB) dan dipotong membentuk ukuran 1-2 cm dengan menggunakan chopper. Bahan kemudian diaduk hingga merata dan dimasukkan kedalam kantong plastik setebal 0,35 mm dan dilapis double. Kantong plastik kemudian divakum untuk mengurangi kandungan udara dalam kantong plastik dan diikat kencang dengan karet pengikat. Kantong plastik yang telah terikat kemudian dimasukkan kedalam tong-tong penampung dan ditutup rapat. Tong-tong penampung kemudian didiamkan selama tujuh puluh hari dalam suhu ruang penyimpanan 25-28 oC untuk melangsungkan fermentasi silase (ensilase). Jus silase dalam penelitian ini diperoleh dengan mengepress kemasan plastik dengan menggunakan pressan hidrolik . Sampel yang digunakan sebanyak sepuluh kemasan yang diambil secara acak dalam tong-tong penampung.
3.2.2 Perhitungan Jumlah Koloni Bakteri Asam Laktat Jus Silase
Penghitungan jumlah koloni bakteri asam laktat (BAL) jus dilakukan dengan menggunakan metode total plate count (Edwards 2006). Sebanyak 1 ml sampel jus silase dipipet kedalam 9 ml buffered peptone water (BPW) (setara dengan 101) dan kemudian divortex. Pengenceran dilakukan hingga pengenceran 1010 dan divortex. Sebanyak 1 ml dari masing-masing pengenceran kemudian dipipet kedalam cawan petri. Sebanyak 18-20ml De Man Rogosa Sharpe (MRS) agar yang telah dicairkan pada suhu 45±1 oC ditambahkan kedalam cawan. Campuran kemudian diratakan dengan menggerakkan cawan membentuk angka delapan pada bidang yang datar. Cawan kemudian diinkubasi dalam inkubator dengan posisi cawan terbalik selama 18-24 jam pada suhu 36±1 oC. Setelah masa inkubasi cawan kemudian dikeluarkan dan dilakukan pencatatan pertumbuhan koloni BAL.
3.2.3 Pengukuran pH dan Kandungan Asam-asam organik Jus Silase
Nilai pH sampel jus diukur dengan menggunakan pH meter (sensIONTM). Alat pH meter digital yang digunakan terlebih dahulu dikalibrasi dengan
8
membandingkan larutan standar dan kemudian dilakukan pengukuran pada setiap sampel uji.
Kandungan asam-asam organik jus silase jagung yang diukur dalam penelitian ini adalah asam laktat, format, asetat, propionat dan butirat dengan menggunakan alat HPLC (AOAC, 2002). Sampel jus sebanyak 10 ml ditambahkan dengan 1 ml HNO3 dan 25 ml etanol dan dikocok. Campuran kemudian disentrifuse pada 4000 rpm selama 20 menit dan dilanjutkan dengan penyaringan. Supernatant yang diperoleh ditambahkan dengan 1 ml 15 % CH3COONa dan 1 ml 8 % CH3COOPb, dikocok dan kemudian dilanjutkan dengan sentrifuse pada 4000 rpm selama 20 menit dan disaring. Endapan yang diperoleh kemudian dibilas dengan 25 ml 95 % alkohol dan eter, ditambahkan 9 ml akuades sambil diaduk pada kertas saringnya dan selanjutnya ditambahkan asam 1 ml 5M H2SO4 dan didekantasi supernatant atau disaring dengan 0,5 µ miliphore. Sebanyak 20 µl kemudian diinjeksikan kedalam HPLC dan dibandingkan dengan standar dengan kondisi sebagai berikut:
Column : 10 µ silica column/organic acid column Φ= 0.5 cm, L= 30 cm; Flow rate : 1 ml/minute, isocratic
Mobile phase: methanol dengan 5 M H2SO4 Detector : Absorbance detector 254 nm
3.3 Isolasi dan Identifikasi Bakteri Escherichia coli dan Salmonella sp. Feses pedet yang dijadikan sampel dalam penelitian ini adalah pedet yang memiliki nilai skor feses 3-4. Kategori nilai skor feses berdasarkan Larson et al. (1977) adalah sebagai berikut:
1 = normal : feses yang dikeluarkan berbentuk utuh dan menyatu pada lantai 2 = soft : feses yang dikeluarkan tidak berbentuk utuh dan agak menyebar contoh: es krim
3 = runny : feses yang dikeluarkan menyebar dengan 6 mm contoh: adonan kue
4 = watery : feses yang dikeluarkan adalah cairan dan semuanya menyebar contoh: jus jeruk
Pengambilan sampel dilakukan secara aseptik dari lima ekor sapi pedet pre-ruminan pada Peternakan Sapi Tapos-Bogor dengan cara steril swab dimasukkan kedalam rectum dan diputar dan sebanyak 50 gram feses diambil dari masing-masing pedet. Sampel kemudian ditempatkan kedalam media transport yang mengandung NaCl fisiologis dan buffer phosphate water. Bagian atas tabung kemudian ditutup dengan menggunakan kapas dan diberi label.
