Immunohistochemistry Staining CD4, Kolagen & P53 / Pengecatan imunohistokimia.

(1)

Immunohistochemistry Staining

CD4, Kolagen & P53

Arya

DOSENDOKTOR

(2)

IHC

Diambil dari kata “immune”  proses yg menggunakan antibody dan “histo” menunjukkan jaringan secara mikroskopis

Adanya antigen spesifik didapat antibodi(Ab)

spesifik Ab primer dilabel atau sudah berlabel 

pengecatanAg bisa diamati

Pada sel terdapat berbagai macam struktur protein yg AG spesifik baik tingkat selular maupun tingkat molekuler.

Contoh protein spesifik selular : LCA, Vimentin, CD 20, CD 3 Contoh protein spesifik molekuler: RE, RP, Her 2,p53, Bcl 2

- Tahu jenis protein yg akan dideteksi - Tahu lokasi protein tersebut

- Kalau pabrik sudah membuat Ab primernya - Kalau lab.PA punya kemampuan pem.IHC

Label ada 2 macam:

- _fluorescent - enzym / peroksidase

Label fluorescent tak perlu dicat lagi

Label enzim perlu cat chromogen : DAB , AEC Untuk mengukur dan

mengidentifikasi

karakteristik seluler spt proses proliferasi sel, apoptosis sel,

mengetahui distribusi dan lokasi biomarker atau protein terekspresi pada jaringan tubuh

2

(3)

Metode imunohistokimia

Merupakan metode Imunohistokimia tertua. Memanfaatkan metode reaksi antara antibodi primer yang telah diberi

label enzim dengan antigen pada jaringan. Keunggulan

metode ini  cepat krn hanya menggunakan satu antibodin dan reaksi nonspesifik dapat diminimalisir. Kelemahan  krn hanya menggunakan satu label antibodi  amplifikasi sinyal/pewarnaan kurang memadai dan mulai kurang sensitif untuk permintaan diagnosa akhir2 ini

Direct

Terdapat beberapa metode yang digunakan diantaranya adalah

Two step indirect method

Prinsip utama metode ini  antibodi primer yang dikatkan dgn antigen, antibodi sekunder  diikatkan pada antibodi primer  dilanjutkan dengan larutan substrat kromogen.

Metode ini lebih serbaguna dibanding metode direct  lebih

banyak jenis antibodi primer dr spesies yg sama yg dpt digunakan bersama dengan antibodi sekunder yg terkonjugasi, serta lbh

sensitif krn beberapa antibodi sekunder dpt bereaksi terhadap beberapa epitop primer shg memperkuat hasil.

Three step indirect method

Metode ini melanjutkan metode sebelumnya, antibodi tersier yg dikonjugasi enzim ditempelkan pd antibodi sekunder. Antibodi tersier ini harus spesifik terhadap antibodi sekunder. Kedua antibodi tsb juga harus dikonjugasikan pd enzim yg sama.

Penambahan lapisan ketiga ini memperkuat hasil krn lbh banyak antibodi yg terikat, jg sangat membantu pada pewarnaan pada epitop (epitop mjd lbh banyak)

ABC,

LAB/LSAB,

Avidin-Biotin-Complex (ABC) menggunakan afinitas terhadap molekul avidin- biotin oleh tiga enzim peroksidase. Situs pengikatan bbrp biotin dlm

molekul avidin tetravalen bertujuan untuk amplifikasi dan merespon sinyal yang disampaikan oleh antigen target.

Labelled avidin biotin (LAB), 4-8 kali lebih sensitif dr ABC. Avidin sekarang tlh tergantikan oleh streptavidin shg menjadi metode baru yaitu labelled streptavidin-biotin (LSAB) dan modifikasi lain dr ABC seperti CSA.

