B. Pendekatan Analisis dalam HKSA
1. Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA) a. Pemodelan struktur Molekul
data dengan spesifikasi : processor Intel (R) Atom (TM) CPU 2500 @ 1.86 GHz 1.86 GHz, RAM 2.00 GB, harddisk 368 GB serta perangkat lunak system operasi WindowsTM 7 Ultimate, Hyperchem® release 8.0, Molecular Operating Environment (MOE) release 2009.10 dan SPSS for Windows.
E. Prosedur Kerja
1. Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA)
b. Optimasi ligan
Struktur senyawa dioptimasi dengan perangkat lunak HyperChem menggunakan metode Ab initio dengan parameter basis set small dan convergence limit 105. Optimasi struktur geometri bertujuan untuk memperoleh konformasi struktur yang lebih stabil. Urutan perintah pada program HyperChem yaitu HyperChem >> Setup >> Ab initio, selanjutnya diatur basis set menjadi small.
Selanjutnya HyperChem >> Compute >> Geometry Optimization untuk memulai perhitungan optimasi geometri dengan parameter default. Hasil perhitungan Ab initio lebih akurat bila dibandingkan dengan semiempirik, sebab Ab initio menyelesaikan semua persamaan mekanika kuantum secara eksak dan semua elektron yang ada diperhitungkan. File yang telah dioptimasi disimpan dalam format ekstensi *.hin.
Gambar III.2 Panel Ab Initio Optimization menggunakan program HyperChem c. Kalkulasi Deskriptor
Nilai deskriptor dikalkulasi menggunakan program MOE. Deskriptor yang dihitung adalah AM1_E, AM1_Eele, AM1_HOMO, AM1_LUMO, AM1_dipole, AM1_HF, log P (o/w), log S, glob, ASA_H, mr, vol, dan VSA. Perhitungan dimulai dengan pembuatan database senyawa turunan tiazol-4-karboksamid, dengan menginput struktur senyawa yang telah dioptimasi ke file database.
Urutan perintah untuk kalkulasi deskriptor adalah DBV >> Compute >>
Deskriptor >> Calculate, kemudian dipilih deskriptor yang akan dihitung, kemudian tekan OK.
Gambar III.3 Jendela DataBase Viewer (DBV)
Tabel III. 1. Daftar deskriptor
No Simbol pada software Simbol umum Deskriptor
1 AM1_dipol Μ Momen dipol
2 AM1_E ETot Energi total
3 AM1_Eele Eele Energi elektronik
4 AM1_HOMO EHOMO Energi HOMO
5 AM1_LUMO ELUMO Energi LUMO
6 AM1_HF HF Panas pembentukan
7 ASA_H Ǻ Luas permukaan hidrofobik
8 Glob Glob Globularitas
9 log P (o/w) log P Koefisien Partisi
10 log S log S Logaritma kelarutan dalam air
11 Mr MR Refraktivitas molar
12 Vol Vol Volume Van der Waals
13 VSA Ǻ Luas permukaan Van der Waals
d. Perhitungan statistik
Variabel tak bebas dalam penelitian ini adalah aktivitas inhibisi CHK1 (log 1/IC50) hasil eksperimen (Tabel 1), sedangkan variabel bebas yang digunakan adalah berupa: AM1_E, AM1_Eele, AM1_HOMO, AM1_LUMO, AM1_dipole, AM1_HF, log P (o/w), log S, glob, ASA_H, mr, vol_vdw, dan vol. Semua variabel dianalisis menggunakan regresi multilinear metode backward untuk mengetahui urutan variabel bebas mana yang berpengaruh terhadap aktivitas senyawa. Hasil yang diperoleh berupa persamaan HKSA beserta nilai parameter statistik seperti nilai r, r2 dan F. Nilai F menunjukkan kemaknaan hubungan bila dibandingkan dengan F tabel.