Escherichia coli diperoleh dengan cara sebanyak 10 gram feses diambil dan
dicampur dengan 90 ml buffered peptone water lalu dihomogenkan dengan menggunakan vortex. Sampel yang telah dihomogenkan dipipet sebanyak 1 ml dan diencerkan dengan 9 ml buffer peptone water sampai ke pengenceran 10-4 dan divortex. Media Levine’s Eosin Methylene Blue (L-EMB) agar kemudian dicairkan pada suhu 45±1 oC. Sebanyak 1 ml pengeceran dipipet kedalam cawan petri dan ditambahkan 18-20 ml L-EMB agar dan diputar membentuk angka delapan pada bidang datar dan didiamkan sampai campuran merata. Cawan
9 kemudian diinkubasi pada inkubator suhu 36±1 oC dengan posisi cawan terbalik selama 24-48 jam. Ciri koloni Escherichia coli yang tumbuh kemudian diamati dengan membentuk warna kilap logam (metalik). Kolini bakteri yang tersangka
Escherichia coli kemudian disubkultur ke dalam media nutrien agar. Kultur
selanjutnya dilakukan uji konfirmasi berupa uji: IMViC (indol, Methyl-red, Voges-Proskauer, Sitrat), perwanaan gram dan tipe hemolisis pada agar darah (Cowan dan Steels 1981; FDA 1998).
Isolat Salmonella sp. diperoleh dengan cara 1 ml feses yang telah diencerkan degan buffer peptone water diinokulasi pada media selektif 18-20 ml Salmonella Shigella (SS) Agar yang telah dicairkan pada suhu 45±1 oC. Koloni bakteri Salmonella sp. yang tumbuh setelah inkubasi suhu 36±1 oC selama 24-48 jam kemudian diamati dengan ciri koloni membentuk warna transluen dan bintik hitam pada sentral koloni. Koloni bakteri yang tersangka Salmonella sp. disubkultur pada nutrein agar dan selanjutnya dilakukan uji IMViC, uji TSIA, pewarnaan gram dan tipe hemolisis pada agar darah (Cowan dan Steels 1981; FDA 1998).
Uji Indol Uji Indol digunakan untuk mendeteksi kemampuan organisme bakteri dalam menghasilkan indol dari asam amino triptofan oleh enzim tryptophanase. Produksi indol dideteksi dengan menggunakan regen Kovac dimana indol akan bereaksi dengan aldehida dalam regen kovac untuk menghasilkan warna merah pada broth. Satu sengkelit (ose) bakteri diinokulasi dalam tabung berisi tryptone broth kemudian diinkubasi 24 pada suhu 36±1 oC. Setelah inkubasi ditambahkan 0,3 ml reagan Kovac kedalam tabung dan dikocok selama 10 menit. Jika reaksi positif maka cincin merah akan terbentuk pada lapisan atas. Sedangkan jika warna jingga menunjukkan reaksi indol negatif.
