HASIL PENGUJIAN DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengujian
4.1.1 Organoleptik
Sampel yang digunakan adalah cairan plasma yang di dapatkan dari Palang Merah Indonesia (PMI) yang diproduksi pada dengan golongan darah.
Tabel 12 Data Organoleptik Plasma
Pemerian Hasil Pengamatan
Bentuk Cair
Warna Kuning
Bau -
Rasa -
4.1.2 Data Verifikasi
a. Data Kurva Kalibrasi
Pada pengujian ini, kurva kalibrasi dibuat sebanyak 8 titik kurva dengan konsentrasi 50 ng/mL; 100 ng/mL; 1000 ng/mL; 2000 ng/mL; 4000 ng/mL; 6000 ng/mL; 8000 ng/mL; 10000 ng/mL. Tabel
Calibration Curve
Cons. (ng/mL)
Std Cons. (ng/mL)
% Dev Curve
50 52,68 5,4
100 90,05 -9,9
1000 892,62 -10,7
2000 2048,95 2,4
4000 4167,10 4,2
6000 5857,34 -2,4
8000 8140,51 1,8
10000 10932,08 9,3
r² 0,9939
b. Data Akurasi dan Presisi
Tabel 14 Data Pengukuran Akurasi dan Presisi
Statistical Variable
Standard Concentration (ng/mL) LLOQ QC LOW QC MED QC High 49,90 149,70 4990,02 7485,03
Measured Data
47,84 146,25 4739,63 7128,78
56,67 159,36 5517,97 7043,28
36,07 133,16 5236,77 7618,48
43,45 151,56 5243,81 7746,00
47,14 131,50 4966,00 7523,29
Within day Mean
46,234 144,366 5140,836 7411,966 Within day (%CV)
16,16 8,27 5,78 4,21
Within day (%Dev)
7,34 3,56 3,02 0,97
4.2 Perhitungan
4.2.1 Penimbangan
4.4 Penimbangan Asam Salisilat BP= 100 %
Kemurnian bakux Bobot Prosedur SA
BP= 100 %
99,90 %x5mg
BP=5,00mg
4.5 Penimbangan Celecoxib
BP= 100 %
Kemurnian bakux Bobot Prosedur CLX
BP= 100 %
99,90 %x5mg BP=5mg
4.2.2 Persamaan Regresi Liniear
Ar ea SA
Ar ea is
Xi (C on s)
Yi (Res pons e)
Wi (1/X
^2) Xi*
Wi Xi- XW, mean
Yi*
Wi Yi- YW, mea n
Swx y
Swx
x CSS
Yi pred
= axi+
b Yi-
Yi predi
c RSS
17 3,7 6
14 48 0,1
8 50 0,011
9998 508
0,00 040 000
0,0 200 00
- 14,10 82021 90
0,000 0047 999
- 0,001 1416 997
0,00 0006 443
0,07 9616 548
0,000 00000 0521
0,011 7322 880
0,000 2675 628
0,0000 00000 0286
23 5,9
14 99 3,4
1 10 0
0,015 7335 790
0,00 010 000
0,0 100 00
35,89 17978 10
0,000 0015 734
0,002 5920 284
0,00 0009 303
0,12 8822 115
0,000 00000 0672
0,016 7267 677
- 0,000 9931 887
0,0000 00000 0986 12
45, 61
12 98 8,4
8 10 00
0,095 9011 370
0,00 000 100
0,0 010 00
935,8 91797 810
0,000 0000 959
0,082 7595 864
0,00 0077 454
0,87 5893 457
0,000 00000 6849
0,106 6274 020
- 0,010 7262 650
0,0000 00000 1151
32 55
15 39 6,8
9 20 00
0,211 4063 295
0,00 000 025
0,0 005 00
1935, 89179 7810
0,000 0000 529
0,198 2647 789
0,00 0095 955
0,93 6919 263
0,000 00000 9827
