Vol. 1 (2), 2006, h. 59-66
Produksi Alkaloid oleh Mikroba Endofit yang Diisolasi dari Batang Kina
Cinchona Ledgeriana Moens dan Cinchona Pubescens Vahl (Rubiaceae)
Ermin K. Winarno
Pusat Aplikasi Isotop dan Radiasi BATAN Pasar Jumat, Jakarta
Email: erminkk@batan.go.id
Abstrak. Telah dilakukan isolasi dan skrining mikroba endofit dari batang C. ledgeriana dan C.
pubescens yang dapat menghasilkan senyawa alkaloid seperti yang dihasilkan pada kulit batang kina.
Hasil isolasi diperoleh 88 isolat kapang. Skrining dilakukan dengan menggunakan media Potato
Dextrose Broth, A dan B untuk memperoleh kondisi optimum produksi alkaloid oleh mikroba endofit.
Analisis kualitatif dan kuantitatif senyawa alkaloid dilakukan menggunakan kromatografi lapisan tipis dan kromatografi cair bertekanan tinggi. Dari hasil skrining diperoleh 2 jenis kapang endofit (LMC 19 dan LMC 29) yang dapat memproduksi senyawa alkaloid. Dalam media Potato Dextrose Broth dan B, LMC 19 dan LMC 29 memproduksi kinin, sedangkan dalam media B LMC-29 juga dapat memproduksi sinkonin.
Kata kunci: alkaloid, kinin, sinkonin, mikroba endofit, Cinchona ledgeriana Moens, Cinchona
pubescens Vahl, Rubiaceae.
Pendahuluan
Tanaman dan mikroorganisme mempunyai hubungan yang sangat erat satu sama lain. Mikroorganisme dapat menyerang tanaman sehingga menyebabkan penyakit pada tanaman induknya, sementara ada pula mikroorganisme yang bersimbiosis sangat baik dengan tanaman induknya. Mikroorganisme pada tanaman terdiri dari 2 jenis yaitu mikroorganisme yang tinggal di permukaan tanaman disebut epifit (epiphyte) dan mikroorganisme yang tinggal di dalam tanaman disebut endofit (endophyte).
Studi akhir-akhir ini telah banyak dilakukan para peneliti menggunakan tanaman tropis. Data menunjukkan bahwa tanaman induk di daerah tropis kaya akan mikroba endofit yang belum diklasifikasikan dan kemungkinan mengandung genera dan spesies baru. Hubungan antara mikroba endofit dan tanaman dalam menghasilkan metabolit sekunder sangat menarik dipelajari. Sejak tahun 1993 penelitian produksi taxol yang merupakan obat kanker oleh kapang endofitik Taxomyces andreanae dan Pestalotiopsis microspora telah dilaporkan.1 Taxomyces andreanae menghasilkan taxol sebanyak 24 – 50 ng per liter dalam medium S-7. Pestalotiopsis microspora merupakan endofit dari kulit batang Taxodium distienum (L.) Rich (bald cypress) yang
telah menghasilkan taxol 50 - 1487 ng/liter medium.2
Dalam bioteknologi, mikroba endofit ini sangat potensial sebagai penghasil senyawa-senyawa baru berkhasiat obat, metabolit sekunder, pengontrol biologi dan berbagai senyawa yang bermanfaat. Dengan demikian diperlukan pengembangan atau penelitian untuk mempelajari hubungan antara tanaman dan endofitik pada kondisi tropis.
