Buku ini menyajikan berbagai teknik analisis mikrobiologi sebagai kunci dasar berbagai tinjauan kehidupan mikroba. Sebagai bahan ajar, buku ini masih sangat jauh dari kesempurnaan, namun sebagai upaya mengantisipasi perkembangan mikrobiologi dalam kurikulum biologi, keberadaan buku ini dapat dijadikan sebagai sumber rujukan dalam pembelajaran mikrobiologi.
PENDAHULUAN
Ruang Lingkup Mikrobiologi Analitik
Tujuan Analisa Mikrobiologi
4 2 rencana kelas; yaitu rencana pengambilan sampel untuk menentukan apakah suatu sampel memenuhi kriteria mikrobiologi atau tidak. Rencana tiga kelas ini umumnya digunakan untuk jenis mikroorganisme indikator yang tidak berbahaya atau patogen seperti uji TPC, koliform, dll.
PREPARASI DALAM ANALISA MIKROBIOLOGI
Ruang Pengerjaan Analisa Mikrobiologi
- Ruang tidak steril
- Ruang semi steril
- Ruang steril
Kamar Mandi/WC; Laboratorium analisis mikrobiologi harus selalu berlokasi di lingkungan yang bersih untuk mencegah kontaminasi mikroorganisme. Satu-satunya ruangan di laboratorium analisis mikrobiologi yang benar-benar steril adalah ruang budidaya (inokulasi).
Alat-Alat dalam Analisa Mikrobiologi
Peralatan penyaring dan kertas membran penyaring; Alat ini digunakan untuk proses sterilisasi secara mekanis (dengan cara filtrasi). Dispenser media (dispenser kaca berulang); Alat yang dapat dipasang pada mulut Erlenmeyer ini digunakan untuk membagi/.
Keselamatan Kerja dalam Analisa Mikrobiologi
Limbah kimia hasil percobaan harus dibuang dengan cara yang benar agar tidak mencemari lingkungan. Limbah B3 yang berasal dari bahan kimia kadaluarsa, tumpahan, kemasan bekas dan sisa produk yang tidak memenuhi spesifikasi (seperti pada lampiran I tabel 3 PP 85/1999).
TEKNIK ASEPTIS
Pengertian, Tujuan dan Macam-macam Sterilisasi
Senyawa kimia yang paling banyak digunakan sebagai desinfektan (senyawa yang dapat merusak sel) antara lain CuSO4, AgNO3, HgCl2, ZnO, alkohol dan campurannya. Disinfektan adalah bahan kimia yang digunakan untuk mendisinfeksi benda mati seperti permukaan. Peralatan penyaring juga dapat digunakan untuk menghitung mikroorganisme dengan menggunakan prinsip yang sama seperti sterilisasi filtrasi.
Sementara itu, ISO merekomendasikan penggunaan filter 0,2µm dan mencuci kertas membran setelah digunakan untuk melarutkan zat yang tersisa pada kertas membran seperti protein dan antibiotik. Pasteurisasi merupakan teknik sterilisasi yang sering digunakan untuk larutan yang mudah rusak bila terkena suhu tinggi, lebih cocok untuk susu dan produk susu.
Sterilisasi Ruang Kerja
Sterilisasi Medium
Seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, kontaminasi dapat terjadi pada setiap tahap budidaya, dan sumber kontaminasi dapat berasal dari eksplan tanaman, organisme kecil yang masuk ke dalam media, alat yang tidak steril, dan lingkungan kerja yang kotor, sehingga harus dilakukan prosedur aseptik untuk mengatasi kontaminasi. . Sedangkan media yang tidak tahan terhadap sterilisasi autoklaf (seperti media yang mengandung protein telur) sebaiknya disterilkan dengan teknik inspeksi. Bahan yang tidak tahan panas seperti larutan antibiotik, vitamin atau karbohidrat disterilkan menggunakan teknik filter membran yang kemudian ditambahkan ke media setelah didinginkan hingga suhu 50°C.