0,206 5169 958
0,004 8893 337
0,0000 00000 0060 84
39, 66
19 95 2,5 0
40 00
0,422 9875 955
0,00 000 006
0,0 002 50
3935, 89179 7810
0,000 0000 264
0,409 8460 450
0,00 0100 819
0,96 8202 765
0,000 00001 0498
0,406 2961 833
0,016 6914 123
0,0000 00000 0174 10
33 0,7 8
17 45 5,8 2
60 00
0,591 8243 887
0,00 000 003
0,0 001 67
5935, 89179 7810
0,000 0000 164
0,578 6828 381
0,00 0095 417
0,97 8744 762
0,000 00000 9302
0,606 0753 707
- 0,014 2509 821
0,0000 00000 0056 99
14, 87
12 09 2,9 4
80 00
0,819 8891 254
0,00 000 002
0,0 001 25
7935, 89179 7810
0,000 0000 128
0,806 7475 748
0,00 0100 035
0,98 4037 166
0,000 00001 0169
0,805 8545 582
0,014 0345 672
0,0000 00000 0031 17
37 3,6 3
15 81 2,3 8
10 00 0
1,098 7359 272
0,00 000 001
0,0 001 00
9935, 89179 7810
0,000 0000 110
1,085 5943 766
0,00 0107 863
0,98 7219 458
0,000 00001 1785
1,005 6337 457
0,093 1021 815
0,0000 00000 0867 Su
m
0,00 050 137
0,0 321 42
0,000 0065 887
3,163 3455 285
0,00 0593 29
5,93 9455 535
0,000 00005 9625
0,0000 00000 3611 Me
an
64, 108 202
0,013 1415 506
l 15 Perhitungan Persamaan Garis Linear dan Koefisien Korelasi
4.2.2.1Nilai Slope (b) b=Swxy
Swxx b= 0,00059329
5,939455535 b=0,000099890
4.2.2.2Nilai Intersep (a)
a=Yw ,mean−Gradient x Xw ,mean
a=0,0131415506−(0,000099890.64,108202) a=0,0131415506−0,006403768
a=0,006737808
4.2.2.3Nilai Koefisien Korelasi (r)
R2=(CSS−RSS) CSS
R2=(0,000000059625−0,0000000003611) 0,000000059625
R2=0,993943
4.2.3 Akurasi (% Deviasi) Kurva Kalibrasi
% Dev KK 1 = (52,68−50)
50 x100 %=5,4 %
% Dev KK 2 ¿(90,05−100)
100 x100 %=−9,9 %
% Dev KK 3 ¿(892,62−1000)
1000 x100 %=−10,7 %
% Dev KK 4 ¿(2048,95−2000)
2000 x100 %=2,4 %
% Dev KK 5 ¿(4167,10−4000)
4000 x100 %=4,2 %
% Dev KK 6 ¿(5857,34−6000)
6000 x100 %=−2,4 %
% Dev KK 7 ¿(8140−8000)
8000 x100 %=1,8 %
% Dev KK 8 = (10932,08−10000)
10000 x100 %=9,3 % Low Limit of Quantification (LLOQ)
% Dev LLOQ ¿(46,234−49,90)
49,90 x100 %=−7,34 % Quality Control Low
% Dev QCL ¿(144,366−149,70)
149,70 x100 %=−3,56 % Quality Control Medium
% Dev QCM ¿(5140,836−4990,02)
4990,02 x100 %=3,02 % Quality Control High
% Dev QCH ¿(7411,966−7485,03)
7485,03 x100 %=−0,97 %
4.2.4 Presisi
Simpangan Baku (SD) x−´x¿2
¿
¿
∑
¿SD=¿√¿
Koefisien Variasi (%CV)
%CV= SD
%rata−rata x100 % Low Limit of Quantification (LLOQ)
Tabel 16 Data Presisi LLOQ
Perlakukan Konsentari (ng/mL) |� − �̅| |� − �̅|²
1 47,84 1,606 2,579236
2 56,67 10,436 108,910096
3 36,07 10,164 103,306896