(4)

(5)

Fixation

• Fiksasi sangat penting dalam menentukan outcome

reaksi antigen-antibodi

• Manfaat fiksasi :

– Menjaga keutuhan komponen sel (protein struktural dan

soluble)

– Mencegah autolisis dan perubahan penyusun sel (antigen

dan enzim)

– Stabilisasi material sel dari akibat prosedur tindakan – Fasilitasi pengecatan konvensional dan imunostaining

• Ada dua macam cara fiksasi

– Fiksasi cross linking (non koagulasi) – Coagulating fixatives

(6)

Cross-linking Fixation

• Gold standard :

formaldehid

• Mekanisme dasar fiksasi :

pembentukan addition

product antara formalin

dan grup amino reaktif yg

tak bermuatan (-NH atau

NH2) membentuk cross-link

• Jika terdapat hidrogen

reaktif kedua maka akan

terbentuk methylene

(7)

Antigen retrieval

• AR bertujuan untuk optimalisasi imunoreaksi

• Tahap fiksasi akan mengubah struktur tersier protein

(antigen) sehingga sulit bereaksi dengan antibodi

• Metode untuk memulihkan perubahan akibat fiksasi

• AR terutama diperlukan pada jaringan yang difiksasi dengan

cross-link fixative

• Tanpa AR, Ab poliklonal lebih mudah deteksi Ag dibanding Ab

monoklonal

• Prosedur AR yang paling banyak dipakai – Metode enzimatik

– Metode heat-based retrieval

– Cara lain : inkubasi slide dalam larutan alkali kuat, urea, larutan asam, borohidrid, larutan sukrosa

(8)

A.R enzimatik

• Huang et al mengenalkan metode protease-induced

epitope retrieval (PIER)

• Enzim yang dipakai : tripsin, proteinase K, pronase, ficin,

pepsin

• Efek dipengaruhi : konsentrasi dan tipe enzim,

parameter inkubasi (waktu, suhu, pH), dan durasi fiksasi

• Waktu digesti enzimatik berbanding terbalik dengan

lama fiksasi

• Kelemahan metode PIER

– Rendahnya jumlah antigen – Perubahan morfologi jaringan – Destruksi epitop

(9)

A.R heat-based

• Heat-induced epitope retrieval (HIER)

dikenalkan oleh Shi et al

• Konsep : reaksi kimia antara protein

dan formalin dapat dipulihkan/dibalik

dengan pemanasan atau hidrolisis

dengan alkali kuat

• Pemanasan dapat membuka epitop

melalui hidrolisis cross-link metilen

• Pemanasan suhu tinggi (100°C) dengan

durasi singkat (10 menit) akan

mendapat hasil yang lebih baik

dibanding pemanasan suhu rendah

dengan waktu yang lama

(10)

Imunohistokimia CD4

BACKGROUND:

Setelah diketahui bahwa limfosit dapat dibagi menjadi sel B dan sel T, diketahui jg bhw sel T berfungsi sebagai helper, supresor dan sel

sitotoksik. Molekul CD4 mrp glikoprotein nonpolimorfik anggota superfamili gen Ig yg berekspresi pada permukaan membran subpopulasi sel T.

Molekul CD4 bertindak sebagai ko-reseptor dan berikatan dengan region

nonpolimorfik molekul MHC kelas II. SOURCES/CLONES:

Ancell (QS4120), Becton Dickinson (Leu3), Biodesign (13B8.2, BL4),

Biogenesis (T138A), Biotest (T4, TT1), Coulter (T4), Cymbus Bioscience (MEM115), Dako (MT310), GenTrak, Immunotech (BL4,13B8.2), Oncogene (VIT4), Sanbio (BL-TH4), MEM115), Seralab, Serotec (B-A1, B-F5, B-B14, 13B8.2) and Pharmingen (RM-4-4, RM-4-5)

(11)

Imunohistokimia CD4

APPLICATION:

Antibodi CD4 berguna utk identifikasi Thelper/sel inducer, memeriksa limfosit reaktif (karena terdapat pada 45% limfosit darah perifer),

kelainan limfoproliferatif dan monosit. Juga terdapat pada 80% thymocyt. Walaupun juga diekspresikan pada monosit/makrofag, sel langerhans dan

sel dendritik lainnya, Cd4 tidak diekspresikan oleh sel B. ADDITIONAL INFORMATION:

Positive Control: Tonsil, spleen, thymus

Negative Control: Omit primary antibody, isotype control or absorption

control

Standard Method: ABC Method or LSAB Method.