Bekerja Tanpa Kontaminasi
Dalam pengambilan sampel, bakteri yang masuk ke dalam wadah sampel harus benar-benar berasal dari sumbernya, bukan dari lingkungan sekitar. Sampel dapat diambil dengan pinset, spatula atau alat lainnya kemudian dimasukkan ke dalam wadah steril. Untuk pengambilan sampel daging sebaiknya memilih daging yang tidak bersentuhan langsung dengan udara (terletak di permukaan) dan jarang dipegang dengan tangan, dengan memperhatikan aliran udara yang ada.
Cairan pengumpul dapat berupa air steril atau media pertumbuhan (pepton) dan setelah pengambilan sampel selesai, cairan ini dapat dikultur untuk menghitung mikroorganisme yang ada dengan menggunakan metode yang sesuai. Untuk mengetahui jumlah mikroorganisme di luar pangan, misalnya daging sapi, ayam, atau ikan, pengambilan sampel dapat dilakukan dengan metode usap.
Pengertian dan dan Fungsi Media
Nama-nama Media
Ada juga media yang komposisinya sama namun namanya berbeda karena diproduksi oleh perusahaan berbeda. Misalnya, Trypticase™ Soy Agar diproduksi oleh BBL (BD Diagnostic Systems), Tryptone Soy Agar diproduksi oleh Oxoid Unipath, dan Tryptic SoyAgar diproduksi. Media yang belum mempunyai nama resmi biasanya diberi nama sesuai dengan organisme sasarannya, misalnya Bacillus stearothermophilus Broth.
Bahan-bahan Media Pertumbuhan
- Sumber nutrisi
- Komposisi media pertumbuhan
Namun hampir semua mikroorganisme dapat menggunakan fosfat anorganik yang ditambahkan langsung ke media seperti kalium fosfat, natrium fosfat dll. Itu; merupakan bahan yang paling umum digunakan sebagai bahan pembentuk gel pada media yang terbuat dari ekstrak alga. Komponen selektif; Bahan yang berfungsi menghambat pertumbuhan mikroorganisme non target disebut komponen selektif.
Komponen selektif digunakan dalam media selektif yang berguna untuk mengisolasi bakteri tertentu dari populasi campuran. Agen antimikroba juga dapat digunakan untuk menekan pertumbuhan bakteri tertentu, termasuk ampisilin, kloramfenikol, colistin, sikloheksimid, gentamisin, kanamisin, asam nalidiksat, sulfadiazin, dan vankomisin.
Macam-macam Media
- Berdasarkan sifat fisik
- Berdasarkan Komposisi bahan
- Berdasarkan tujuan
Media selektif (media selektif atau penghambat); berfungsi untuk menumbuhkan mikroorganisme sasaran/yang diinginkan dan menekan pertumbuhan mikroorganisme yang tidak diinginkan (flora latar belakang). Media peremajaan budaya (pelestarian budaya); Media ini tidak boleh terlalu kaya nutrisi sehingga mempercepat pertumbuhan, misalnya Nutrient agar. Media penentuan kebutuhan/kegunaan nutrisi substrat; Media ini berfungsi mendeteksi dan mengidentifikasi kebutuhan suatu substrat oleh bakteri (yang belum diketahui kebutuhan nutrisinya) dengan cara menghilangkan atau mengganti komponen suatu substrat.
Media penyaringan (media penyaringan); Media ini dimaksudkan untuk menggambarkan secara singkat reaksi yang diperoleh dari berbagai substrat seperti produksi H2S di TSI oleh enterobacteria. media uji mikrobiologi vitamin, asam amino dan antibiotik; Media ini memerlukan kontrol ketat selama persiapan untuk memastikan kemurniannya.
Hal-hal penting dalam pembuatan media
Keseragaman penuangan volume yang sama ke dalam cawan petri dapat dicapai dengan menuangkan media padat terlarut ke dalam tabung sebelum disterilisasi sesuai volume yang diperlukan. Untuk mencegah terjadinya pengembunan, media tuang didinginkan (dipertahankan) pada suhu 50°C selama 30 menit kemudian dituang. Media yang sudah jadi disimpan pada suhu 5 ± 3°C dan disarankan tidak melebihi 2-4 minggu untuk media cangkir dan 3-6 bulan untuk media cair.
Media padat yang dibiarkan terlalu lama pada suhu ruangan akan kehilangan kandungan airnya sehingga menyebabkan media mengeras, menipis, retak, dan jika kehilangan seluruh air maka akan terbentuk kerak pada cawan petri. Kesalahan selektivitas rendah saat menambahkan suplemen Suplemen terkontaminasi Kesalahan penimbangan Kualitas media buruk Terlalu panas selama persiapan Kontaminasi Kesalahan sterilisasi.
Penanganan Commercial Dehydrated Media
Pengambilan sampel yang representatif dan terstandar sangat diperlukan untuk memperoleh hasil analisis yang bermakna dan signifikan secara statistik. Pengambilan sampel harus memenuhi persyaratan statistik, berdasarkan kuantitas sampel dan pengulangan. Kelebihannya adalah sederhana, cocok untuk sampel dengan konsentrasi rendah, baik digunakan pada permukaan datar, cocok untuk pengambilan sampel dalam jumlah banyak dan menghemat waktu.
Jadi untuk waktu pengambilan sampel minimal 1 menit dan laju aliran 28,3L/menit, batas atas alat pengambilan sampel air ini adalah 100.000 CFU/m3. Sebaiknya hindari pengambilan sampel di bawah 1 ml, karena hal ini dapat meningkatkan tingkat kesalahan pengecoran (distribusi acak atau homogenitas sel yang kurang seragam dalam sampel).
Ilustrasi Pembuatan Media
SAMPEL DALAM ANALISA MIKROBIOLOGI
Peraturan Umum Pengambilan Sampling
Alat yang Digunakan dalam Sampling
Contoh peralatan yang biasa digunakan antara lain botol kaca, botol plastik, pinset, spatula, pipet, sendok, pisau, gunting, dll. Peralatan berupa wadah penyimpanan harus steril di bagian dalam, sedangkan bagian luarnya diolah dengan senyawa antimikroba seperti etanol, natrium hipoklorit, dll. harus didesinfeksi, sedangkan peralatan pengumpulan harus disterilkan dengan cara yang benar. Botol sampel yang digunakan dapat terbuat dari kaca atau plastik tahan panas dengan ukuran yang sesuai.
Jenis botol yang disarankan adalah botol kaca borosilikat dengan tutup ulir dan sebaiknya bermulut lebar. Jika Anda menggunakan botol plastik, sebaiknya terbuat dari bahan tidak beracun seperti polipropilen yang tahan terhadap autoklaf berulang kali.
Teknik Pengambilan dan Preparasi Sampel Berdasarkan Jenis
- Sampel padat
- Sampel cair
- Sampel udara
5 Cara mengambil sampel tanah, kompos dan lumpur Sampel tanah juga dapat diambil dengan menggunakan bor tanah (bor atau bor tanah). Pembersihan tabung jika digunakan untuk pengambilan sampel dilakukan dengan membilas sisa tanah dengan air, kemudian membilas dengan etanol 75%, kemudian membilas kembali dengan air steril. Teknik pengambilan sampel bahan cair berbeda dengan teknik pengambilan sampel bahan padat, beberapa hal yang harus diperhatikan dalam pengambilan sampel air untuk mikrobiologi:
Keuntungan filter membran gelatin adalah dapat mengurangi kelemahan metode filtrasi dengan mencegah sel mengering selama pengambilan sampel yang lama karena gelatin mempertahankan kelembapannya. Jika frekuensi samplingnya sangat tinggi, tentu media di dalam cup dapat menghemat dana yang cukup besar. Sampel diambil secara aseptik dan pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan kurang lebih sebanyak 25 kali untuk memisahkan sel-sel mikroorganisme yang bergabung.
