LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI “ELEKTROFORESIS AGAROSA”
Dosen :
Endah Puspitasari, S.Farm.,M.Sc.,Apt. Oleh :
Kelompok A-2
Alfia Septiana Mutiasari (142210101010)|
Sutatik (142210101037)
Nadiya Rosada (142210101038) Finda Avita Sari (142210101050) Widyaning Dwi A (142210101055) Hasnia Ika Syafitri (142210101061) Monica Cinuradha A.S (142210101075)
BAGIAN BIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS JEMBER
BAB I PENDAHULUAN
Dewasa ini telah banyak dilakukan analisis DNA termasuk DNA plasmid di dalamnya, untuk mengembangkan ilmu pengetahuan terutama penelitian mengenai genetika maupun biologi molekular. Salah satu cara yang paling sering dilakukan yaitu elektroforesis DNA dengan menggunakan gel agarosa. Metode elektroforesis mulai berkembang pada akhir abad ke-19 setelah adanya penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap parikel-partikel atau molekul bermuatan listrik, dalam hal ini termasuk juga protein.
Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang pernah dibuat dan secara rutin digunakan di laboratorium klinis untuk analisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis (serum, urin, CSF). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip elektroforesis zona. Seperti yang diketahui, molekul protein bermigrasi pada medium padat/gel yang direndam dengan suatu larutan penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Migrasi ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein (Jean and Francois G., 2010).
Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran. Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler (Magdeldin, 2012).
Elektroforesis telah berkembang pesat seiring dengan berkembangnya teknologi, disebabkan karena pengerjaannya sangat sederhana dan sangat mudah. Semakin berkembangnya zaman, makin memudahkan kita untuk melakukan rekayasa biologi molekuler termasuk pembentukan protein tertentu pada tubuh suatu mikroorganisme. Dengan cara tersebut kita akan dimudahkan untuk mengetahui keberadaan protein target dari mikroorganisme yang digunakan. Protein sendiri merupakan komponen yang sangat penting bagi organisme pada
umumnya, karena berfungsi untuk memperbaiki sel-sel yang rusak dan suplai nutrisi yang dibutuhkan oleh organisme. Selain itu makromolekul protein mampu mengendalikan metabolisme kompleks dan menjaga kelangsungan hidup suatu organisme.
1.1 Rumusan Masalah
a. Bagaimana cara melakukan elektroforesis dengan gel agarosa? b. Bagaimana cara menentukan ukuran DNA plasmid hasil restriksi? 1.2 Tujuan Praktikum
a. Untuk mengetahui cara melakukan elektroforesis dengan gel agarosa b. Untuk mengetahui cara menentukan ukuran DNA plasmid hasil
restriksi
TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Elektroforesis
Elektroforesis berasal dari bahasa yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik. Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul (Titrawani,1996). Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan oleh rasio muatan dan massa. Sebagai contoh jika dua molekul mempunyai massa dan bentuk yang sama, molekul dengan muatan lebih besar akan bergerak lebih cepat ke electrode. (David G. Watson, 2007). Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen-komponen protein tersebut akan mulai bermigrasi (Ricardson dkk. 1986).
Kecepatan olekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk, dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks peyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan.
Dasar elektrofosis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang system. Koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi konvektif. Pada elektroforesis, medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan.
Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negative (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode) (klug & cummings, 1994: A 6). Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul tersebut pada suatu fase diam (stationary phase) dalam sebuah medan listrik kan berbeda-beda. Oleh karena partikel bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik. Kemampuan perpindahan pergerakan muatan molekul tersebut menuju ke arah kutub yang berlawanan merupakan suatu parameter kecepatan dalam proses elektroforesis yang dinyatakan sebagai mobilitas elektroforetik. Mobilitas elektroforetik merupakan laju perpindahan partikel bermuatan dalam cm per detik yang disebabkan karena pengaruh medan listrik 1 V per cm, dinyatakan dalam cm2V-1s-1. Mobilitas elektroforetik dapat ditetapkan hanya untuk elektrolit tertentu pada kondisi pengujian yang tepat.