4 43,45 2,784 7,750656
5 47,14 0,906 0,820836
� 231,17 25,896 223,36772
�̅ 46,234 5,1792 44,673544
SD=
√
223,367724 %CV=7,47274581446,234 x100 %
¿
√
55,84193 ¿16,162%= 7,472745814
Quality Control Low (QCL)
Tabel 17 Data Presisi QCL
Perlakukan Konsentari (ng/mL) |� − �̅| |� − �̅|²
1 146,25 1,884 3,549456
2 159,36 19,994 224,8200
3 133,16 11,206 125,5744
4 151,56 7,194 51,7536
5 131,50 12,866 165,5339
� 721,83 48,144 571,231356
�̅ 144,366 9,6288 114,24627
SD=
√
571,2313564 %CV=11,95022339144,366 x100 %
¿
√
142,807839 ¿8,27 % = 11,95022339Quality Control Medium (QCM)
Tabel 18 Data Presisi QCM
Perlakukan Konsentari (ng/mL) |� − �̅| |� − �̅|²
1 4739,63 401,206 160966,2544
2 5517,96 377,134 142230,054
3 5236,77 95,934 9203,3323
4 5243,81 102,974 10603,644688
5 4966,00 174,836 30567,6269
� 25704,18 1152,084 353570,9123
�̅ 5140,836 230,4168 70714,18246
SD=
√
353570,91234 %CV=297,30914
5140,836 x100 %
¿
√
88392,72808 ¿5,78 % = 297,30914Quality Control High (QCH)
Tabel 19 Data Presisi QCH
Perlakukan Konsentari (ng/mL) |� − �̅| |� − �̅|²
1 7128,78 283,186 80194,3106
2 7043,28 368,686 135929,3666
3 7618,48 206,514 42648,0322
4 7746,00 345,034 119048,4612
5 7523,29 111,324 12393,03298
Σ 37059,83 1314,744 390213,2036
x̅ 7411,966 262,9488 78042,64072
SD=
√
390213,20364 %CV=312,335238
7411,966 x100 %
¿
√
97553,3009 ¿4,21 % = 312,3352384.2.5 Persyaratan dan Hasil
Tabel 20 Persyaratan dan Hasil Penelitian
No. Parameter Kriteria Hasil
Kurva Kalibrasi
r2 ≥ 0.9900 r2 0,9939
% Dev LLOQ ≤ 20% % Dev LLOQ : 5,4%
No. Parameter Kriteria Hasil
1. % Dev non-LLOQ ≤ 15% % Dev non-LLOQ :
-10,7% - 9,3 %
2. Akurasi
% Dev LLOQ ≤ 20% LLOQ : -7,34%
QCL : -3,56%
% Dev non-LLOQ ≤ 15% QCM : 3,02%
QCH : -0,97%
3. Presisi
% CV LLOQ ≤ 20%
LLOQ : 16,16%
QCL : 8,27%
% CV non-LLOQ ≤ 15% QCM : 5,78%
QCH : 4,21%
Kesimpulan VERIFIKASI MEMENUHI SYARAT
4.3 Pembahasan
Verifikasi metode bioanalisis merupakan metode yang digunakan untuk memastikan atau memvalidasi ulang metode yang digunakan dalam pengujian agar dapat digunakan dan menghasilkan data yang valid. Verifikasi metode ini biasanya akan dilakukan jika metode yang sudah tervalidasi akan digunakan kembali namun terdapat perbedaan pada penggunaan alat maupun reagennya.
Verifikasi metode bioanalisis Asam Salisilat menggunakan parameter akurasi dan presisi yang dilakukan pengujian dalam plasma darah manusia dengan menggunakan intrumen LC-MS/MS (Liquid Chromatography – Mass Spectrometry).
