BAB III TEKNIK ASEPTIS
E. Hal-hal penting dalam pembuatan media
82 Media dasar tanpa nutrisi (non-nutrient basal media); berfungsi untuk berbagai keperluan pendukung pertumbuhan mikroorganisme seperti pelapisan Chitin agar menggunakan media chitin yang dilarutkan pada Salt agar.
E. Hal-hal penting dalam pembuatan media
83 dan akan mendesak keluar dari mulut wadah dan juga membuat kerak pada dasarnya.
4. Ketebalan agar dan luas cawan yang digunakan
Media agar yang sangat tipis ketebalannya masih memungkinkan mikroorganisme untuk tumbuh (yang mungkin akan berpengaruh kepada ukuran koloni) dan nutrisi media yang tipis masih cukup memenuhi kebutuhan. Namun ketebalan media lebih mempengaruhi faktor teknis dalam penanaman seperti ketahanan agar saat menerima tekanan spreader atau saat di goresloop dan kehilangan air karena menguap. Namun sebaliknya media padat yang terlalu tebal tentu sangat memboroskan. Volume yang cukup untuk cawan petri diameter 9 cm adalah antara 12-15 ml media.
5. Pengaturan pH
pH sebaiknya diukur sebelum sterilisasi pada suhu 25°C sesuai ketentuan pH menggunakan pH meter. Sehingga setelah proses sterilisasi media akan memiliki pH sesuai persyaratan (± 0,2 pH unit).
Jika pengaturan pH diperlukan maka dapat diatur dengan larutan steril sodium hydroxide (NaOH) 40 g/l atau hydrochloric acid (HCl) 36,5 g/l. Setelah disterilisasi pH sebaiknya dicek kembali dengan sedikit menuang sampel media steril.
6. Pencairan kembali media agar
Pencairan kembali media agar steril dapat dilakukan pada waterbath suhu 47-50°C dengan waktu minimal supaya untuk menjaga kualitas media. Sebaiknya tidak overheating, angkat segera setelah semuanya mencair dan digunakan tidak melebihi waktu simpan 4 jam . 7. Penuangan media ke dalam cawan atau tabung
Keseragaman volume sangat dibutuhkan dalam pendistribusian media untuk memenuhi spesifikasi metode yang dipakai. Untuk media cair yang dituang ke tabung-tabung maka sebaiknya volume yang dipindahkan lebih besar dari pada volume yang dipersyaratkan. Proses sterilisasi dapat mengurangi volume media sebesar 0,1-0,3 ml sehingga
84 diperlukan penakaran lebih dari yang dipersyaratkan.
Misalnya peptone diluents yang menurut metode tertentu memiliki spesifikasi volume 9±0,2 ml maka sebaiknya pipet diatur pada 9,2 ml sehingga setelah disterilisasi volume akhir masuk dalam kisaran spesifikasi.
Keseragaman penuangan volume yang sama pada cawan petri dapat diperoleh dengan cara memasukkan media padat yang telah larut ke dalam tabung-tabung sebelum disterilisasi sesuai volume yang dibutuhkan. Kemudian media steril dalam tabung (sebelum agar memadat) disebarkan ke setiap cawan (Prescott & Harley, 2002:78). Cara lainnya adalah menggunakan media dispenser (glass repeating dispenser) seperti yang telah dijelaskan pada Bab Pengenalan Alat. Terkadang demi waktu dan efisiensi, banyak praktisi yang langsung menuang media padat dari botol atau erlenmeyer langsung ke dalam cawan yang tentu saja membutuhkan keahlian dan ketepatan intuisi dalam membaginya.
Penuangan media sebaiknya tidak dilakukan dalam keadaan panas >50OC supaya tidak terjadi kondensasi berlebihan pada tutup cawan. Untuk mencegah kondensasi maka media siap tuang didinginkan (dijaga) pada suhu 50OC selama 30 menit kemudian dituang. Pembakaran mulut tabung/Erlenmeyer sebaiknya dilakukan untuk mencegah kontaminasi.
Pengeringan media cawan yang telah dituang dapat dilakukan dengan membuka tutup cawan pada LAF dan bagian permukaan media menghadap ke bawah supaya kondensasi air yang berada pada cawan petri hilang. atau keringkan pada oven dengan suhu 25-59OC.
Pengeringan sebaiknya dilakukan jangan terlalu lama, overdrying mengakibatkan media menjadi retak-retak.