Menurut stanesh dalam titrawani (1996) tektin elektroforesis dapat dibedakan menjadi dua cara, yaitu: elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis) dan elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik elektroforesis larutan, larutan penyangga mengandung makromolekul yang ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik.kecepatan migrasi dari makromolekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfugsi sebagai media penunjang yang berisis (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida, dan kertas sellulose poliasetat. Adapun menurut Sargent & George (1975) elektroforesis daerah disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua buahmodel yaitu orizontal dan vertical. Metode yang biasa digunakan adalah model gorizontal, karena mempunyai bebrapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat sederhana, relative murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan pemisahan yang lebih baik.
Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bermigrasinya molekul-molekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaiut kertas, selulosa, asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakanmatriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.
Beberapa factor yang mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni : (Soedarmadji, 1996)
1. Ukuran molekul protein
Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.
2. Konsentrasi gel
Migrasi molekul protein pada gel berkonsentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkonsentrasi tinggi. Buffer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam buffer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam buffer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi moleul protein sangat lambat.
3. Medium penyangga
Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adala bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996).
Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil akan berpindah lebh bebas di dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam
migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi penyusun gel oliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid.
4. Kekuatan voltase
a. Voltase yang dipakai rendah (100-500 volt), kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan.
b. Voltase yang digunakan tinggi (500-10000 volt), mobilias molekul meningkat secara lebh tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai selalu harus searah (bukan bolak-balik).
5. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperature tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperature rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya.
2.2 Elektroforesis Gel
Elektrfoforesis gel digunakan untuk memisahkan atau melihat kemurnian DNA tau protein yang tidak bisa diperoleh dengan metode lain seperti gradient setrifugasi. Media yang banyak dipakai dalam proses pemisahan ini adalah agarosa atau akrilamid. Agarosa digunakan untuk memisahkan molekul-molekul yang lebih besar karena memiliki ukurun partikel yang lebih besar. Sehingga daya pisah dari agarosa (resolusi) lebih kasar (lebih lemah) dibandingkan akrliamid. Akrilamid memiliki ukuran partikel yang lebih halus sehingga daya pemisahannya lebih baik.
Elektroforesis melalui gel agarosa atau poliakrlamid merupakan teknik yang sederhana, cepat, dan dapat memisahkan molekul yang diingnkan dari matriksnya yang tidak dapat dilakukan oleh prosedur lainnya, seperti sentrifugasi gradient. (David G. Watson, 2007).
Elektroforesis protein bisa menggunakan metode elektroforesis gel poliakrilamid atau lektroforesis gel poliakrilamid-SDS(SDS-PAGE). Perbedaannya kalau elektroforesis gel poliakrilamid adalah akrilamid yang merupakan suatu monomer yang jika ada radikal bebas, biasanya diberikan oleh
ammonium persu;fat dan distabilkan oleh TEMED, terjadi reaksi berantai sehingga monomer terpolimerisasi menjadi rantai panjang. Gel poliakrilamid dibuat dengan cara menuangkan antara dua lempeng kaca yang dipisahkan dengan pembatas dengan ketebalan tertentu. Gel poliakrilamid beukuran dari 5 cm sampai 50 cm panjangnya tergantung pada keperluannya dan dilakukan elektroforesis dengan cara vertical. (David G. Watson, 2007).
Sedangkan kalau elektroforesis gel poliakrilamid SDS (SDS-PAGE) yaitu protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran massanya dengan elektroforesis gel poliakrilamid dengan sitem gerak. Sebelumnya campuran protein dipanasi dengan narium dodesil sulfat (SDS), suatu dtergen anionic untu menyelubungi molekul protein. Penyelubungan ini menyebabkan interaksi non kovalen terganggu sehingga molekul protein dalam struktur primer. Anion SDS berikatan dengan rantai utama dengan rasio satu molekul SDS untuk dua residu asam amino. (David G. Watson, 2007).