Nilai F adalah indikator bilangan untuk menunjukkan bahwa hubungan, yang
dinyatakan oleh persamaan yang didapat, adalah benar atau merupakan kejadian kebetulan.Untuk mendapatkan model dengan nilai r tertinggi, dilakukan eliminasi senyawa yang memiliki deviasi terbesar berdasarkan nilai Z pada hasil komputasi MOE, dimana struktur senyawa dengan nilai Z terbesar dieliminasi dari perhitungan statistik. Selain parameter statistik tersebut, dari hasil perhitungan juga diperoleh nilai tetapan dan nilai koefisien setiap variabel bebas yang terlibat dalam persamaan yang dihasilkan. Nilai koefisien yang diperoleh digunakan untuk menghitung aktivitas inhibisi teoritis.
e. Validasi dan penetapan model HKSA
Selanjutnya model–model yang telah terpilih divalidasi silang dengan metode Leave One Out, yaitu dengan cara setiap senyawa terprediksi dihilangkan dalam perhitungan analisis regresi linear. Persamaan HKSA yang terpilih adalah persamaan dengan nilai kriteria statistik terbaik dan memenuhi kriteria validasi yaitu q2 ≥ 0.5. Nilai q2 dihitung menurut persamaan :
𝑞2= 1 − ∑(𝑦𝑖 − ŷ𝑖)2
∑(𝑦𝑖 − ȳ)2 Keterangan :
yi = aktivitas eksperimen senyawa ke-i ȳ = aktivitas eksperimen rata–rata
ŷi = aktivitas prediksi validasi silang senyawa ke-i 2. Docking Molekul
Teknik docking adalah superimpose struktur tiga dimensi dari suatu obat yang potensial di situs reseptor yang mungkin, seringkali dilakukan secara otomatis. Hal ini memungkinkan kita untuk mengevaluasi kecocokan obat potensial (ligan) ke situs reseptor. Sifat atom dan gugus fungsi dari struktur obat memungkinkan kita untuk menyelidiki pengikatan ligan ke situs target.
Pendekatan yang digunakan adalah semi rigid, dimana struktur protein dibuat rigid sedangkan ligan fleksibel. Metode pendekatan ini akan memberikan kemungkinan interaksi dalam berbagai konformasi ligan sehingga memungkinkan untuk mendapatkan hasil yang terbaik. Jumlah bentuk konformasi yang memungkinkan sesuai dengan banyaknya ikatan rotatabel yang ada. Tahapan prosedur docking terdiri dari tiga langkah, yaitu preparasi ligan, preparasi protein dan simulasi docking.
a. Preparasi Ligan.
Ligan dalam bentuk struktur tiga dimensi dan dioptimasi dengan metode Ab initio menggunakan program HyperChem. Struktur kemudian disimpan dalam format *.ml2. File dibuka pada Jendela MOE. Struktur diprotonisasi untuk menambahkan hidrogen dan muatan parsial, dengan Protonate 3D (urutan perintah MOE >> Compute >> Protonate 3D) dengan setting pH 7 dan cutoff 15. File kemudian disimpan dalam database (*.mdb).
Gambar III.4 Panel protonate 3D b. Preparasi protein
Reseptor diunduh dari situs RSCB.PDB dengan kode 4FSU dalam format
*.pdb. Molekul air (H2O) kemudian dihapus dari struktur. Protein kemudian diprotonisasi dengan langkah yang sama pada preparasi ligan.
c.
Simulasi dockingLigan dan reseptor yang telah diprotonisasi dibuka dalam Jendela MOE.
Panel Simulasi docking dibuka dengan urutan perintah MOE >> Compute >>
Simulations >> Dock. Receptor pada panel Dock diatur Receptor Atom, Site diatur Selected Atoms. Ligand diatur MDB File. Lalu pada Browse, dimasukkan file database 17 senyawa yang sudah diprotonisasi. Placement diatur Triangle Matcher, rescoring 1 menggunakan London dG, dan refinement diatur Force Field. rescoring
2menggunakan affinity dG. Posisi docking terbaik dipilih berdasarkan nilai rmsd (≤ 2) dan nilai scoring terendah.