Salah satu tanaman tropis adalah Cinchona (Rubiaceae) yang kita kenal sebagai pohon kina telah dimanfaatkan sebagai obat terapi berharga. Kulit Cinchona mempunyai aktivitas sebagai anti malaria yang telah diketahui selama berabad-abad, dan digunakan secara luas.3 Senyawa aktif tersebut adalah kinin (Gambar 1), merupakan senyawa mayor pada kulit batang kina, senyawa mayor yang lain yaitu kinidin. Kulit batang kina dipanen setelah 7 – 12 tahun, umumnya di dalam ekstrak C. ledgeriana Moens dan C. pubescens VAHL terdapat 12 - 18 % alkaloid.4 Selain kinin dan kinidin, juga ditemukan 35 senyawa alkaloid lain seperti sinkonin dalam pohon kina. Menurut Scragg dan Allan, kebutuhan kinin dan kinidin mencapai 500.000 kg.5 Menurut laporan UNCTAD/GATT 1982, diperkirakan total penjualan alkaloid Cinchona mencapai sebanyak 50.000 US $ per tahun.3
N N H HO H H H3CO N N H HO H H 9 8 6' Kinin Sinkonin
Gambar 1. Struktur kimia senyawa kinin dan sinkonin Mengingat kebutuhan akan senyawa alkaloid ini makin meningkat, maka sejak tahun 1974 banyak peneliti telah mengembangkan teknik untuk memproduksi senyawa-senyawa berguna ini dalam sistim kultur sel tanaman.6 Pada tahun 1987 Scragg dan Allan telah mengembangkan biosintesis alkaloid Cinchona dengan teknik kultur sel tanaman, mereka berkesimpulan bahwa produksi alkaloid yang dihasilkan masih rendah yaitu 0,039% berat kering, sementara biaya produksinya sangat mahal.5Sampai saat ini belum ada proses bioteknologi yang efektif dan efisien untuk menghasilkan alkaloid Cinchona. Pengembangan selanjutnya mungkin dengan biosintesis menggunakan enzim atau mikroba.3
Pada penelitian ini dilakukan isolasi dan skrining terhadap mikroorganisme yang terdapat pada batang C. ledgeriana Moens dan C. pubescens Vahl yang dapat menghasilkan alkaloid seperti pada tanaman induknya. Setelah diperoleh isolat yang mampu menghasilkan senyawa alkaloid, maka akan dilakukan beberapa percobaan terhadap hasil seleksi tersebut, agar dapat diproduksi senyawa alkaloid secara optimal.
Bahan dan Metode
Bahan tanaman. Batang tua kina (berdiameter 1 cm) dari jenis Cinchona ledgeriana dikoleksi dari Gambung Quinine Research Center (tahun 1999), dari Cibodas (tahun 2000 dan 2001), dari Gunung Mas (tahun 2000), sedang Cinchona pubescens dari Cibodas (tahun 2000). Ketiga daerah ini terdapat di propinsi Jawa Barat.
Bahan Kimia dan Peralatan. Bahan kimia yang digunakan yaitu Potato Dextrose Agar (PDA), Potato Dextrose Broth (PDB), media S-77 yang telah dimodifikasi, dan medium Phoma8yang telah dimodifikasi, pereaksi Dragendorf, KH2PO4, CH3CN (HPLC grade), quinine. HCl.2H2O, etanol, Na-hipoklorit, corn meal-malt agar, kloramfenikol, nutrient agar dan nistatin. Peralatan yang digunakan yaitu kromatografi cair bertekanan tinggi (KCKT) 3 dimensi (Hitachi), kolom Capcell
PAPC-C18 (250 mm x 4,6 mm), detektor diode array, lampu UV ( 254 nm dan 366 nm) dan alat-alat gelas.
Isolasi dan Pemurnian Mikroba.
Batang-batang kina (panjang 2 cm, ø 1 cm) dicuci dengan air, lalu disterilkan dengan etanol 70% selama 1 menit, natrium hipoklorit 5,3% selama 5 menit, dan etanol 75% selama 0,5 menit. Batang kina dibelah dua secara longitudinal, lalu diletakkan di atas cawan petri berisi corn meal-malt agar
(CMMA) yang telah dicampur dengan
kloramfenikol 0,05 mg/mL. Batang yang sama diletakkan juga di atas nutrient agar yang dicampur dengan nistatin 0,10 mg/mL. Keduanya diinkubasi selama 3 hari pada suhu 27ºC, kemudian koloni dipindahkan ke PDA dalam cawan petri dan selanjutnya diinkubasi lagi pada suhu 27ºC dan dilakukan pengecekan secara berkala untuk pemurnian lebih lanjut. Masing-masing endofit diisolasi melalui beberapa kali pemindahan, sehingga diperoleh isolat murni. Sebanyak 88 mikroba endofit yang telah diisolasi, ditanam pada agar miring (PDA) dan diinkubasi dalam inkubator suhu 29ºC, selanjutnya setiap 2 bulan sekali dikultivasi kembali. Sebagian kecil isolat disimpan dalam medium PDA pada suhu -80ºC.
Kultivasi Mikroba Endofit. Pengembangan atau pertumbuhan setiap mikroba endofit menggunakan media cair sebanyak 30 mL di dalam tabung reaksi 100 mL. Media diinokulasi dengan mikroba endofit, diletakkan miring dalam inkubator pada suhu 28-30ºC dan dikocok pada kecepatan 115 rpm. Pengambilan contoh dilakukan pada hari ke-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, dan 9. Medium cair yang digunakan untuk pertumbuhan endofit yang akan diuji agar menghasilkan alkaloid adalah Potato Dextrose Broth (PDB, 24 gr/L), medium A7 (S-7 yang telah dimodifikasi), dan medium B8 (Phoma yang telah dimodifikasi). Selanjutnya dicari kondisi atau teknik pengembangan mikroba endofit yang terbaik sehingga mikroba endofit hasil seleksi tersebut dapat menghasilkan senyawa alkaloid secara optimal.
Kultivasi Kapang LMC-19 dan LMC-29. Kultivasi kapang endofit LMC-29 dilakukan dengan beberapa cara. Pertama, kapang diambil dari agar miring PDA, diinokulasi ke larutan PDB 30 mL (pH 5,22) dalam tabung reaksi 150 mL, dan diletakkan pada posisi miring dalam inkubator pada suhu 28-30 oC dan digoyang pada kecepatan 115 rpm. Kedua, LMC-19 dan LMC-29 yang berasal dari agar miring dan tabung berisi serpihan
Cinchona Pubescens Vahl (Rubiaceae)
batang kina, masing-masing dikultivasi dalam 20 mL media cair B atau PDB dalam erlenmeyer 50 mL yang kena cahaya dan tidak kena cahaya (erlenmeyer dibungkus dengan karbon). Inkubasi dilakukan pada suhu 28-30ºC dan digoyang pada kecepatan 115 rpm. Ketiga, LMC-29 yang berasal dari kultur agar miring PDA, ditanam dulu dalam 3 buah tabung reaksi kecil, masing-masing berisi 2 ml akuades dan potongan (serpihan) kecil batang C. Succirubra, C. Calisaya, dan C. Ledgeriana, yang beratnya masing-masing 100 mg. Setelah 35, 65, 78, dan 97 hari, isolat diambil dan ditanam pada PDA dalam cawan petri. Setelah 13 hari isolat diambil untuk prekultur dalam media cair PDB, A, dan B, masing-masing sebanyak 25 mL dalam erlenmeyer 50 mL. Setelah 1 hari, media dan biomassa dituang ke dalam erlenmeyer 500 mL yang telah berisi masing-masing 225 ml media tersebut di atas. Pengambilan contoh, ekstraksi, dan identifikasi dengan kromatografi lapisan tipis (KLT) dilakukan setelah 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, dan 9 hari.
Ekstraksi dan Identifikasi Alkaloid. Medium sebanyak 5 mL dipipet dan ditambah 1 atau 2 buah biomassa kapang, dihancurkan dan
dihomogenkan sampai halus, lalu diekstraksi dengan 5 mL CHCl3 sebanyak 3 kali. Fase kloroform dikumpulkan dan diuapkan, lalu dianalisis kualitatif dengan KLT. Fase gerak yang digunakan adalah CHCl3 :MeOH : air = 7:3:1. Penampak bercak digunakan pereaksi Dragendorf untuk melihat adanya alkaloid dengan munculnya bercak warna jingga. Analisis kuantitatif juga dilakukan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) 3 dimensi menggunakan kolom Capcell PAPC-C18 (250 mm x 4,6 mm), detektor diode array dan eluen KH2PO4 20 mM pH 2,50:CH3CN = 9:1, dan kecepatan alir 1,0 mL/menit.
