g. Setelah mendidih tuang media nata ke nampan sampai ± separuh penuh h. Tutup nampan berisi media nata dengan kertas koran dan diikat
kencang
i. Diamkan media nata selama sehari atau hingga dingin di tempat yang rata dan tidak mudah terguncang
j. Setelah satu hari buka sedikit nampan yang telah berisi media nata di bagian pojok nampan
k. Tuang starter nata sebanyak 10 ml secara perlahan ke dalam media nata l. Tutup kembali nampan kemudian goyang secara perlahan agar media
dan starter nata dapat bercampur rata
m. Hindari menggoyang terlalu kencang dan jangan sampai kertas penutup basah
n. Diamkan media nata selama 7-10 hari
o. Setelah 7-10 hari buka kertas penutup nampan kemudian ambil nata yang telah terbentuk
p. Cuci nata dengan air bersih
Kultur jaringan merupakan salah satu perbanyakan tanaman secara vegetatif dengan cara menumbuhkan bagian-bagian tertentu dari tanaman, seperti sel, jaringan dan organ dalam kondisi yang aseptik dan secara in vitro.
Dalam teknik ini juga digunakan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi yang lengkap dan zat pengatur tumbuh serta kondisi ruang kultur yang suhu dan pencahayaannya terkontrol. Dengan teknik kultur jaringan ini maka akan didapatkan tanaman dalam jumlah yang banyak dan dalam waktu yang singkat.
Dalam teknik kultur jaringan dibutuhkan beberapa faktor untuk bisa menghasilkan tanaman seperti yang diharapkan. Salah satu faktor yang menunjang keberhasilan dalam teknik kultur jaringan adalah tahap preparasi yang terdiri dari persiapan alat dan bahan yang akan digunakan serta pada pembuatan media. Media kultur jaringan terdiri dari campuran garam-garam anorganik/garam mineral, gula, vitamin, asam amino, zat pengatur tumbuh, air serta bahan pemadat. Senyawa kimia yang terkandung dalam media kultur in vitro (unsur hara makro dan mikro) perlu disusun dalam komposisi tertentu (berimbang), karena perimbangan yang tepat akan sangat menentukan tipe pertumbuhan yang akan terbentuk dari eksplan yang akan ditanam.
Komposisi dan konsentrasi hormon pertumbuhan yang ditambahkan dalam media sangat mempengaruhi arah pertumbuhan dan regenerasi eksplan yang dikulturkan. Komposisi dan konsentrasi hormon pertumbuhan yang ditambahkan ke dalam media kultur sangat tergantung dari jenis eksplan yang dikulturkan dan tujuan pengkulturannya. Konsentrasi hormon pertumbuhan optimal yang ditambahkan ke dalam media tergantung pula dari eksplan yang dikulturkan serta kandungan hormon pertumbuhan endogen yang terdapat pada eksplan tersebut. Komposisi yang sesuai ini dapat diperkirakan melalui percobaan-percobaan yang telah dilakukan sebelumnya disertai percobaan untuk mengetahui komposisi hormon pertumbuhan yang sesuai dengan kebutuhan dan arah pertumbuhan eksplan yang diinginkan.
1. Mahasiswa mampu membuat komposisi media kultur jaringan sesuai kebutuhan
2. Mahasiswa mampu melakukan teknik kultur jaringan tanaman 10.3. Prosedur Pelaksanaan
10.3.1. Alat dan Bahan Alat :
Timbangan analitik
autoklaf
pH meter
Hot plate dan magnetic stirer
Erlenmeyer
Pipet tetes
Beaker gelas
Gelas ukur
Mikropipet dan tip
Spatula
Pinset
Gunting
Scalpel
Botol kultur
Lampu bunsen
Bahan :
Larutan stok unsur hara makro
Larutan stok unsur hara mikro
ZPT
Vitamin
MS media
NaOH
HCl
Sukrosa
Agar
Bayclin 10%
Alkohol 70% dan 90%
Alumunium foil
Detergen
Aquades steril
Kertas label
Plastik
Karet gelang
Spirtus
Tunas pucuk tanaman anggrek
Tisu steril
10.3.2. Cara Kerja
10.3.2.1. Sterilisasi Alat
a. Bungkus rapi alat-alat gelas dan peralatan untuk kultur jaringan dengan kertas
b. Masukkan alat-alat yang telah terbungkus kedalam autoklaf c. Sterilisasi dengan autoklaf selama 30 menit
d. Setelah selesai steril masukkan alat-alat tersebut ke dalam oven 10.3.2.2. Pembuatan larutan stok
a. Buat larutan stok yang terdiri dari stok hara makro, stok hara mikro, stok vitamin dan stok zat pengatur tumbuh
b. Cara pembuatan larutan stok: misalkan kita ingin membuat stok A maka dalam 1 liter media MS terdapat 1650 mg NH4NO3. Untuk memudahkan pembuatan media, konsentrasi dinaikkan 50 kali sehingga dalam 1 liter larutan stok terdapat 1650 mg x 50 = 82.500 mg = 82,50 gr NH4NO3.