Pengujian ini dilakukan di Laboratorium PT Biometrik Riset Indonesia dengan metode yang beracuan dari European Medicines agency (EMA) tahun 2011.
Pengujian ini menggunakan metode preparasi sampe Protein Precipitation Extraction (PPE) dengan menggunakan methanol sebagai pelarut dan asam format 0,1% dalam asetonitril sebagai pengendap protein. Metode ini dipilih dengan tujuan untuk meminimalkan jumlah zat aktif Asam Salisilat yang akan hilang pada saat proses preparasi sampel karena semakin banyak tahap preparasi yang dilakukan maka akan semakin banyak juga kadar zat aktifnya berkurang.
Hasil dari ektraksi Asam Salisilat dalam sampel plasma yang sudah ditambahkan dengan asam format 0,1% dalam asetonitril yang bertujuan untuk mengendapkan protein didalam sampel plasma (pengendapan protein) kemudian di vortex selama 5 menit, hal memiliki tujuan untuk memecahkan ikatan asam salisilat didalam sampel plasma. Kemudian sampel yang sudah di vortex dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm pada suhu 5°C selama 10 menit, hal ini bertujuan untuk memisahkan protein dengan lapisan supernatannya yang dimana nanti akan mengendap dibawah dan lapisan supernatannya akan di pindahkan ke mikkrotube baru yang bersih, kemudian hasil sentrifugasi dilakukan sentrifugasi kembali dengan kecepatan 14.000 rpm pada suhu 5°C selama 5 menit dan kemudian larutan supernatannya dipindahkan ke dalam vial untuk dilakukan penginjekkan larutan sampel, tujuan dari sentrifugasi kembali ini untuk memastikan larutan supernatant yang dipindahkan ke dalam vial tidak ada lagi terdapan endapan
proteinnya karena akan mengganggu hasil dari penginjekan sampel pada alat LC- MS/MS.
Pada pengujian ini fase gerak aygn digunakan yaitu ammonium asetat 5mM : asetonitril dengan perbandingan 25:75 dan dengan system isokratik. Yang dimaksut dengan system isokratik proses pemisahan senyawa dengan menggunakan larutan fase gerak yang sama dan dengan perbandingan yang tetap selama proses pemisahan hingga proses selesai.(system isokratik) Sebelum digunakan fase gerak disaring dengan menggunakan penyaring vakum dengan membrane filter yang memiliki tujuan untuk menyaring zat zat lain didalam larutan aquadest, kemudian setelah disaring larutan didegas yang bertujuan untuk menghilangkan gas didalam larutan fase gerak yang jika terdapat gas oksigen dan nitrogen yang akan berpotensi menggangu pompa dan detector pada instrument yang nantinya akan mempengaruhi hasil analisis.(system isokratik) Penggunaan fase gerak ammonium asetat 5mM dan asetonitril dipilih karena diperoleh kondisi optimum setelah dilakukan optimasi berbagai fase gerak, hasil optimasi dipilih berdasarkan munculnya puncak spektrum masing -masing senyawa dan konsentrasi analit dengan standar internal.
Standari internal pada pengujian ini digunakan untuk meningkatkan akurasi, presis, dan kekuatan metode analisis karena selama perawatan dan analisis sampel biologis kehilangan kosentrasi senyawa dapat terjadi. Dengan menambahkan standar internal dengan jumlah yang sama begitu dengan sifat fisika kimia yang serupa dengan zat aktif kehilangan konsentrasi analit dapat dikoreksi. Sehingga dapat disimpulkan bahwa standar internal berfungsi sebagai kontrol kerja dalam bioanalisis, standar internal yang digunakan dalam bioanalisis ini yaitu Celecoxib yang memiliki kesamaan struktur dan profil kromatografi yang baik dengan zat asam salisilat.