Chromogen Substrate: DAB (3,3'-DIAMINOBENZIDINE) Counterstain: Mayer's Hematoxylin

(12)

• Gambar A dan B negative control

(13)

Imunohistokimia Kolagen

BACKGROUND:

Lamina densa mrp lapisan setebal 40-60 nm salah satu pembentuk lamina basalis selain lapisan lamina lucida. Kolagen tipe IV terdapat dibagian lamina densa, bila menggunakan mikroskop elektron bisa teramati pada lamina

densa dan lamina lucida.

SOURCES/CLONES:

Accurate (COL-4), Axcel (CIV22), Biodesign (1o42, MC4HA), Biogenesis (2D8/29), Biogenex (CIV22), Biotec (XCD02), Dako (CIV22), ICN

(polyclonal, 1042), Immunotech (CIV22), Milab, Sanbio (SB11), SeraLab (1042) and Serotec (CIV22, PHM-12)

(14)

Imunohistokimia Kolagen (tipe IV) APPLICATION:

Diagnosis IHC kolagen tipe IV kebanyakan terpusat pada tumor invasif pada lamina basalis, sebagian tumor epitelial. IHC kolagen tipe IV juga digunakan utk membedakan hiperplasia sel C dengan karsinoma medular pada tiroid.

ADDITIONAL INFORMATION: Positive Control: Skin, kidney

Negative Control: Omit primary antibody, isotype control, absorption control Standard Method: ABC Method atau LSAB Method

Chromogen Substrate: DAB

(15)

(16)

Imunohistokimia P53

BACKGROUND:

P53 berfungsi utk memprogram kematian sel, diferensiasi sel dan

mengontrol mekanisme siklus sel. Terdapat pd nukleus (terikat dgn DNA), pd lengan pendek kromosom 17. P53 mewakili sebagai molekul yg paling sering berubah dlm perubahan genetis pada kanker.

SOURCES/CLONES:Biodesign (Pab1801, 53-12), BioSource, Bioprobe

(BP53-12), Chemicon, Cymbus Bioscience, Medac (CM-1), Dako (DO-7),

GibcoBRL, Immunotech, Novocastra, Oncogene (Pab1801, Pab421, Pab122), Oncor, Pharmingen (G59-12), Serotec (Pab1801, BP53-12) and Signet.

Antibodies to mutant p53

Biogenesis, Chemicon and Oncogene (Pab240)

Antibodies to Wild-Type p53

(17)

Imunohistokimia P53

APPLICATION:

Deteksi P53 berdasarkan peningkatan konsentrasi protein pada tingkatan yg dpt terdeteksi. Umumnya, frekuensi hasil pengecatan positif sejalan dgn tumor yg disertai mutasi pada pemeriksaan sekuensing DNA. Analisis P53 pada kondisi neoplastic atau preneoplastik merupakan alat yg kuat dlm menyediakan informasi molekuler pd proses onkogen serta kemampuannya utk mendeteksi bentuk abnormal pada protein jaringan.

ADDITIONAL INFORMATION:

Positive Control: Skin cancer, tumors

Negative Control: Omit primary antibody, isotype control, absorption control Standard Method: ABC Method atau LSAB Method

Chromogen Substrate: DAB

(18)

• c-erbB2 staining is positive in (A) and negative in (B). p53 staining is

positive in (C) and negative in (D). Slides were counterstained with Mayer's hemalum solution. Magnification, ×100

(19)