Uji Methyl-red (Merah metil) Uji methyl red digunakan untuk mendeteksi kemampuan suatu organisme bakteri dalam menghasilkan produk-produk asam dari fermentasi glukosa. Metil adalah sebuah pH indikator dimana broth tetap berwarna merah pada pH ≤4,4. Satu sengkelit (ose) bakteri uji diinokulasi pada glukosa fosfat broth dan diinkubasi 96 jam pada suhu 36±1 oC. Kemudian 5 ml dipindahkan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan 5 tetes merah metil dan dikocok. Hasil reaksi negatif terhadap Methyl red akan menghasilkan warna kuning sedangkan jika positif akan menghasilkan warna merah.
Uji VP (Voges Proskauer) Uji Voges Proskauer digunakan untuk mendeteksi suatu organism bakteri dalam menghasilkan butilen glycol. Acetil-metil carbinol (acetoin) adalah produk sementara dalam produksi glycol. Dalam uji ini 40 % KOH dan alpha-naphthol ditambahkan pada broth setelah inkubasi. Jika acetoin muncul, maka akan dioksidasi menjadi diacetyl. Diacetyl kemudian bereaksi dengan komponen-komponen guanidine dengan untuk menghasilkan warna merah. Satu sengkelit (ose) bakteri diinokulasi kedalam glukosa fosfat broth dan diinkubasi suhu 36±1 oC selama 48 jam, kemudian 1 ml suspensi dipindahkan kedalam tabung, ditambahkan 0.6 ml alpha-naphthol dan 0.2 ml 40 % KOH dan dikocok. Tabung diibiarkan selama 2-4 jam. Munculnya warna merah muda hingga merah tua menunjukkan reaksi positif sedangkan jika warna tidak berubah menunjukkan reaksi negatif.
10
Uji Sitrat Uji sitrat digunakan untuk mendeteksi kemampuan organisme bakteri dalam menggunakan gula sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Penggunaan sitrat melibatkan enzim sitratase yang menyederhanakan (breakdown) sitrat menjadi oksaloasetat dan asetat. Oksaloasetat kemudian disederhanakan menjadi firuvat dan CO2. Produksi Na2CO3 dan NH3 akibat penggunaan sodium sitrat dan garam ammonia akan menghasilkan pH alkalin. Hal ini akan menghasilkan perubahan warna media dari hijau menjadi biru. Satu sengkelit (ose) kultur bakteri diinokulasi pada Simmon sitrat dan diinkubasi selama 96 jam pada suhu 36±1 oC. Jika organisme memiliki kemampuan menggunakan sitrat maka terjadi warna biru (reaksi positif) sedangkan jika terjadi warna hijau menunjukkan reaksi negatif. Karakteristik bakteri Escherichia coli dan Salmonella sp. berdasarkan uji IMViC diterangkan pada Tabel 3.1.
Tabel 3.1 Karakteristik Escherichia coli dan Salmonella sp. berdasarkan uji IMViC
Jenis Uji Escherichia coli Salmonella sp.
Indol + -
Metyl-red + +
Voges – Proskauer - -
Sitrat - +
Uji Pewarnaan Gram Kultur bakteri uji ditempatkan pada kaca alas dan diteteskan NaCl, kemudian dikeringkan dan difiksasi dengan panas. Isolat kemudian diwarnai dengan crystal violet-ammonium oxalate selama satu menit. Setelah satu menit dicuci, ditiriskan dan dibubuhkan larutan Lugol (Gram’s iodine) selama 1 menit kemudian dicuci dengan air dan ditiriskan. Penghilanngan warna kemudian dicuci dengan alkohol 95 % selama 30 detik dan kemudian dicuci dengan air dan dibubuhkan Hucker’s counterstain (larutan safranin) selama 10-30 detik kemudian dicuci dengtan air, ditiriskan, serap dengan kertas saring dan dikeringkan. Pengamatan pewarnaan gram kultur bakteri dilakukan dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa objektif 100 kali.