Gambar III.5 Panel Dock
59 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Teknik komputasi merupakan pendekatan skrining secara in silico yang digunakan saat ini, baik di universitas, industri farmasi dan lembaga penelitian dalam rangka penemuan obat. Hubungan kuantitatif struktur kimia dan aktivitas biologis obat (HKSA)merupakan bagian penting rancangan obat, dalam usaha untuk menemukan suatu obat baru dengan aktivitas yang lebih besar, selektifitas yang lebih tinggi, dan efek samping atau toksisitas sekecil mungkin.
Dalam proses pemodelan struktur senyawa turunan tiazol-4-karboksamid dilakukan menggunakan aplikasi HyperChem 8.0. Kemudian dilakukan optimasi geometri untuk memperoleh konformasi struktur yang lebih stabil menggunakan metode AM1 karena perhitungannya cepat, hanya menghitung elektron pada kulit terluar. Hal ini dilakukan agar pada saat dilakukan optimasi Ab initio tidak membutuhkan waktu yang lebih lama. Selanjutnya file disimpan dalam format ekstensi .hin. Setelah itu dilanjutkan optimasi Ab initio untuk memperoleh konformasi struktur yang lebih stabil karena hasil perhitungan Ab initio lebih akurat bila dibandingkan dengan semiempirik, sebabAb initiomemperhitungkan semua elektron yang ada. Kemudian dilakukan start log untuk mencatat hasil perhitungan selama proses optimasi berlangsung. Setelah proses start log selesai, maka dilakukan stop log lalu file log (file berisi perhitungan selama proses optimasi) disimpan dalam format ekstensi .log. Setelah itu, file hasil optimasi Ab initio yang telah disimpan
dalam format ekstensi .hin diubah menjadi format ekstensi .ml2. File dengan format ekstensi .ml2 kemudian diubah menjadi format ekstensi .moe pada program Molecular Operating Environment (MOE).
Dalam proses perhitungan deskriptor, terlebih dahulu dibuat database yang merupakan tempat proses perhitungan deskriptor dilakukan. Nilai–nilai deskriptor dikalkulasi menggunakan program Molecular Operating Environment (MOE).
Deskriptor yang digunakan yaitu AM1_E, AM1_Eele, AM1_HOMO, AM1_LUMO, AM1_dipole, AM1_HF, log P (o/w), log S, glob, ASA_H, mr, vol, dan VSA.
Deskriptor MOE mampu menghitung deskriptor 2 dimensi (yang hanya bergantung pada atom dan konektivitas ikatannya) dan deskriptor 3 dimensi (yang bergantung pada konformasi). Deskriptor ini dirancang dan dioptimalkan untuk mengkarakterisasi sifat fisikokimia molekul untuk digunakan ke dalam model HKSA dalam memprediksi pengikatan dan penghambatan. Selanjutnya struktur senyawa yang telah dioptimasi diinput ke dalam database lalu dilakukan perhitungan nilai-nilai deskriptor. Dalam percobaan ini digunakan 17 senyawa, dimana pemilihan senyawa ini berdasarkan hasil eliminasi berdasarkan nilai z-score. Proses eliminasi bertujuan untuk mendapatkan nilai r tertinggi, dalam percobaan ini dilakukan hingga diperoleh 17 senyawa Nilai deskriptor untuk masing-masing senyawa ditunjukkan pada tabel A.1.
Hasil perhitungan deskriptor yang diperoleh selanjutnya dianalisis secara statistik berdasarkan analisis regresi multilinear dengan menggunakan program SPSS 17. Deskriptor-deskriptor tersebut kemudian diregresikan terhadap aktivitas inhibisi
CHK1 yang merupakan variabel terikat (Dependent variable). Deskriptor-deskriptor tersebut sebagai variabel tak terikat (Independent variable) pada proses analisis regresi multilinier yang dikombinasikan antara satu dngan yang lainnya dengan jumlah 5 kombinasi deskriptor.
