Rolling Circle Fage ΦX174 dan Replikasi “Rolling Circle”
Bakteriofage ΦX174 adalah wakil dari sekelompok virus kecil (baik bakterial maupun eukariotik) yang menyimpan informasi genetik dalam molekul DNA yang bundar (circular) berstrand tunggal. Di saat virus ini menginfeksi sel induk E. coli pada ΦX174, DNA viral berstrand tunggal (disebut strand positif) akan dirubah ke dalam bentuk double helix (diistilahkan format replikasi/RF) melalui sintesa strand negatif tambahan (komplemen).
RF parental berstrand ganda ini kemudian akan bereplikasi beberapa kali hingga menghasilkan sebuah populasi yang terdiri dari molekul RF progeny (strand double) yang pada saatnya akan bereplikasi secara asimetris untuk menghasilkan strand (+) viral progeny dalam jumlah besar. Strand viral progeny lalu akan bergabung dengan mantel protein untuk menutup satu siklus reproduksi yang komplit. Replikasi dari kromosom ΦX174 lalu dipilah menjadi tiga bagian: (1) parental strand + → parental RF, (2) parental RF → progeny RFs dan CS/progeny RFs → progeny strand (+). Dalam dua tahapan terakhir, akan terjadi sintesis DNA lewat mekanisme yang berbeda yang disebut lingkaran berputar (selanjutnya diistilahkan dengan “rolling circle”).
Perangkat replikasi “rolling circle” kebanyakan sama dengan perangkat replikasi seperti yang sudah dibicarakan sebelumnya, yaitu struktur δ, “eye”, dan “Y” umum dalam jumlah yang lebih banyak. Dalam hal ini, struktur replikatifnya adalah molekul DNA bulat dengan ekor strand tunggal.
Replikasi “rolling circle” diawali dengan aktivitas endonuklease dengan rangkaian khusus (sequence specific) pada fage ΦX174 di mana gen protein λ memecah strand positif milik parental RF pada asal replikasi. Aktivitas endonuklease ini terjadi pada lokasi tertentu (site specific); memotong kromosom ΦX174 pada satu lokasi saja, yaitu asal replikasinya. Proses ini menghasilkan termini 3’ –OH dan 5’ fosfat di lokasi pemotongan pada strand (+)–nya; sedangkan strand (-) tetap tak terputus. Ujung 5’ strand (+) tak terluka dan ‘terkelupas’ saat strand (-) memutari sumbunya (oleh sebab itu disebut “rolling cirle”, mengakibatkan strand ini memiliki ekor. Seperti yang diutarakan sejak awal oleh W.Gilbert dan D. Dressler, model rolling circle pada replikasi DNA
membutuhkan enzim khusus yang disebut ‘transferase’ yang mengikat ujung tepian strand (+) dengan lokasi khusus dalam membran selnya. Meskipun banyak jika tidak semua, kromosom yang bereplikasi terikat ke membran, hanya sedikit info yang diketahui mengenai sifat alami dari ikatan semacam ini. Banyak kasus yang menganggap ikatan membran semacam ini bukanlah perangkat esensial dari replikasi rolling circle, karena pada saat lingkaran berputar dan ujung tepi 5’ berpindah, polymerase DNA mengkatalisasi ekstensi kovalen pada ujung tepi (3’-OH) yang lainnya.
Saat proses replikasi parental RF menjadi progeny RF berlangsung, strand positiflah yang dipakai sebagai template untuk sistesis berulang tanpa putus (diskontinyu) dari strand negatif tambahannya. Pada beberapa kasus, sintesa dari strand tambahan terjadi secara diskontinyu pada ekor strand tunggal sebelum sintesa pada strand pertama komplit. Dalam kasus semacam ini, akan dihasilkan ekor berstrand ganda. Pergantian proses sintesis DNA RF dengan strand ganda menjadi sintesis DNA viral (+) dengan strand tunggal terjadi saat ada protein tertentu di dalam mantel protein sedang diproduksi di dalam sel. Replikasi rolling circle terus berlangsung, namun pada saat strand viral berganti tempat, mantel protein akan mengikatnya dan mencegah terjadinya sintesis pada strand (-) tambahannya.
Fage ΦX174 dari gen protein A adalah protein kunci dalam proses replikasi ΦX174. Ia memiliki banyak perangkat aktivitas. (1) gen protein A mempunyai aktivitas endonuklease pada lokasi khusus (site specific) yang bisa memecah strand (+) pada daerah asalnya. (2) gen protein A kemudian mampu mempertahankan energi dari pecahan ikatan fosfodiester dalam bentuk ikatan kovalen pada terminus 5’ fosforil itu sendiri. (3) gen protein A terus mengikat ujung terminus 5’ pada strand (+)-nya dan juga pada ‘garpu replikasi’ yang melintasi perputaran template dari strand (-). (4) ketika strand (+) mulai disintesiskan, gen protein A memecah dan membentuk asal baru, ligasi termini 3’ hidroxil dan 5’ fosforil, dan sekali lagi akan terikat secara kovalen kepada 5’ terminus strand positif yang baru dihasilkan. Daur aktivitas gen protein A ini akan terus berulang sampai sebuah populasi progeny RFs (tahap II) atau progeny strand (+) (tahap III) akan diproduksi.