Uji TSIA Uji TSI Agar dilakukan dengan cara menggoreskan pada bagian miringnya (slant) dan menusukkan pada bagian tegaknya (butt). Tabung media TSIA kemudian diinkubasi pada suhu 36±1 oC selama 24 jam. Bakteri yang memfermentasi ketiga jenis gula dalam medium TSI akan menghasilkan asam-asam yang mengubah warna medium. Jika bakteri memfermentasi dominan laktosa akan menghasilkan warna kuning (slant)/ kuning (butt) sedangkan bakteri yang tidak memfermentasi laktosa akan menghasilkan warna pink (slant)/ kuning (butt) dan kuning/kuning (butt). Jika bakteri menggunakan thiosulfat anion sebagai akseptor elektron terminal maka akan terjadi produksi H2S. Gas H2S yang baru terbentuk bereaksi dengan ferro sulfat dalam media untuk membentuk ferro sulfat yang dapat terlihat sebagai sebuah endapan hitam pada media.
11 3.4 Uji Aktivitas Antibakteri terhadap Escherichia coli danSalmonella sp. 3.4.1 Pembuatan inokulum bakteri uji.
Masing-masing isolat Escherichia coli dan Salmonella sp. yang telah didapatkan diinokulasi pada Mueller Hinton broth dan diinkubasi pada 36±1 oC selama 24 jam. Suspensi masing-masing isolat bakteri dibuat dan kemudian dibandingkan dengan standar kekeruhan McFarland 0,5 (setara dengan 1-2 x 108 CFU/ml).
3.4.2 Pembuatan larutan antibiotik
Antibiotik dalam penelitian ini digunakan sebagai kontrol dalam uji zona bening terhadap bakteri uji. Antibiotik yang digunakan adalah antibiotik komersil VITA Tetra-Chlor® dengan setiap kapsul mengandung 50 mg tetracycline HCl dan 10 mg Erythromycin. Larutan antibiotik dibuat dengan melarutkan satu kapsul VITA Tetra-Chlor® dengan aquades sehingga didapatkan konsentrasi antibiotik sebesar 50 µg/ml.
3.4.3 Uji Difusi Sumur Agar
Media yang digunakan dalam pengujian aktivitas zona adalah Muller Hinton Agar. Sebanyak 25-30 ml media Muller Hinton Agar yang telah dicairkan suhu 45±1 oC dituang kedalam cawan petri dengan dimensi 15x100 mm dan permukaan media diratakan dengan putaran angka delapan dan didiamkan hingga mengeras. Sebanyak 0.5 ml suspensi dipipet kedalam media MHA dan diratakan dengan menggunakan spatula steril. Setelah media mengeras lubang sumur (borer) berdiameter 5 mm dibuat sebanyak 5 lubang dalam setiap cawan. Sebanyak 0.05 ml MHA cair dipipet kedalam bagian dasar lubang sumur dan 0,1 ml larutan antibiotik dan 100, 50, 25 dan 12.5 % jus silase dipipet kedalam lubang sumur. Cawan kemudian di preinkubasi dalam posisi terbalik pada suhu 4 0C selama 24 dan dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 36±1 oC selama 24 jam. Zona bening yang terbentuk kemudian diamati dan dicatat untuk masing-masing preparat. Pengukuran uji difusi sumur dalam penelitian ini diulang sebanyak 2 kali.
3.5 Analisa Data
Data diameter zona bening yang terbentuk dalam pengujian aktivitas antibakteri jus silase dan Vita-Tetra-chlor® terhadap bakteri Escherichia coli dan
Salmonella sp. dianalisa dengan menggunakan Uji-t. Sementara itu data diameter
zona bening yang terbentuk dari uji aktivitas antibakteri 100, 50, 25 dan 12.5 % jus silase dan Vita-Tetra-chlor® terhadap Escherichia coli dan Salmonella sp. dianalisa ragam ANOVA, jika berbeda nyata (p<0,05) dilanjutkan dengan uji Duncan (Steel dan Torrie 1991).