Pengukuran kurva kalibrasi bertujuan untuk mengetahui linearitas konsentrasi larutan. Kurva kalibrasi dibuat dengan berbagai macam konsentrasi yang diencerkan dari larutan stok standar. Pada pengujian ini, dibuat sebanyak 8 titik kurva kalibrasi dengan konsentrasi terendah yaitu 500,00 ng/mL dan konsentrasi tertinggi yaitu 100000,00 ng/mL. hasil pengukuran akan berbanding lurus antara konsentrasi larutan dengan luas area sehingga didapatkan hasil kurva yang linear. Kurva kalibrasi menunjukkan linearitas yang baik pada rentang konsentrasi 500,00 ng/mL sampai 100000,00 ng/mL. Pada pengujian ini, kurva kalibrasi memiliki koefisien regresi 0,9939 dengan persamaan garis y = 0,006737 + 0.000099890x. Hasil ini menunjukkan
bahwa linieritas dari metode yang digunakan sangat baik dimana syarat dari linieritas yang baik adalah koefisien korelasi mendekati 1.
Pada uji akurasi, masing-masing konsentrasi (LLOQ, QC Low, QC Medium, dan QC High) dibuat menjadi 5 larutan. Menurut Food and Drug Administration (FDA), untuk analisis dalam matriks biologis, akurasi harus diukur pada minimum lima kali pengukuran per konsentrasi. Rata-rata % dev dari lima larutan LLOQ yaitu -7,34 %, lima larutan Quality Control Low yaitu -3,56 %, lima larutan Quality Control Medium 3,02 %, lima larutan Quality Control High -0,97 %. Semua hasil pengujian ini memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan oleh Europan Medicines Agency yaitu akurasi dalam proses harus ditentukan dengan menganalisis dalam sekali proses minimal 5 sampel tiap level dengan minimal 4 level konsentrasi yang mencakup rentang kurva kalibrasi, yaitu Low Limit of Quantification (LLOQ), tiga kali dari LLOQ (Quality Control Low), 30 – 50% dari rentang kurva kalibrasi ( Quality Control Medium). Dan 75% dari rentang kurva kalibrasi atas (Quality Control High).
Konsentrasi rata-rata harus berada dalam 15% dari nilai nominal untuk sampel Quality Control, kecuali untuk LLOQ harus berada dalam 20% dari nilai nominal.
Pada uji presisi, masing-masing konsentrasi (LLOQ, Quality Control Low, Quality Control Medium, dan Quality Control High) dibuat menjadi 5 larutan.
Menurut Food and Drug Administration (FDA), untuk analisis dalam matriks biologis, akurasi harus diukur pada minimum lima kali pengukuran per konsentrasi. Rata-rata % dev dari lima larutan LLOQ yaitu 16,16 %, lima larutan Quality Control Low yaitu 8,27 %, lima larutan Quality Control Medium 5,78 %, lima larutan Quality Control High 4,21 %. Semua hasil pengujian ini memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan oleh Europan Medicines Agency yaitu akurasi dalam proses harus ditentukan dengan menganalisis dalam sekali proses minimal 5 sampel tiap level dengan minimal 4 level konsentrasi yang mencakup rentang kurva kalibrasi, yaitu Low Limit of Quantification (LLOQ), tiga kali dari LLOQ (Quality Control Low), 30 – 50% dari rentang kurva kalibrasi ( Quality Control Medium). Dan 75% dari rentang kurva kalibrasi atas (Quality Control High). Konsentrasi rata-rata harus berada dalam 15% dari nilai nominal untuk sampel Quality Control, kecuali untuk LLOQ harus berada dalam 20% dari nilai nominal. Hasil akurasi dan presisi ini bermakna bahwa kadar asam salisilat yang diperoleh memiliki kedekatan dengan kadar yang diketahui serta pengujian dari tiap keberulangannya memiliki kedekatan satu dengan yang lainnya.