8. Pemyimpanan media jadi
Media jadi pada cawan yang telah siap pakai sebaiknya disimpan dengan posisi terbalik dan ditumpuk tidak lebih dari tiga cawan atau dapat menggunakan petri plate storage holder. Media pertumbuhan sebaiknya digunakan fresh setelah dibuat, tetapi adakalanya dibutuhkan
85 persiapan yang membuat media pertumbuhan yang sudah jadi harus disimpan.
Waktu penyimpanan media jadi sangat beragam. Media jadi disimpan pada suhu 5±3°C dan disarankan untuk disimpan tidak melebihi 2-4 minggu untuk media cawan dan 3-6 bulan untuk media cair. Media yang ditambah suplemen sebaiknya dipakai pada hari yang sama saat pembuatan.
Terdapat juga bahan dapat berubah menjadi beracun ketika terpapar cahaya seperti beberapa pewarna (dye). Dengan alasan inilah terdapat petunjuk penyimpanan media pada keadaan gelap (Corry et al., 2003:388). Media jadi sebaiknya disimpan dalam suatu kemasan yang berguna untuk meminimalisasi kehilangan air dalam media agar, melindungi dari cahaya dan juga melindungi dari kontaminasi. Secara umum plastik tahan panas cocok untuk membungkus media cawan (tidak peka cahaya) yang telah jadi. Pada keadaan terbungkus inilah media dapat disimpan atau dipindahkan keluar dari kondisi aseptis. Media padat yang disimpan terlalu lama pada suhu ruang akan kehilangan kadar airnya sehingga media semakin mengeras, menipis, pecah-pecah dan jika kehilangan semua air maka akan menjadi kerak di cawan petri. Penyimpanan pada suhu refrigerator lebih dapat mempertahankan kandungan air dalam media agar. Pengecekan sterilitas media dapat mengacu kepada tabel sterilitytesting untuk menguji kualitas media sebagaimana berikut:
Tabel 2. Sterility testing kualitas media
Suhu uji/penyimpanan inkubasi Waktu minimum uji sterilitas 4-8 °C
20-25 °C 35-37 °C
10-14 hari 2-5 hari 48-72 am
86 9. Perlakuan untuk media kultivasi anaerob
Optimalisasi pertumbuhan mikroorganisme anaerob obligat dapat dilakukan dengan menurunkan potensial redoks (Eh) media sebelum diinokulasikan. Reduksi ini dapat dilakukan saat preparasi media, kondisi ini dijaga pada saat penyimpanan dan sebisa mungkin saat inokulasi. Teknik khusus ini dinamkan pre-reduced anaerobically sterilized (PRAS) yaitu dengan cara:
Menghilangkan oksigen terlarut dengan memanaskan hingga mendidih.
Menambahkan cystein
Flushing dengan gas bebas oksigen dan menyimpannya pada wadah dengan gas bebas oksigen.
Media ini sebaiknya mengandung indikator Eh yaitu resazurin yang akan berubah menjadi tidak berwarna ketika terreduksi. Jika oksidasi terjadi maka media berubah menjadi pink yang menandakan bahwa media sebaiknya tidak dipakai. Cystein juga dapat menghambat beberapa enzim proteolitik, oleh karena itu jangan menambahkan cystein jika akan melakukan uji mengenai enzim tersebut.
87 Tabel 3. Trubleshooting kesalahan dalam pembuatan media
Masalah Kemungkinan kesalahan
Agar tidak memadat overheating selama preparasi
pH rendah yang menyebabkan terjadinya hidrolisis
kesalahan penimbangan agar agar tidak larut sempurna
komposisi tidak diaduk dengan rata pH tidak sesuai overheating selama preparasi
kualitas air yang rendah kontaminasi larutan kimia lain
pengukuran pH tidak pada suhu yang disarankan
kesalahan pada pH meter buruknya kualitas medium Warna tidak normal overheating selama preparasi
kualitas air yang rendah kesalahan pengukuran pH kontaminasi larutan kimia lain buruknya kualitas medium Terbentuknya presipitat /
endapan overheating selama preparasi
kualitas air yang rendah kesalahan pengukuran pH kontaminasi larutan kimia lain buruknya kualitas medium
Produktivitas yang rendah kesalahan pada penimbangan atau penambahan suplemen
residu senyawa toksik pada alat gelas atau air overheating selama preparasi
buruknya kualitas medium kualitas air yang rendah
Selektivitas yang rendah kesalahan penambahan suplemen suplemen terkontaminasi kesalahan penimbangan buruknya kualitas medium overheating selama preparasi kontaminasi kesalahan sterilisasi
kesalahan teknik aseptis suplemen terkontaminasi
88