Hasil dan Pembahasan
Isolasi dan Pemurnian Mikroba Endofot. Jumlah isolat yang diperoleh sebanyak 88 isolat, dan diberi kode seperti disajikan pada Tabel 1. Cinchona ledgeriana dikoleksi dari Gambung Quinine Research Center pada tahun 1999 (9 isolat), pada tahun 2000 dari Cibodas (12 isolat), dari Gunung Mas (25 isolat), pada tahun 2001 dari Cibodas (17 isolat) dan Cinchona pubescens dari Cibodas (25 isolat ).
Tabel 1. Isolat-isolat yang telah dimurnikan (belum diidentifikasi) No. C. ledgeriana Gambung Quinine Research Center, 1999 C. ledgeriana (Cibodas, 2000) C. ledgeriana (Gunung Mas, 2000) C. ledgeriana (Cibodas, 2001) C. pubescens (Cibodas, 2000) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. Cib.5-1(CMM) Cib.5-1(WA) Cib.5-1(WA) QRC-233-1(CMM) QRC-233-1(WA) QRC-233-1(NA) QRC-233-1(CMM) QRC-233-1(WA) QRC-233-1(NA) COLC-1 COLC-2 NOLC-1 NOLC-2 NOLC-3 NOLC-4 NOLC-5 WOLC-1 WOLC-2 WOLC-3 WOLC-4 WOLC-5 COLG-1 COLG-2 COLG-3 COLG-4 COLG-5 COLG-6 COLG-7 COLG-8 COLG-9 COLG-10 COLG-11 COLG-12 COLG-13 NOLG-1 NOLG-2 NOLG-3 NOLG-4 NOLG-5 NOLG-6 WOLG-1 WOLG-2 WOLG-3 WOLG-4 WOLG-5 WOLG-6 LCC-1(CMM) LCC-2(CMM) LCC-3(CMM) LCC-4 (CMM) LCC-5(CMM) LCC-6(CMM) LCW-1(WA) LCW-2(WA) LCW-3(WA) LMC-11(CMM) LMC-17(CMM) LMC-19(CMM) LMC-23(CMM) LMC-29(CMM) LMN-1(NA) LMW-1(WA) CMC-8(CMM) COPC-1 COPC-2 COPC-3 COPC-4 COPC-5 COPC-6 COPC-7 COPC-8 COPC-9 COPC-10 COPC-11 COPC-12 COPC-13 NOPC-1 NOPC-2 NOPC-3 NOPC-4 NOPC-5 NOPC-6 NOPC-7 WOPC-1 WOPC-2 WOPC-3 WOPC-4 WOPC-5 Keterangan: CMM = Corn Meal Medium; NA = Nutrient agar; WA = Water agar
Analisis Kualitatif Produksi Alkaloid oleh Isolat. Seluruh isolat sebanyak 88 yang telah dimurnikan, satu persatu ditumbuhkan dalam 3 jenis media cair, yaitu PDB, medium A dan medium B. Hasil skrining awal dari 88 isolat yang diuji dalam ketiga jenis media tersebut, diperoleh 2 kapang endofit yang menghasilkan senyawa alkaloid, yang ditunjukkan dengan adanya bercak oranye pada KLT dengan penampak bercak pereaksi Dragendorf (Gambar 2).
Hasil KLT ekstrak CHCl3 dari LMC-19 pada agar miring yang ditumbuhkan dalam media cair ditunjukkan pada Gambar 2(a) menghasilkan bercak warna oranye dengan jarak migrasi Rf 0,49 sama seperti standar kinin. Hal ini menunjukkan bahwa kapang tersebut dapat menghasilkan kinin dalam media cair PDB setelah 3 hari. Demikian juga LMC-29 asal agar miring dalam media PDB setelah 7 hari (Gambar 2b) dan dalam media B setelah 2 hari (Gambar 2c), masing-masing menghasilkan kinin (Rf 0,49) sama dengan Rf standar kinin.
Pada percobaan kedua kapang endofit ini ditumbuhkan dalam erlenmeyer berisi ketiga macam media cair seperti di atas, namun erlenmeyer dibungkus dengan karbon selama inkubasi, supaya tidak mendapat cahaya. Hasil percobaan terhadap endofit tanpa adanya cahaya tersebut memberikan hasil negatif pada KLT dengan penampak bercak yang sama. Hal ini menunjukkan bahwa produksi alkaloid oleh kapang endofit membutuhkan cahaya.
Pada percobaan ketiga, inkubasi kapang dilakukan dalam air yang mengandung serpihan batang kina. Berdasarkan uji kualitatif dengan KLT diperoleh hasil seperti disajikan pada Tabel 2. Terjadinya produksi alkaloid ditunjukkan adanya
bercak warna jingga hasil KLT LMC-19 dan LMC-29 ditunjukkan pada Gambar 3. Pada Gambar 3a terlihat hasil KLT kapang dalam 250 ml medium PDB. Dalam medium ini kapang LMC-19 pada hari ke-3 baik asal agar miring (no. 1) maupun yang berasal asal dari serpihan batang C. ledgeriana (inkubasi pada selama 65 hari, no.2) menghasilkan bercak jingga. Rf senyawa yang dihasilkan sesuai dengan Rf 0,49 senyawa kinin sebagai standar. Pada KLT no. 3 kapang LMC-29 pada hari ke-7 baik yang berasal dari agar miring maupun yang berasal dari serpihan batang C. ledgeriana (inkubasi selama 78 hari, no. 4), masing-masing memberikan bercak warna jingga pada Rf 0,49 yang sesuai dengan Rf standar kinin. Hal ini menunjukkan bahwa kedua kapang tersebut dalam medium PDB dapat menghasilkan kinin baik asal agar miring maupun yang diinkubasi terlebih dahulu pada serpihan batang C. Ledgeriana.
Selanjutnya pada Gambar. 3b dari no. 5 sampai dengan no. 10 merupakan hasil KLT dari kapang
LMC-19 dan LMC-29 masing-masing
ditumbuhkan dalam 250 mL medium B. KLT no. 5 dan no. 7 adalah hasil KLT pada hari ke-2 dari kapang LMC-19 dan LMC-29 yang berasal dari serpihan batang C. ledgeriana (inkubasi selama 78 hari), senyawa alkaloid yang dihasilkan sama, yaitu kinin (Rf 0,49). Pada hari ke-3 LMC-29 yang berasal dari serpihan batang C. calisaya (inkubasi selama 62 hari, no. 8) juga menghasilkan kinin dengan Rf 0,49. Selanjutnya pada Gambar 3b KLT no. 10 pada hari ke-6 LMC-29 (dalam medium B) dari serpih batang C. Succirubra (inkubasi selama 65 hari) dapat menghasilkan senyawa alkaloid lain dengan jarak migrasi Rf 0,47 sesuai dengan standar sinkonin.
Gambar 2. (a). Hasil skrining awal KLT kapang LMC-19 (PDB), dan (b). LMC-29 (PDB) dan (c). LMC-29 (B)
.
. . .
. . . .
P D B Q n C n 7 P D B 1 2 3 4 5 6 Q n B Q n C n 3 P D B = P o ta to D e x tr o s e B r o th B = m e d ia P h o m a Q n = k in i n C n = s i n k o n in 1 = L M C -1 1 2 = L M C -2 3 3 = L M C -2 9 4 = L M N - 1 5 = C M C - 8 6 = L C W - 3 7 = L M C -1 9 (a ) (b ) ( c )Cinchona Pubescens Vahl (Rubiaceae)
Tabel 2.Hasil pewarnaan (pereaksi Dragendorf) KLT ekstrak CHCl3 dari kapang dalam media uji
Produksi alkaloid Isolat Asal Isolat Waktu
inkubasi PDB A B
LMC-19 agar miring 3 hari Kinin -
-LMC-19 serpih batang
C.ledgeriana 3 hari Kinin - Kinin
LMC-29 agar miring 7 hari Kinin -
-LMC-29 serpih batang
C.ledgeriana 2 hari - - Kinin
LMC-29 serpih batang
C.ledgeriana
7 hari Kinin -
-LMC-29 serpih batang
C.succirubra dan 9 hari5,6,7,8 - - Sinkonin
LMC-29 serpih batang
C.calisaya 3 hari - - Kinin
PDB = Potato Dextrose Broth ; A = S-7 yang telah dimodifikasi; B = Phoma yang telah dimodifikasi
. . . . . . . . . . . . . . . . P D B Q n C n 1 2 3 4 B Q n C n 5 6 7 8 9 1 0 1 = L M C -1 9 a g a r m irin g 2 = L M C -1 9 p d s e rp ih b a ta n g C . le d g e r ia n a6 5 h a ri 3 = L M C -2 9 a g a r m irin g 4 = L M C -2 9 p d s e rp ih b a ta n gC . le d g e r ia n a7 8 h a ri 5 = L M C -1 9 p d s e r p ih b a ta n gC . le d g e r ia n a7 8 h a ri 6 = L M C -2 9 p d s e r p ih b a ta n g C . le d g e r ia n a6 2 h a ri 7 = L M C -2 9 p d s e r p ih b a ta n gC . le d g e r ia n a7 8 h a ri 8 = L M C -2 9 p d s e r p ih b a ta n gC . c a lis a y a6 2 h a r i 9 = L M C -2 9 p d s e r p ih b a ta n gC . s u c c ir u b r a3 5 h a ri 1 0 = L M C -2 9 p d s e r p ih b a ta n gC . s u c c ir u b r a6 5 h a ri (a ) ( b )
Gambar 3. (a) LMC-19 dan LMC-29 media PDB, (b) LMC-19 dan LMC-29 dalam B Hasil uji kualitatif KLT produksi kapang yang
dinduksi pada media air yang mengandung masing-masing serpih batang C. Ledgeriana, C.succirubra, dan C. calisaya cukup menjanjikan untuk produksi alkaloid oleh kapang endofitik. Sementara kapang yang dikultivasi pada agar miring dengan berjalannya waktu penyimpanan dan berganti ke generasi selanjutnya, produksi alkaloid makin berkurang dan akhirnya tidak memproduksi alkaloid lagi.
Analisis Kuantitatif Kinin dengan KCKT. Kromatogram hasil KCKT ekstrak CHCl3 dari LMC-19 (medium PDB) dan LMC-29 (media PDB dan B) ditunjukkan pada Gambar 4, 5 dan 6. Pada Gambar 4a terlihat kromatogram KCKT kapang
LMC-19 dalam media PDB setelah 8 hari. Waktu retensi senyawa yang dihasilkan 12,00 menit sesuai dengan waktu retensi standar kinin (Gambar 4b). Spektrum kinin ditunjukkan pada insert sebelah kanan Gambar 4b.
Kromatogram pada Gambar 5a menunjukkan bahwa kapang LMC 29 dapat memproduksi alkaloid dalam media PDB setelah 2 hari dengan waktu retensi 12,99 menit dengan konsentrasi yang tinggi. Setelah diencerkan (Gambar 5b) waktu retensinya alkaloid tersebut sesuai dengan waktu retensi standar kinin (12,28 menit, Gambar 5c). Berdasarkan pola spektrum uv, senyawa tersebut identik dengan spektrum kinin (insert pada Gambar 5c).
Gambar 4. Kromatogram hasil KCKT ekstrak CHCl3 dari LMC-19 (dari serpihan batang C. ledgeriana) dalam media PDB (a), kromatogram dan spektrum standar kinin 0,1 mg/L (b). Eluen KH2PO4 20 mM pH 2,50 : CH3CN = 9 : 1, dan kecepatan alir 1 mL/menit dan = 210 nm.
Gambar 5. Kromatogram hasil KCKT ekstrak CHCl3 dari LMC-29 (dari serpihan batang C. ledgeriana) dalam media B (a), kromatogram dan spektrum standar kinin 0,1 mg/L (b). Eluen KH2PO4 20 mM pH 2,50 : CH3CN = 9 : 1, dan kecepatan alir 1 mL/menit dan = 210 nm.
Kapang LMC-29 juga dapat memproduksi senyawa alkaloid lain, yaitu sinkonin dalam medium B setelah 6 hari (Gambar 6a). Waktu retensi senyawa tersebut 9,47 menit sesuai dengan waktu retensi senyawa standar sinkonin 9,48 menit. Berdasarkan pola spektrum uv, senyawa tersebut identik dengan spektrum sinkinin (insert pada Gambar 6b).
Pada penelitian lanjut terhadap LMC-19 dan LMC-29, menunjukkan bahwa kedua kapang tersebut menghasilkan kinin masing-masing dalam media B dan PDB ditunjukkan pada Gambar 7. Kapang LMC-19 dapat menghasilkan kinin maksimal pada hari ke-6 sebesar 0,117 mg/L
dalam medium B, sedangkan LMC-29
menghasilkan kinin sebesar 0,610 mg/L pada hari ke-7 dalam medium PDB.
W a k t u ( m e n i t ) S er a p an ( A U ) S p e k t r u m k i n i n Se ra pa n (A U ) P a n j a n g g e l o m b a n g ( n m )
Gambar 6. Kromatogram hasil KCKT ekstrak CHCl3 dari LMC-29 (dari serpihan batang C. succirubra) dalam media B (a), kromatogram dan spektrum standar sinkonin 0,046 mg/L (b). Eluen KH2PO4 20 mM pH 2,50 : CH3CN = 9 : 1, dan kecepatan alir 1 mL/menit dan = 210 nm.
Gambar 7. Produksi kinin oleh kapang LMC-19 dan LMC-29 dari agar miring dan ditumbuhkan dalam media cair B dan PDB.
Gambar 8 menunjukkan produksi kinin oleh kapang LMC-29 yang diinkubasi dulu di antara serpihan batang kina C. calisaya, C. succirubra dan C. ledgeriana, lalu ditumbuhkan dalam media B dan PDB. Pada hari ke-2 produksi kinin dalam media B (kapang yang diinkubasi pada serpihan C. Ledgeriana selama 78 hari) terlihat paling tinggi dibandingkan dengan hari ke-3 dan seterusnya, sebesar 5,914 mg dalam 250 mL medium B (23,656 mg/L). Pada hari ke-3 alkaloid tidak terdeteksi, pada hari ke- 4, 6 dan 7 kinin yang diproduksi kecil, masing-masing 0,008; 0,010; dan 0,015 mg/L. Dalam medium PDB kapang LMC-29
juga dapat memproduksi kinin maksimum 0,423 mg/L pada hari ke-7. Kapang LMC-29 yang diinkubasi lebih dulu pada serpihan batang C. Calisaya selama 78 hari, pada hari ke-5 produksi kinin mencapai maksimum baik dalam media B maupun PDB, masing-masing sebesar 0,079 mg/L dan 0,128 mg/L. Inkubasi kapang LMC-29 pada serpihan batang C. Succirubra selama 78 hari, pada hari ke-7 kultivasi dalam media PDB mencapai maksimum 0,080 mg/L, sedangkan dalam media B, alkaloid tidak diproduksi.
Gambar 8. Produksi kinin oleh kapang LMC-29 yang diinkubasi lebih dulu pada serpihan batang kina C.
calisaya, C. succirubra dan C. ledgeriana.
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 1 2 2.5 3 4 6 7 8 Hari ke-[K in in ] m g/ L LMC-19 LMC-29 Sinkonin standar Waktu (menit) Se ra pa n (A U ) panjang gelombang (nm) Spektrum Sinkonin 9. 48 9. 47
Gambar 9. Produksi kinin oleh kapang LMC-19 yang tumbuh di antara serpihan batang kina C. ledgeriana.
Gambar 10. Produksi sinkonin oleh kapang LMC-29 yang lebih dulu diinkubasi pada serpihan batang kina C.
calisaya, C. succirubra dan C. ledgeriana dalam media
B.
Pada Gambar 9 ditunjukkan produksi kinin oleh kapang LMC-19 paling tinggi dalam medium PDB, yaitu sebesar 0.978 mg/L pada hari ke-8. Dalam media B, LMC-19 dapat juga memproduksi kinin dan mencapai maksimum pada hari ke-5, sebesar 0,105 mg/L. Kapang LMC-29 yang diinkubasi pada serpihan kina C. ledgeriana selama 78 hari dan ditumbuhkan dalam media cair B dapat menghasilkan sinkonin setelah 1 sampai 7 hari, dan mencapai maksimum pada hari ke-3 yaitu sebesar 0,312 mg/L (Gambar 10). Inkubasi pada serpihan batang kina C. calisaya selama 78 hari dan ditumbuhkan dalam media cair B, LMC-29 dapat menghasilkan sinkonin setelah hari pertama sampai 7 hari, mencapai maksimum pada hari ke-3 yaitu sebesar 0,225 mg/L. Sedangkan pada serpihan batang C. succirubra selama 35 hari, dalam media cair B setelah hari ke-2 produksi mencapai maksimum yaitu sebesar 0,227 mg/L, sedangkan inkubasi selama 65 hari produksi sinkonin mencapai maksimum pada hari ke-2 sebesar 0,160 mg/L.
Kesimpulan
Berdasarkan hasil pemurnian mikroba endofit dari batang kina Cinchona ledgeriana Moens diperoleh dua jenis kapang dengan kode LMC-19 dan LMC-29 yang dapat menghasilkan senyawa alkaloid kinin dan sinkonin. Produksi kinin tertinggi oleh kapang LMC-19 sebesar 0,978 mg/L dalam media Potato Dextrose Broth. Kapang LMC-29 dalam medium B dapat menghasilkan kinin dan sinkonin tertinggi, masing-masing sebesar 23,656 mg/L dan 0,312 mg/L setelah didahului dengan inkubasi selama 78 hari pada serpihan batang kina Cinchona ledgeriana Moens.
Penghargaan. Penulis menyampaikan terima kasih sebesar-besarnya kepada Prof. Dr. H. Shibuya yang telah memberikan bimbingan dan kesempatan kepada penulis untuk melakukan penelitian ini dalam rangka Training “Search for Bioactive Substances from Tropical Medicinal Plants” di Laboratorium Kimia Bahan Alam, Fakultas Farmasi dan Ilmu Kefarmasian di Universitas Fukuyama, Hiroshima, Jepang
Pustaka
1. Stierle, A.; Stierle, D.; Strobell, G.; Bignami, G.; Grothaus, P. Endophytic fungi of Pacific yew (Taxus
brevifolia) as a source of Tacol, Taxanes, and other
pharmacophores in Bioregulators for Crop Protection and Pest control. American Chemical
Society, 1994, 64-77.
2. Li, J.; Strobel, G.; Sidhu, R.; Hess, W.M.; Ford, E.J. Endophytic taxol-producing fungi from bald cypress,
Taxodium distichum. Microbiology,1996, 142,
2223-2226.
3. Wijnsma, R.; Verpoorte,R. Quinoline alkaloids of Cinchona, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of
Plants, 1988, 5, 335-355.
4. Smit, E. Analysis of Cinchona alkaloids by high-performance liquid chromatography. Application to the analysis of quinidine gluconate and quinidine sulphate and their dosage forms. J. Chromatography, 1984, 299, 233-244.
5. Scragg, A.H.; Allan, E.J. The potential of plant cell culture for the production of quinine. Acta Leidensia, 1987, 55, 45-51.
6. Chatterjee, S.K.; Vegetative propagation of high quinine yielding Cinchona. Indian J. Hortic, 31, 174-177.
7. Stowe, B.B.; Yamaki, T. Ann. Rev. Plant. Physiol.
1957, 8, 181.
8. Yang, X.; Strobel, G.; Stierle, A.; Hess, W.M.; Lee, J.; Clardy, J. A fungal endophyte-tree relationship:
Phoma sp. in Taxus wallachiana. Plant Science,
1994, 102, 1-9. 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 2 3 4 5 6 7 8 Hari ke-[K in in ] m g/ L Medium BMedium PDB 0 . 0 0 . 1 0 . 2 0 . 3 0 . 4 1 2 3 4 5 6 7 H a r i k e -[S in ko n in ] m g /L l e d g / 7 8 c a l i / 7 8 s u c c / 3 5 s u c c / 6 5