SIMPULAN DAN SARAN 5.1 Simpulan
Berdasarkan hasil pengujian verifikasi metode penetapan kadar Asam Salisilat dengan parameter akurasi dan presisi dalam plasma darah secara LC MS/MS (Liquid Chromatrography Mass Spectrometry) didapat kesimpulan bahwa parameter yang di uji yaitu kurva kalibrasi, Low Limit of Quantification (LLOQ), akurasi dan presisi menunjukkan bahwa masing-masing telah memenuhi syarat yang sudah ditetapkan berdasarkan Europan Medicines Agency tahun 2011 dan dapat digunakan untuk analisis rutin dan dari hasil pengujian yang sudah dilakukan dapat disimpulkan bahwa metode bioanalisis asam salisilat dengan parameter akurasi dan presisi dalam plasma darah menggunakan LC-MS/MS (Liquid Chromatography/Mass Spectrometry) dapat digunakan untuk analisis rutin.
5.2 Saran
Perlu dilakukan pengujian verifikasi dengan parameter lainnya seperti spesifitas untuk melengkapi parameter verifikasi.
DAFTAR PUSTAKA
L A M
P
I
R
A
N
Ditimbang Ammonium asetat sebanyak 192,70 mg dengan menggunakan wadah timbang
Disaring larutan Ammonium asetat 2 mM menggunakan penyaring vakum
Dimasukkan selang fase gerak pada instrument LC-MS/MS ke dalam botol fase gerak Ammonium Asetat
Dimasukkan filtrat ke dalam botol berukuran 500 mL, Disonikasi selama 3 menit
Lampiran 1 Pembuatan Fase Gerak 1. Fase Gerak
a. Ammonium Asetat 2mM sebanyak 500 mL
Dilarutkan dengan aquadest, lalu homogenkan dengan spatel
Dimasukkan 250 mL aquadest ke dalam labu ukur 500 mL
Dipindahkan larutan ammonium asetat ke dalam labu ukur 500 mL yang sudah ditambahkan aquadest
Ditepatkan dengan aquadest hingga tanda batas, homogenkan
Dimasukkan selang fase gerak pada instrument LC-MS/MS ke dalam botol fase gerak asetonitril
Diukur sebanyak 350 mL asetonitril ke dalam gelas ukur
Diukur sebanyak 500 mL asetonitril ke dalam gelas ukur b. Asetonitril 100 % sebanyak 350 mL
Lampiran 2 Pembuatan Asetonitril dalam Asam Format 0,1%
2. Pembuatan Asetonitril dalam Asam Format 0,1% sebanyak 500 mL
Dimasukkan ke dalam botol cokelat dan disonikasi selama 3 menit
Dipipet 500 µL asam format 0,1% dengan mikropipet, Dipindahkan ke gelas ukur yang berisi asetonitril
Dimasukkan ke dalam botol cokelat dan homogenkan
Ditimbang setara sebanyak 5 mg standar Asam Salisilat
Dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL
Dipipet sebanyak 500 µL dari larutan stock standar Asam Salisilat 1000 µg/mL
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik
Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril Lampiran 3 Pembuatan Larutan Stock Standar Carvedilol 1000 µg/mL
3. Larutan Stock Standar Asam Salisilat 1000 µg/mL
Lampiran 4 Larutan Kerja Standar Asam Salisilat 4. Larutan Kerja Standar Asam Salisilat
a. Larutan Kerja Standar Asam Salisilat 100000 ng/mL
Ditepatkan dengan metanol hingga tanda batas, homogenkan dengan kocok selama 30 detik
Dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL
Dilarutkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril sebanyak ¾ labu ukur, lalu disonikasi selama 2 menit
Dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL
Lampiran 5 Pembuatan Larutan Standar Asam Salisilat (Working Standar) 5. Pembuatan Larutan Standar Asam Salisilat (Working Standar)
WS 1 (Konsentrasi 500 ng/mL)
Dipipet sebanyak 25 µL dari larutan stock standar Asam Salisilat 100000 ng/mL
Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik
Dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL
Dipipet sebanyak 50 µL dari larutan stock standar Asam Salisilat 100000 ng/mL
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik
Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril WS 2 (Konsentrasi 1000 ng/mL)
WS 3 (Konsentrasi 50 ng/mL)
WS 3 (Konsentrasi 100000 ng/mL)
Dipipet sebanyak 200 µL dari larutan stock standar Asam Salisilat 100000 µg/mL
Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril Dimasukkan ke dalam labu ukur 2 mL
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik
Dimasukkan ke dalam labu ukur 2 mL
Dipipet sebanyak 40 µL dari larutan stock standar Asam Salisilat 100000 µg/mL
Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril
Dipipet sebanyak 80 µL dari larutan stock Asam Salisilat 100000 µg/mL WS 4 (Konsentrasi 20000 ng/mL)
WS 5 (Konsentrasi 40000 ng/mL)
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik
Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril Dimasukkan ke dalam labu ukur 2 mL
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik
Dimasukkan ke dalam labu ukur 2 mL
Dipipet sebanyak 120 µL dari larutan stock Asam Salisilat 100000 µg/mL
WS 7 (Konsentrasi 80000 ng/mL)
Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik
Dipipet sebanyak 160 µL dari larutan stock standar Asam Salisilat 100000 µg/mL
Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril Dimasukkan ke dalam labu ukur 2 mL
Dimasukkan ke dalam labu ukur 2 mL
Dipipet sebanyak 200 µL dari larutan stock standar Asam Salisilat 100000 µg/mL
Dilarutkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril sebanyak ¾ labu ukur, lalu di sonikasi selama 3 menit WS 8 (Konsentrasi 10000 ng/mL)
Lampiran 6 Pembuatan Larutan Stock QC
6. Pembuatan Larutan Stock QC 1000 µg/mL
Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik
Ditimbang setara sebanyak 5 mg standar Asam Salisilat
Dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL
Ditepatkan dengan metanol hingga tanda batas, homogenkan dengan kocok selama 30 detik
Dipipet sebanyak 500 µL dari larutan stock standar Asam Salisilat 1000 µg/mL
Dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik
Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril Lampiran 7 Pembuatan Larutan Stock QC
7. Pembuatan Larutan Stock QC
a. Larutan Kerja (A) Stock 100000 ng/mL
Dimasukkan ke dalam labu ukur 2 mL
Dipipet sebanyak 30 µL dari larutan stock standar Asam Salisilat 100000 ng/mL
8. Pembuatan Larutan Kerja QC
a. QC-L (Quality Control Low)
b. QC-M (Quality Control Medium)
Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik
Dipipet sebanyak 100 µL dari larutan stock standar Asam Salisilat 100000 ng/mL
Dimasukkan ke dalam labu ukur 2 mL
c. QC-H (Quality Control High)
Lampiran 9 Pembuatan Larutan Stock Internal Standar Celecoxib
9. Pembuatan Larutan Stock Internal Standar Celecoxib 1000 µg/mL Dipipet sebanyak 150 µL dari larutan stock standar Asam Salisilat
100000 ng/mL
Dimasukkan ke dalam labu ukur 2 mL
Diencerkan dan ditepatkan dengan 0,10% Asam Format dalam Asetonitril
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik
Ditimbang seksama sebanyak 5 mg standar Celecoxib
Dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL
Dilarutkan dengan metanol sebanyak ¾ labu ukur, lalu disonikasi selama 2 menit
Ditepatkan dengan metanol hingga tanda batas, homogenkan dengan kocok selama 30 detik
Dipipet sebanyak 2500 µL dari larutan stock standar Celecoxib 1000 µg/mL Lampiran 10 Pembuatan Larutan Kerja Internal Standar Celecoxib
10. Pembuatan Larutan Kerja Internal Standar Celecoxib 10.000 ng/mL
Dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL
Diencerkan dan ditepatkan dengan metanol
Dihomogenkan dengan kocok selama 30 detik