Hasil perhitungan regresi multilinier dengan kombinasi 5 deskriptor tersebut kemudian dirangking berdasarkan nilai parameter statistik, yaitu koefisien korelasi (r), koefisien regresi (r2), standar error (SE) dan kriteria Fischer (F). Kemudian 10 persamaan kombinasi terbaik divalidasi menggunakan metode Leave-One-Out (LOO), yaitu pada n buah data, dikeluarkan sebuah data dari fitting. Nilai q2 digunakan untuk menentukan model persamaan terbaik. Model persamaan harus memenuhi kriteria yaitu nilai q2 ≥ 0,5.
Tabel IV.1 10 persamaan kombinasi deskriptor terbaik
No. Kombinasi
Deskriptor r r2
Standar Error of Estimate
Fischer Signifikansi q2 1
AM1_dipole, log P (o/w), log S, mr, vol
0.9237 0.8532 0.2051 12.7846 0.0003 0.26766487
2
AM1_dipole, AM1_E, AM1_HOMO , ASA_H, glob
0.9100 0.8280 0.2219 10.5923 0.0006 0.97402576
3
AM1_dipole, AM1_LUMO , log S, mr, vol
0.9027 0.8150 0.2302 9.6888 0.0010 0.99992387
4 AM1_dipole, AM1_Eele, AM1_HOMO
0.9025 0.8146 0.2305 9.6636 0.0010 0.98853309
Aktivitas prediksi yang diperoleh dari model ini dibandingkan dengan aktivitas eksperimen.Tidak menunjukkan pola yang jelas jika hanya aktivitas prediksi molekul yang diperiksa. Namun, jika pemeriksaan meliputi nilai q2, pola mulai berkembang.
Nilai q2 dalam konteks ini merupakan selisih kesalahan bahwa model tidak sesuai.
Nilai-nilai q2 yang lebih dekat ke 1 menunjukkan kesalahan lebih kecil, dan nilai-nilai yang lebih kecil dari 1 menunjukkan kesalahan lebih besar. Nilai negatif dari
, ASA_H, glob
5
AM1_dipole, AM1_HOMO , ASA_H, glob, VSA
0.9011 0.8120 0.2321 9.5009 0.0010 0.93454962
6
AM1_dipole, AM1_LUMO, ASA_H, mr, vol
0.8971 0.8047 0.2365 9.0676 0.0013 0.98564255
7
AM1_dipole, AM1_HOMO , ASA_H, glob, vol
0.8970 0.8046 0.2366 9.0568 0.0013 0.95686028
8
AM1_dipole, AM1_HOMO , ASA_H, mr, vol
0.8964 0.8036 0.2372 9.0009 0.0013 0.75781952
9
AM1_dipole, AM1_HOMO , ASA_H, log P (o/w), vol
0.8962 0.8032 0.2374 8.9805 0.0013 0.39231823
10
AM1_dipole, AM1_LUMO, mr, vol, VSA
0.8943 0.7998 0.2395 8.7876 0.0014 0.83753852
q2menunjukkan ketidaksesuaian yang besar. Adapun perbandingan hasil aktivitas eksperimen dengan aktivitas prediksi disajikan dalam tabel IV. 2.
Tabel IV. 2 Perbandingan IC50 Eksperimen dan IC50 Prediksi Senyawa IC50 Eksperimen IC50 Prediksi
28 36 58.24351778
41 69 44.6143172
17 72 129.3696844
1 75 75.35608242
9 86 109.8863679
16 87 104.5776953
30 89 162.0419089
25 100 104.0083892
31 110 140.2276058
8 120 193.0873125
29 130 105.493609
20 170 145.5122186
32 190 199.5572701
27 210 79.44259457
5 280 173.6222267
19 520 291.0487745
15 3400 3150.386768
Gambar IV.1 Kurva IC50 PrediksiVS IC50 Eksperimen
y = 1,0806x + 3,1297 R² = 0,991
IC50Eksperimen
IC50Prediksi