Untuk mengetahui banyaknya volume yang harus diambil, dipergunakan rumus pengenceran yaitu:
V1.M1 = V2.M2
Keterangan: V1: Volume awal , M1: Konsentrasi awal, V2: Volume akhir (stok yang harus diambil), M2: Konsentrasi larutan stok
Contoh:
Berapakah volume larutan stock yang harus diambil (V2) jika dalam 1 liter media MS (V1) terdapat 1650 mg NH4NO3 (M1) dan untuk membuat larutan stok konsentrasi dinaikkan sebesar 50 kali?
Jawab: V1.M1 = V2.M2
1000 ml x 1650 mg = V2 x (1650 x 50) mg 1000ml x 1650 mg = V2 x 82500 mg V2 = 1.650.000: 82.500
V2 = 20 ml
10.3.2.3. Pembuatan Media
a. Pipet larutan stok (unsur makro, mikro, vitamin, Fe-Na-EDTA) sesuai kebutuhan
b. Masukkan dalam beaker gelas dan tambahkan aquades sampai volume yang diinginkan
c. Larutan dihomogenkan dengan menggunakan magnet stirer sambil dipanaskan diatas hot plate
d. Tambahkan sukrosa (30g/L) ke dalam beaker gelas sampai larut e. Ukur pH larutan dengan pH meter
f. Jika pH telah sesuai tambahkan agar-agar (6,7 g/L) g. Panaskan sampai mendidih dan larut sempurna
h. Tuangkan ke dalam botol kultur masing-masing 20 ml i. Tutup botol kultur dengan alumunium foil
j. Sterilisasi media menggunakan autoklaf selama 20 menit
k. Setelah selesai di sterilisasi pindahkan botol berisi media ke dalam ruang kultur dan media siap untuk digunakan
10.3.2.4. Sterilisasi Eksplan
a. Potong batang/pucuk tanaman sesuai kebutuhan (lebihkan ukuran pemotongannnya) yang selanjutnya disebut eksplan
b. Masukkan eksplan ke dalam botol yang berisi detergen dan kocok selama 10 menit
c. Bilas pada air yang mengalir
d. Masukkan eksplan ke dalam botol yang berisi bayclin 10% dan kocok selama 10 menit
e. Bilas dengan aquades
f. Masukkan eksplan ke dalam botol yang telah fungisida dan rendam selama 5 menit
g. Bilas dengan aquades
h. Masukkan eksplan ke dalam botol yang berisi aquades steril dan masukkan ke dalam Laminar Air Flow (LAF)
10.3.2.5. Penanaman Eksplan
a. Siapkan alat dan bahan serta eksplan yang telah disteril
b. Semprot LAF menggunakan alkohol 70% dan sterilkan dengan sinar UV selama 20 menit
c. Alat-alat yang akan digunakan diatur dengan rapi pada LAF, posisi scalpel dan pinset serta alkohol 90% yang akan digunakan untuk mensterilkan disebelah kiri bunsen sedangkan botol kultur di sebelah kanan
d. Masukkan eksplan ke dalam LAF
e. Ambil eksplan dan keringkan dengan tisu steril
f. Sterilisasi pinset dan scalpel dengan cara celupkan ke dalam alkohol 90%
lalu dibakar diatas bunsen setiap kali akan digunakan
g. Potong eksplan dengan scalpel dengan ditaruh diatas petridish
h. Tanam eksplan pada media tanam yang telah disteril dalam botol kultur i. Botol kultur ditutup yang telah ditanami eksplan ditutup dengan
alumunium foil dan diikat dengan karet gelang j. Simpan botol kultur pada ruang kultur
k. Amati perkembangannya selama 14 hari
10.4. Parameter yang diamati 10.4.1. Pembuatan media
No Kontaminasi
Kapan muncul Jenis kontaminan Persentase botol kultur yg terkontaminasi 1
2
10.4.2. Penanaman eksplan
No % kontaminasi Jenis kontaminan Saat muncul tunas dan akar pertama kali
Jumlah tunas dan akar per eksplan
2
DAFTAR PUSTAKA
Djaenuddin, N. 2016. Interaksi bakteri antagonis dengan tanaman: ketahanan terinduksi pada tanaman jagung. Iptek Tanaman Pangan 11(2): 143-148 Jutono, Soedarsono, J., Hartadi, S., Kabirun, S., Suhadi, dan Soesanto. 1980.
Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum (Untuk Perguruan Tinggi).
Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada.
Gadjah Mada University Press. Yogyakarta
Hadioetomo, R.S. 1985. Mikrobiologi Pangan dalam Praktek Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. Gramedia. Jakarta
Hanudin., Nuryani, W., Silvia, E., Djatnika, I., dan Marwoto, B. 2010. Formulasi biopestisida berbahan aktif Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, dan Corynebacterium sp. nonpatogenik untuk mengendalikan penyakit karat pada krisan. Jurnal Hortikultura 20(3): 247-261
Khamidinal. 2009. Teknik Laboratorium Kimia. Pustaka Pelajar. Yogyakarta