Bukti terjadinya replikasi rolling circle ditemukan pada (1) DNA virus berstrand tunggal seperti pada ΦX174, (2) replikasi yang dikaitkan dengan transfer kromosom
selama proses ‘perkawinan’ (konjugasi) dalam bakter, dan (3) replikasi molekul DNA ekstrakromosomal berukuran kecil yang membawa kumpulan (cluster) gen rRNA saat oogenesis pada amfibi.
Penjelasan Gambar 5.32
Tahapan replikasi DNA berstrand tunggal milik bakteriofage ΦX174. (gambar atas a-e). Tahap I adalah konversi dari kromosom berstrand tunggal (a) menjadi bentuk replikatif parental (RF) berstrand dobel (e), (b) sintesis dari strand (-) tambahan (komplemen) yang diawali dengan proses sintesis RNA primer yang berukuran pendek. Reaksi ini dikatalisasi oleh primase dan memerlukan aktivitas setidaknya dari 6 macam protein utama; kompleks protein semacam ini biasanya disebut ‘primosome’ (c) selanjutnya, DNA polimerase III akan mengkatalis tambahan kovalen dari deosiribonukleus pada ujung tepi 3’ milik RNA primer. Sintesis dari strand (-) tambahan
kemudian akan terjadi tanpa putus sampai template strand (+)-nya kehilangan energi. Primosome akan terbentuk dan berkeliling memutari strand template, berhenti sebentar
untuk memulai proses sintesis pada setiap ‘fragmen Okazaki’ yang baru terbentuk. (d) eksisi dari RNA primer dan pengisian celah kosong akan dikatalisir oleh DNA polimerase I. Polinukleotida (DNA ligasi) lalu mengkatalisasi formasi ikatan kovalen antara 3’-OH dan grup 3’-PO4 untuk menghasilkan parental RF berstrand ganda (e) pusat e-1.
Tahap II : replikasi “rolling circle” dari parental RF (e) memproduksi populasi progeny RFs (1) (f) strand (+) dari parental RF terpotong di daerah asal lewat aktivitas endonuklease di lokasi tertentu (site specific)/nikase pada gen protein A milik ΦX174. Gen tersebut akan memotong parental RF hanya pada daerah asal; tidak akan memotong molekul DNA sama sekali. (f-h) sepanjang proses pemotongan ini, gen protein A akan uterikat secara kovalen dengan kelompok 5’ fosforil pada strand (+). Akan terus terikat pada terminus 5’ sampai progeny strand (+) yang komplit berhasil disintesiskan. Ujung 5’ dari strand (+) akan dilepaskan dari strand (-) lalu ditambahkan deosiribonukleus pada ujung bebas 3’ –OH saat lingkaran {dijaga lewat ikatan strand (-) memutari sumbunya (g-h)}. Gen protein A terus terikat saat garpu replikasi berputar mengelilingi strand (-). Sekali saja strand (+) asal berhasil disintesiskan, gen protein A akan memecah daerah asal dan melakukan ligasi simultan pada termini 3’ dan 5’untuk menghasilkan strand (+) melingkar tertutup yang kovalen. (i-i) sintesis dari strand negatif tambahan kemudian berlangsung terus menerus seperti pada tahapan I memakai strand (+) sebagai template. ‘Fragmen Okazaki” mulai terjadi, diawali oleh RNA primer pada tahapan ini juga, namun RNA primer tak terlihat di dalam diagram (i-f-l) parental RF terus bereplikasi lewat model rolling circle sampai terbentuk sebuah populasi berisi 60 progeny RFs (bawah, j-q) Tahapan III : sintesis dari kromosom progeny ber-strand tunggal, (j-p) replikasi rolling circle dari progeny RFs terjadi hanya untuk parental RFs dalam tahapan II, hanya saja strand (-) tidak disintesiskan, sedangkan strand (+) akan dimasukkan ke dalam progeny virion (n-p) Perpindahan dari sintesis RF (tahap II) menjadi sintesis progeny strand (+) (tahap III) hasil dari pengikatan sintesa mantel protein viral baru dengan strand (+), mencegah untuk dijadikan template untuk sintesa strand (-). (q) proses pematangan (maturasi) dari progeny virion menjadi penutup daur hidup komplit fage ΦX174. Kurang lebih ada 500 progeny virion yang diproduksi untuk setiap sel yang terinfeksi.
Gambar 5.33
Mikrograf elektron dari sebuah proses ‘rolling circle’ saat terjadi replikasi DNA bakteriofage ΦX174. Sel berstrand tunggal terlihat berjalan melebar dari strand dobel, dalam bentuk replikasi melingkar. (Diambil dari K.Kpths dan D.Dressler, Proc. Natl. Acad. Sci. 75; 605, 1978).
Pertanyaan:
1. Kapan dimulainya rolling-circle replication?
Dimulainya rolling circle replication adalah saat enzim endonuclease memotong untai parental positif pada sisi spesifik. Untai DNA ini kemudian menjadi template untuk replikasi untai negative dibantu oleh untai RNA primer. Untai negative akan menjadi untai anakan. Untai positif akan terlepas dari untai negative dan akan melanjutkan proses rolling circle replication kembali untuk membuat untai anakan.
2. Sebutkan tiga tahap utama proses rolling circle replication! 1. Tahap pembentukan molekul RF induk
2. Tahap pembentukan RF anakan 3. Tahap sintesis untaian DNA