Merkaptoetanol atau ditriotreitolm juga ditambahkan untuk menduduki ikatan disulfide. Kompleks SDS dengan protein terdenaturasi mempunyai jumlah muatan negative yang sebanding dengan ukuran protein. Muatan negative yang terdapat pada ikatan SDS ini jauh lebih besar daripada muatan pada protein asli. Kompleks protein SDS kemudian dielektroforesis, sehingga semua molekul protein bergerak menuju kutub positif. Ketika elektroforesis selesai, protein dalam gel dapat ditempatkan oleh pewarnaan dengan perak atau zat warna seperti coonassie blue, yang menampakkan beberapa pita. (David G. Watson, 2007).
BAB III
METODE PRAKTIKUM 3.1 Tempat dan Waktu Praktikum
Tempat : Laboratorium Biologi Fakultas Farmasi Universitas Jember
Hari, Tanggal : Jumat, 3 Maret 2017 Pukul : 07.00-12.20 WIB 3.2 Alat dan Bahan
a. Alat UV Transilluminator Neraca Analitik Erlenmeyer Microwave Mikropipet Mikrotip Tabung mikrosentrifus Cetakan gel Alat elektroforesis b. Bahan Loading dye Ekstrak DNA
DNA ladder 1 kb sebagai marker Agarosa
TBE 1x (tris baric EDTA) EtBr (ethidium bromide)
3.3 Prosedur Kerja
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini yaitu melakukan elektroforesis DNA dan ekstraksi. Elektroforesis DNA digunakan untuk memisahkan atau melihat kemurnian DNA. Media yang digunakan adalah gel agarosa. Gel agarosa digunakan untuk memisahkan molekul – molekul yang besar, karena memiliki ukuran partikel yang besar. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Teknik elektroforesis yang digunakan adalahelektroforesis horizontal karena menggunakan gel agarosa yang diletakkan pada alat elektroforesis secara horizontal dan teknik ini difungsikan untuk analisais DNA. Selain itu pada praktikum kali ini digunakan senyawa marker. Senyawa marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi. Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi. Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda HindIII. Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb (Birren and Lai, 1993; Martin, 1996).
Fungsi alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum elektroforesis gel agarosa ini yaitu :
a) Loading dye berfungsi sebagai pemberat agar tidak keluar dari sumuran. b) Etidium bromida sebagai pewarna DNA yang akan menyisip di sela-sela
basa nukleotida.
c) UV transiluminator untuk visualisasi pewarnaan DNA didalam gel agarosa.
d) Aquades sebagai pelarut
e) EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid) sebagai pe-non aktif DNA f) Sisir elektroforesis untuk membuat sumuran pada gel agarosa
g) Mikropipet untuk mengambil dan menghomogenkan sampel DNA dan loading dye
h) Kertas Parafilm untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan loading dye
i) Sarung tangan untuk melindungi terkena DNA-se yang dapat merusak DNA
Tahap pertama dalam elektroforesis DNA adalah pembuatan gel agarosa yang sudah dibuat pada praktikum sebelumnya, yaitu dengan menimbang 0,4 gram agarosa dan dilarutkan dalam 40 mL buffer TBE 1x. Lalu dipanaskan sampai agarosa larut sehingga didapat gel agarosa 1%, lalu ditambahkan 1 µl EtBr. Setelah itu di tuangkan pada cetaan agarosa dan dibiarkan hingga memadat. Setelah gel memadat cetakan dan sisir dilepaskan lalu cetakan ditempatkan dalam wadah yang berisi buffer TBE 1x.
Tahap selanjutnya yaitu proses elektroforesis DNA, yaitu dengan memindahkan gel agarosa ke tangki elektroforesis yang sudah berisi buffer TBE 1x. Selanjutnya memipet 5µl sampel hasil isolasi DNA yang telah dicampur dengan 2 µl loading buffer (6x) kedalam salah satu sumur dan 6µl marka DNA 1 kb ke dalam sumur lainnya. Selanjutnya elektroforesis dijalankan pada 80 V, 400 mA kurang lebih selama 60 menit. Setelah elektroforesis selesai gel hasil elektroforesis diamati dibawah sinar UV.