190 sampel diambil dibawah 1 ml, oleh karena itu sebaiknya diencerkan terlebih dahulu kemudian diambil sampel yang volumenya cukup besar atau menggunakan penyemaian plate atau spread plate.
Daya Tahan Sampel (sample hold time) dan Penyimpanan
Perlakuan pada Sampel Sebelum Diuji
Perlakuan ini dapat berupa penambahan senyawa yang menghambat kerja suatu zat yang mampu membunuh bakteri dalam sampel. Jika zat ini dapat dinetralkan maka jumlah bakteri tidak akan berkurang akibat aktivitas zat tersebut selama masa simpan sampel. 140 Pada sampel air yang mengandung klor, dapat ditambahkan zat deklorinasi berupa natrium tiosulfat (NaS2O3) ke dalam sampel dengan konsentrasi 100 mg/L, misalnya. dalam sampel botol 120 ml, dapat ditambahkan 0,1 ml larutan Na2S2O3 10% (konsentrasi ini menetralkan +/- 15mg/L sisa klorin dan digunakan dalam sampel air limbah).
Jika tidak ditemukan senyawa yang sesuai untuk menghilangkan aktivitas zat antimikroba tertentu dalam sampel, maka diasumsikan bahwa kegagalan dalam mengisolasi bakteri disebabkan oleh zat antimikroba tersebut. Namun perlu Anda waspadai bahwa bakteri yang mampu bertahan lama pada lingkungan yang mengandung antimikroba (yang biasanya terserap) merupakan jenis bakteri yang berpeluang untuk bertahan hidup.
TEKNIK PLATE COUNT (HITUNGAN CAWAN
- Metode Permukaan (Spread Plate)
- Cara Menghitung Koloni
- Standar Penghitungan
- Penghitungan Total Bakteri
- Penghitungan Total Spora Bakteri
- Penghitungan Total Kapang-Khamir
Dari pengenceran yang diinginkan, 1 ml atau 0,1 ml larutan sampel yang telah diencerkan dipipet ke dalam cawan petri dengan menggunakan pipet 1 ml atau 1,1 ml. Disarankan agar waktu antara mulai pengenceran dan penuangan ke dalam cawan petri tidak boleh lebih dari 30 menit. Pada metode ini, untuk memperoleh kondisi steril, terlebih dahulu dituang ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan membeku.
Pipet pengukur sebaiknya ditempatkan dalam kotak baja tahan karat atau aluminium atau wadah berbentuk silinder dengan panjang 40 cm. 155 Pengendalian ini dapat berupa kultur yang telah diolah dan dikompres menjadi sesuatu (misalnya tepung) yang kisaran konsentrasinya diketahui (banyak yang tersedia secara komersial).
TEKNIK FERMENTASI TABUNG BERSERI
Aspek peluang dalam metode MPN
Kaidah pemilihan tabung positif dan cara pelaporannya. 162
TEKNIK MEMBRAN FILTER (MF)
Peralatan pada Teknik Filtrasi Membran (FM)
Cara Kerja
Bagian yang diutamakan sterilitasnya adalah bagian samping alas tunggal/alas penyaring yang akan ditempelkan pada kertas membran dan bagian dalam corong yang akan bersentuhan dengan sampel. Hasil penuangan media agar sebaiknya mempunyai permukaan yang rata agar kertas membran dapat menempel sempurna pada permukaan agar. Diduga media cair dalam jumlah berlebihan dapat mengalir ke permukaan kertas membran dan menghasilkan koloni yang menyebar.
Mengencangkan kertas membran terlalu kencang dapat mengakibatkan kertas membran robek saat diangkat dan menimbulkan lekukan yang dalam. Mengingat kertas membran yang digunakan bersifat hidrofilik, maka bagian bawah corong yang kering (setelah sterilisasi panas) sebaiknya dibasahi dengan air steril agar kertas membran lebih mudah menempel.
Permasalahan yang Umum Terjadi