Pada pengamatan dibawah sinar UV senyawa marker tidak terlihat. Hal ini kemungkinan terjadi karena tailing. Tailing atau terjadi pengekoran pada hasil elektroforesis sehingga tidak bisa diamati atau diukur perpindahannya. Kemungkinan lain adalah bocornya gel agarosa pada sumuran yang berisi marker sehingga konsentrasi marker berkurang. Sedangkan kelompok B3 hasil elektroforesisnya dapat diamati, oleh karena itu kelompok kami menggunakan data kelompok B3 sebagai pembanding. Diperoleh hasil pengamatan analisis DNA kromosom pada kelompok B3 yaitu jumlah keberadaan DNA pada pita 1 diperoleh 1 pb dengan log = 0 , jarak migrasi marka = 0,2167 , jarak migrasi sampel 0,2167. Pada pita 2 diperoleh 2pb dengan log= 0,301 , jarak migrasi marka 0,95 dan jarak migrasi sampel 0,55. Sehingga didapatkan persamaan regresi pada pita 1 y=2,436x+0,2167 dan didapatkan hasil log BM dari DNA = 1 pb,
sedangkan pada pita 2 diperoleh persamaan regresi y=2,43x+0,2167 dan diperoleh log BM dari DNA = 1,37 pb.
BAB V KESIMPULAN
1. Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik)
2. Hasil praktikum senyawa marker tidak tampak sehingga menggunakan data kelompok B3 didapatkan persamaan regresi pada pita 1 y=2,436x+0,2167 dan didapatkan hasil log BM dari DNA = 1 pb, sedangkan pada pita 2 diperoleh persamaan regresi y=2,43x+0,2167 dan diperoleh log BM dari DNA = 1,37 pb.
3. Tidak tampaknya pita marker dapat terjadi karena kemungkinan adanya tailing dan kebocoran pada gel agarosa.
DAFTAR PUSTAKA
Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed Field Gel Electrophoresis: A Ppractical Guide. Academic Press, Inc., San Diego
David G. Watson, 2007. Analisis Farmasi. Jakarta : EGC
Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).
Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4th ed. Prentice Hall, Englewood cliffs: xvi + 779 hlm.
Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech Publisher:Rijeka,Croatia.
Martin, R. 1996. Gel Electrophoresis: Nucleid Acids. Bros Scientific Publishers Ltd., Oxford
LAMPIRAN
Agarosa ditimbang 0,4 g
Agarosa yang sudah ditimbang diletakkan dalam gelas ukur
Dituang 8 ml buffer TBE pada gelas ukur
Diadkan 40 ml dengan aquabidest steril
Dilakukan pemanasan di atas hot plate sampai semua agarosa larut dengan cara menuang campuran buffer TBE dan aquabidest steril ke dalam agarosa
Kemudian dimasukkan dalam larutan agarosa dan dihomogenkan dengan cara menggoyang gelas ukur
Larutan agarosa yang sudah ditambah EtBr dituang ke dalam cetakan dan ditunggu hingga memadat
Penutup cetakan dan sisir dilepaskan setelah gel memadat
Pindah gel dalam tangki elektroforesis
hingga seluruh gel terendam
Simpan dalam lemari pendingin untuk digunakan selanjutnya
Agarosa dipindah ke dalam alat UV transilluminator
Dipipet 2µl loading buffer kemudian diletakkan dalam mika
Dipipet sampel 5µl hasil isolasi DNA genom
Kemudian diresuspensi dengan loading buffer. Setelah diresuspensi dipipet sebanyak 7µl
Dimasukkan ke dalam salah satu sumur dan 6µl marka DNA 1kb ke dalam sumur lainnya
Elektroforesis dijalankan pada 80V, 400 mA selama 60 menit
Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV
