PETUNJUK PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN
DISUSUN OLEH :
IRIANTI KURNIASARI, S.P, M.BIOTECH
PROGRAM STUDI PENYULUHAN PERTANIAN SEKOLAH TINGGI PENYULUHAN PERTANIAN
BADAN PENYULUHAN DAN PENGEMBANGAN SDM PERTANIAN KEMENTRIAN PERTANIAN
MALANG 2017
KATA PENGANTAR
Segala puji dan syukur penyusun panjatkan kepada Allah SWT yang telah memberikan HidayahNya, sehingga petunjuk praktikum bioteknologi pertanian ini dapat diselesaikan. Petunjuk praktikum ini disusun berdasarkan kebutuhan mahasiswa Sekolah Tinggi Penyuluhan Pertanian khususnya untuk para mahasiswa yang menempuh mata kuliah bioteknologi pertanian. Petunjuk praktikum ini secara garis besar berisi praktikum dalam bidang bioteknologi baik bioteknologi konvensional maupun bioteknologi modern, yang terdiri dari beberapa satuan acara praktikum yang berisi dasar-dasar dan aplikasi dalam bidang pertanian. Penyusun berharap petunjuk praktikum ini dapat memberikan acuan ketrampilan dasar dan aplikasi bagi para mahasiswa yang menempuh mata kuliah bioteknologi pertanian.
Tak lupa penyusun ucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada semua pihak yang membantu dalam penyusunan petunjuk praktikum ini.
Penyusun menyadari bahwa tidak ada sesuatu yang bisa sempurna di dunia ini, oleh karena itu kritik dan saran diperlukan dalam pengembangan untuk penyempurnaan petunjuk praktikum ini menjadi lebih bermanfaat.
Malang, September 2017
Penyusun
DAFTAR ISI
Halaman Judul...
Kata Pengantar...
Daftar Isi...
Daftar Gambar...
Tata Tertib Praktikum Bioteknologi...
Acara I. Pengenalan Alat dan Ruang Laboratorium...
Acara II. Sterilisasi Alat, Medium, dan Bekerja Secara Aseptis...
Acara III. Medium dan Cara Pembuatan Medium...
Acara IV. Isolasi dan Penanaman Mikroorganisme...
Acara V. Identifikasi Morfologi Mikroorganisme...
Acara VI. Penghitungan Populasi Mikroorganisme...
Acara VII. Pemanfaatan Mikrobia sebagai PGPR...
Acara VIII. Pemanfaatan Mikrobia sebagai Biopestisida...
Acara IX. Pemanfaatan Mikrobia dalam Pembuatan Nata de Fruit...
Acara X. Kultur Jaringan...
Daftar Pustaka...
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Proses sterilisasi dengan autoklaf... 8
TATA TERTIB PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN
A. Ketentuan Sebelum Praktikum
Praktikan datang tepat waktu, bagi yang terlambat lebih dari 10 menit tidak diperkenankan mengikuti praktikum pada hari itu.
Setiap kali praktikum, praktikan membawa jas lab dan petunjuk praktikum.
Sebelum masuk ruang praktikum, praktikan menyerahkan laporan praktikum sementara.
B. Ketentuan Selama Dan Sesudah Praktikum
Setelah praktikum, setiap kelompok membereskan semua alat yang dipakai dan mengembalikannya pada laboran sesuai dengan jumlahnya.
Tas dan benda-benda lain yang tidak diperlukan diletakkan pada tempat yang disediakan. Jangan sekali-kali meletakkannya di atas meja laboratorium
Sebelum dan sesudah bekerja, meja praktikum dibersihkan dengan desinfektan.
Setiap praktikan atau kelompok mengganti alat yang rusak atau hilang selama di pakai atau dipinjam sebelum ujian akhir praktikum (UAP).
Praktikan diharuskan menjaga kemurnian bahan-bahan yang dipakai dan menjauhkan segala macam kontaminan yang dapat mengganggu kevalidan hasil praktikum.
Postest/pretest di adakan sebelum atau sesudah praktikum
Hasil pengamatan selama praktikum dilaporkan segera setelah praktikum selesai hari itu sebagai laporan sementara. Untuk pengamatan yang melibatkan kelompok lain (kolektif)
C. Laporan Praktikum dan Tugas
Laporan praktikum dikerjakan dirumah dan dikumpulkan 1(satu) minggu setelah pengamatan terakhir dilakukan,
Laporan dan tugas yang diberikan dikumpulkan tepat waktu, keterlambatan dalam mengumpulkan akan dikenai sanksi pengurangan nilai.
D. Tidak Dapat Mengikuti Praktikum
Praktikan yang dengan terpaksa tidak dapat mengikuti praktikum yang sudah dijadwalkan pada kelompoknya, harus melapor ke koordinator praktikum untuk ikut praktikum kelas yang lain
Praktikan yang tidak dapat mengikuti praktikum sampai 2(dua) kali tanpa keterangan dianggap mengundurkan diri dan praktikumnya dianggap gugur F. Mahasiswa Dilarang
Merokok, Makan, Minum dan Bergurau di dalam ruang praktikum.
G. Hal-hal lain yang belum tercantum dalam tata tertib ini diatur kemudian
Malang, September 2017
Koordinator Praktikum Bioteknologi Pertanian
ACARA I. PENGENALAN ALAT DAN RUANG LABORATORIUM
1.1. Pendahuluan
Laboratorium berasal dari kata laboratory yang memiliki pengertian diantaranya yaitu: 1) tempat yang dilengkapi peralatan untuk melangsungkan eksperimen atau melakukan pengujian dan analisis, 2) ruangan yang dilengkapi peralatan untuk melangsungkan penelitian ilmiah ataupun praktek pembelajaran bidang sains, 3) tempat kerja untuk melangsungkan penelitian ilmiah (Poedjiadji, 1984), sedangkan yang dimaksud alat laboratorium yaitu merupakan benda yang digunakan dalam kegiatan di laboratorium yang dapat digunakan berulang kali. Peralatan gelas laboratorium merujuk pada berbagai peralatan laboratorium yang terbuat dari kaca, peralatan kaca masih sering digunakan oleh karena sifatnya yang inert, transparan, dan tahan panas. Pada dasarnya setiap alat memiliki nama yang menunjukkan kegunaan alat, prinsip kerja, atau proses yang berlangsung ketika alat digunakan. Beberapa kegunaan alat dapat dikenali berdasarkan namanya (Khamidinal, 2009;
Wahyudi, 2011).
Menurut Zulkarnain, (2002) pembagian ruangan di dalam laboratorium bioteknologi minimal terdiri dari ruangan yang dipisahkan berdasarkan fungsinya diantaranya yaitu :
a. Ruang persiapan (preparation area)
Ruang persiapan merupakan ruangan yang mempunyai 3 fungsi dasar yaitu : 1) untuk membersihkan alat-alat, 2) untuk persiapan dan sterilisasi, dan 3) untuk penyimpanan alat-alat gelas. Peralatan yang dibutuhkan dalam ruang preparasi ini adalah bak untuk mencuci yang dilengkapi dengan kran yang mengalir. Selain itu diperlukan meja yang permukaanya dilapisi dengan bahan yang mudah dibersihkan.
b. Ruang penanaman (transfer area)
Ruang penanaman merupakan ruang yang digunakan untuk isolasi, inokulasi dan subkultur pada kondisi steril yang di dalamnya terdapat Laminar Airflow (LAF).
c. Ruang pertumbuhan (growing area).
Growing area merupakan ruang pertumbuhan atau ruang penyimpanan hasil kultur/isolasi pada kondisi cahaya dan temperatur yang terkontrol dan dilengkapi dengan Air conditioner (AC) untuk mengontrol suhu ruang.
1.2. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa mampu mengetahui jenis-jenis alat, fungsi, dan cara penggunaannya
2. Mahasiswa mampu mengetahui fungsi-fungsi ruangan dalam laboratorium
1.3. Prosedur Pelaksanaan 1.3.1 Alat dan Bahan
1.3.1.1 Alat yang digunakan untuk isolasi mikroorganisme
No Gambar Alat Nama Alat Fungsi
1 Magnetic Hot Plate
Stirer
2 Colony counter
3 Vortex
(penghomogen)
4 Petridish
5 Inkubator
1.3.1.2 Alat yang digunakan untuk kultur jaringan
No Gambar Alat Nama Alat Fungsi
1 Laminar Air Flow
2 Autoklaf
3 pH meter
4 Mikropipet
5 Botol kultur
1.3.1.3. Alat yang digunakan untuk pembuatan PGPR
No Gambar Alat Nama Alat Fungsi
1 Mikroskop
2 Shaker inkubator
3 Lampu bunsen
4 Fermentor sederhana
5 Haemocytometer
1.3.1.4. Alat yang digunakan untuk pembuatan nata de fruit
No Gambar Alat Nama Alat Fungsi
1 Timbangan analitik
2 Gelas ukur
3 Beaker Gelas
4 Kompor
5 Nampan plastik
1.3.2. Cara Kerja
Setiap praktikan mencatat dan memperhatikan peralatan, cara kerja, dan fungsi masing-masing alat yang terdapat di laboratorium bioteknologi.
ACARA II. STERILISASI DAN BEKERJA SECARA ASEPTIK 2.1. Pendahuluan
Bekerja secara aseptik adalah prinsip paling utama dalam aktivitas pengamatan yang berhubungan dengan mikrobia. Kesterilan ruangan, pengguna, alat, dan bahan-bahan mutlak dibutuhkan karena mikrobia tersebut berukuran sangat kecil, tidak kasat mata, mudah tersebar, dapat hidup dimana saja sehingga dibutuhkan suatu keadaan yang benar-benar steril. Steril sendiri merupakan syarat mutlak keberhasilan kerja dalam laboratorium khususnya bioteknologi. Teknik-teknik tertentu diperlukan agar sterilisasi dapat dilakukan secara sempurna, dalam arti tidak ada mikroorganisme lain yang mengkontaminasi baik alat maupun media. Sterilisasi adalah suatu proses mematikan mikroorganisme yang mungkin ada di dalam benda. Pemilihan teknik sterilisasi didasarkan pada sifat bahan dan alat yang akan disterilisasi.
Menurut Jutono et al., (1980) secara umum ada tiga teknik yang biasa digunakan untuk sterilisasi :
1. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas, misalnya larutan enzim dan antibiotik.
2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran a. Pemanasan
Pemijaran : membakar alat pada api secara langsung, contoh alat jarum inokulum, pinset, dll.
Panas kering : sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800
Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air lebih tepat menggunakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi. Sterilisasi panas kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi, dll.
Uap air panas bertekanan: menggunakan autoklaf
Autoklaf merupakan alat sterilisasi yang sering digunakan. Alat ini bekerja dengan sistem sterilisasi basah. Secara prinsip, cara kerja alat ini adalah sterilisasi dengan menggunakan uap air pada suhu 1210C selama 15 menit pada tekanan 1 atm, atau lebih tergantung
ketinggian tempat terhadap permukaan air laut. Sterilisasi uap ini tergantung pada : sifat bahan atau alat, harus dapat ditembus atau terkena uap secara merata tanpa mengalami kerusakan agar proses sterilisasi berlangsung efektif, kondisi sterilisasi harus bebas udara (vacuum), suhu yang terukur harus mencapai 1210C dan dipertahankan selama 15 menit.
Gambar 1. Proses sterilisasi dengan autoklaf b. Radiasi
Sinar Ultra Violet (UV) juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Biological Safety Cabinet (BSC) atau Laminar Air Flow (LAF) dengan disinari lampu UV.
Gamma bersumber dari Cu60 dan Cs137 dengan aktivitas sebesar 50-500 kilo curie yang memiliki daya tembus sangat tinggi. Dosis efektifitasnya adalah 2,5 MRad. Gamma digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang terbuat dari logam, karet serta bahan sintesis seperti pulietilen (Hadioetomo, 1985).
3. Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan.
Desinfektan adalah suatu bahan kimia yang dapat membunuh sel-sel vegetatif dan jasad renik, bersifat merusak jaringan. Prosesnya disebut desinfeksi. Contoh: alkohol, fenol, halogen.
2.2. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa mampu mengetahui cara-cara sterilisasi alat dan medium yang benar
2. Mahasiswa memiliki ketrampilan dasar bekerja secara aseptik 2.3. Prosedur Pelaksanaan
2.3.1 Alat dan Bahan Alat :
Autoklaf
Botol Semprot Alkohol
Petridish
Erlenmeyer
Tabung Reaksi
Kompor
Oven
Bahan :
Aquades
Alkohol 70%
Kertas Pembungkus
Kapas
Tisu
Plastik Tahan Panas
Karet Gelang
Kertas Label 2.3.2. Cara Kerja
2.3.2.1 Sterilisasi dengan Autoklaf
1. Bungkus rapi alat-alat gelas yang akan disterilisasi dengan kertas pembungkus
2. Tempatkan alat dan medium yang akan disterilisasi ke dalam plastik tahan panas
3. Buka tutup autoklaf,
4. Masukkan aquades ke dalam autoklaf hingga penanda batas air, 5. Tempatkan alat dan medium ke dalam autoklaf, susun rapi 6. Tutup autoklaf,
7. Letakkan autoklaf diatas kompor gas dan nyalakan apinya
8. Tunggu hingga suhu mencapai 1210C dan tekanan sebesar 1 atm/ 15 lb (kondisi sterilisasi), jangan lupa menutup katup uap autoklaf,
9. Mulai sterilisasi selama 15 – 20 menit,
10. Setelah selesai, matikan kompor gas, tunggu hingga tekanan turun hingga 0 atm (suhu agak dingin),
11. Buka secara hati-hati penutup autoklaf,
12. Keluarkan alat dan medium dari dalam autoklaf.
2.3.2.2. Sterilisasi dengan oven
1. Siapkan semua alat yang akan disterilkan.
2. Bungkus alat dengan menggunakan kertas.
3. Masukkan ke dalam oven dan atur suhu dan waktu.
4. Setelah selesai, matikan oven dan keluarkan alat dari dalam oven
2.3.2.3. Bekerja secara aseptik
2.4. Parameter yang diamati
N o
Jam mulai Menyalakan kompor
Jam mulai sterilisasi Suhu (0C) Tekanan (lb) Alat/bahan yang disterilisasi 1
ACARA III. MEDIA DAN CARA PEMBUATAN MEDIA
3.1. Pendahuluan
Media adalah suatu bahan yang terdiri atas campuran nutrisi yang dipakai untuk menumbuhkan mikrobia. Komposisi media tumbuh bervariasi tergantung mikrorganisme target yang diinginkan untuk tumbuh. Akan tetapi,
secara umum ada kebutuhan-kebutuhan dasar yang sama yaitu air, karbon, energi, mineral dan faktor tumbuh.
Menurut Jutono et al., (1980) media dapat digolongkan berdasarkan susunan kimia, konsistensi, dan fungsinya:
Berdasarkan susunan bahan kimianya, media dapat digolongkan menjadi:
a. media sintetik yaitu media yang dibuat dari bahan-bahan yang susunan kimianya diketahui dengan pasti
b. media kompleks yaitu media yang dibuat dari bahan-bahan yang susunan kimianya belum diketahui secara pasti
c. media anorganik yaitu media yang tersusun dari bahan-bahan organik d. media organik yaitu media yang tersusun dari bahan-bahan organik
Berdasarkan konsistensinya media terdiri dari:
a. media padat (solid medium) yaitu media yang berbentuk padat b. media cair (liquid medium) yaitu media yang berbentuk cair
c. media semi padat (semi solid medium), media padat yang dapat dicairkan, apabila dalam keadaan panas berbentuk cair, sedangkan dalam keadaan dingin berbentuk padat.
Berdasarkan fungsinya, media terdiri dari beberapa jenis, yaitu:
a. media pengaya yaitu media yang ditambah zat-zat tertentu (misalnya:
serum, darah, ekstrak tanaman) sehingga dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba heterotrof tertentu.
b. media khusus yaitu media untuk menentukan tipe pertumbuhan mikroba dan kemampuannya untuk mengadakan perubahan kimia tertentu.
c. media penguji yaitu media dengan susunan tertentu yang digunakan untuk pengujian vitamin-vitamin, asam amino, antibiotik dan sebagainya .
d. media selekif yaitu media yang ditambah zat-zat tertentu yang bersifat selektif untuk mencegah pertumbuhan mikroba lain.
e. media diferensial yaitu media yang ditambahi zat kimia tertentu yang menyebabkan suatu mikroba membentuk pertumbuhan atau mengadakan perubahan tertentu sehingga dapat dibedakan tipe-tipenya.
3.2. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa mampu mengetahui cara pembuatan media dan fungsi dari masing-masing media
3.3. Prosedur Pelaksanaan 3.3.1. Alat dan Bahan
Alat :
Erlenmeyer
Gelas Ukur
Timbangan Analitik
Batang Pengaduk Kaca
Hot-Plate with Magnetic Stirrer
pH-meter
Beaker gelas
Tabung reaksi
Bahan :
Nutrient Broth (NB)
Kentang 200-250 g
Sukrosa 10 g
Agar 15-20 g
Kapas
Kasa
Tisu
Plastik Tahan Panas
Karet Gelang
Kertas Label 3.3.2 Cara Kerja
3.3.2.1 Pembuatan media Nutrien Agar (NA)
1. Timbang serbuk NB sebanyak 0,8 gram dan agar sebanyak 2 gram dengan timbangan analitik
2. Masukkan NB dan agar yang sudah ditimbang ke dalam erlenmeyer
3. Tambahkan aquades ke dalam erlenmeyer sebanyak 100 ml
4. Homogenkan dengan bantuan Besi Magnet Stirer di atas Hot-Plate 5. Ukur pH dengan menggunakan pH-meter
6. Panaskan hingga mendidih
7. Sterilisasi dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit.
8. Setelah selesai steril dan medium dalam keadaan hangat-hangat kuku tuang media ke dalam cawan petri steril secara aseptis.
3.3.2.2. Pembuatan media NA untuk biakan murni (Agar miring)
1. Timbang serbuk NB sebanyak 1,6 gram dan agar sebanyak 4 gram dengan timbangan analitik
2. Masukkan NB dan agar yang sudah ditimbang ke dalam beaker gelas 3. Tambahkan aquades ke dalam beaker gelas sebanyak 200 ml
4. Homogenkan dengan bantuan Besi Magnet Stirer di atas Hot-Plate 5. Ukur pH dengan menggunakan pH-meter
6. Panaskan hingga mendidih
7. Tuang media ke dalam tabung reaksi masing-masing 10 ml 8. Tutup tabung reaksi dengan kapas dan bungkus dengan plastik 9. Masukkan tabung reaksi yang berisi media ke dalam autoklaf 10. Sterilisasi dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit.
11. Setelah selesai steril dan medium dalam keadaan hangat-hangat miringkan tabung dengan cara diganjal menggunakan penyangga.
3.3.2.3. Pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA) 1. Pembuatan ekstrak kentang
Timbang kentang sebanyak 250 gram dan potong kecil-kecil
Kentang yang sudah dipotong-potong direbus menggunakan panci
Kentang yang sudah dalam panci ditambahkan aquades sebanyak 1000 ml
Rebus kentang selama 1-2 jam sampai lunak, kemudian diambil ekstraknya dengan menyaring menggunakan kertas saring lalu ditampung di beaker gelas baru.
2. Timbang sukrosa 1 gram dimasukkan ke dalam beaker gelas
3. Timbang agar sebanyak 2 gram dimasukkan kedalam beaker gelas yang sama
4. Beaker gelas yang sudah ditambah sukrosa dan agar dihomogenkan dengan ditambahkan ekstrak kentang sebanyak 100 ml sambil dipanaskan hingga agar larut
5. Media dituang ke dalam erlenmeyer yang ditutup menggunakan kapas dan siap untuk disterilisasi.
6. Sterilisasi dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit
7. Setelah steril dan medium dalam keadaan hangat-hangat kuku tuang media ke dalam cawan petri steril secara aseptis.
Cara Menuang Media
3.4. Parameter yang diamati
N o
Nama Medium Komposisi Medium Volume akhir pH
Serbuk medium (mg) Bahan tambahan (mg) Aquades (ml) 1
2 3
ACARA IV. ISOLASI DAN PENANAMAN MIKROORGANISME 4.1. Pendahuluan
Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba
murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. Sebelum melakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan pengambilan sampel. Prosedur dalam pengambilan sampel tanah jika mikroorganisme yang diinginkan kemungkinan berada di dalam tanah, maka cara pengambilannya disesuaikan dengan tujuan dan kebutuhan, misal jika yang diinginkan mikroorganisme rhizosfer maka sampel diambil dari sekitar perakaran dekat permukaan hingga ujung perakaran.
Menurut Jutono et al., (1980) ada bermacam-macam cara untuk mengisolasi mikrobia. Dalam isolasi tersebut harus diperhatikan beberapa hal yang penting :
1. sifat-sifat spesies mikrobia yang akan diisolasi 2. tempat hidup atau asal mikrobia tersebut 3. medium untuk pertumbuhannya yang sesuai 4. cara menanam mikrobia tersebut
5. cara inkubasi mikrobia tersebut
6. cara menguji bahwa mikrobia yang diisolasi sudah berupa biakan murni dan sesuai yang dimaksud
7. cara memelihara agar mikrobia yang diisolasi tetap merupakan biakan murni
Bakteri jarang terdapat di alam dalam keadaan murni, kebanyakan merupakan campuran bermacam-macam spesies bakteri. Ekologi bakteri sangat luas hampir dapat ditemukan dalam semua lingkungan manapun termasuk air, tanah, kawah gunung berapi, dasar laut, dan bahkan di dalam tubuh. Ada dua cara yang umum digunakan dalam isolasi bakteri yaitu: cara goresan (streak plate method), dan cara taburan (pour plate method).
Fungi adalah jasad eukariot, yang berbentuk benang atau sel tunggal, multiseluler atau uniseluler. Habitat fungi terdapat pada air dan tanah. Cara hidupnya bebas atau bersimbiosis, tumbuh sebagai saprofit atau parasit pada tanaman, hewan dan manusia. Beberapa metode isolasi jamur dari alam diantaranya yaitu: cara pengenceran-penaburan, cara isolasi dengan
mengambil spora-spora dari satu sporangium, dengan mikromanipulator, dan dengan mengecambahkan satu spora.
Sebelum dilakukan isolasi mikrobia maka dilakukan pengenceran sampel terlebih dahulu yaitu dengan metode pengenceran bertingkat. Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikrobia yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikrobia dalam sampel.
Digunakan perbandingan 1:9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1:10 sel mikrobia dari pengenceran sebelumnya.
4.2. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa mampu melakukan teknik-teknik isolasi mikrobia jenis bakteri dan jamur dari berbagai sampel
4.3. Prosedur Pelaksanaan 4.3.1. Alat dan Bahan
Alat :
Lampu bunsen
Mikropipet dan tip
Erlenmeyer
Tabung reaksi
Petridish
Bahan :
Media Nutrient Agar (NA)
Media Potato Dextrose Agar (PDA)
Spirtus
Tisu
Plastik
Kertas label
Alkohol 70%
Aquades steril
Sampel tanah rhizosfer, sampel tanah bukan rhizosfer, sampel akar yang dihaluskan, sampel daun utuh, sampel daun yang dihaluskan
4.3.2. Cara Kerja
4.3.2.1 Sterilisasi Aquades
a. Ambil tabung reaksi sebanyak 5 buah dan isikan dengan 9 ml aquades b. Ambil erlenmeyer ukuran 250 ml kemudian isi dengan 90 ml aquades c. Tutup tabung reaksi dan erlenmeyer menggunakan kapas kemudian siap
untuk disteril
4.3.2.2. Sterilisasi Area Kerja
a. Bersihkan meja kerja dari alat/bahan yang ada di atasnya, b. Usap bersih dengan menggunakan tisu,
c. Semprot merata dengan Alkohol 70%, d. Ratakan dengan tissue bersih,
e. Tunggu hingga kering, f. Nyalakan Bunsen.
4.3.2.3. Pengenceran bertingkat dan penanaman mikrobia dari bahan sampel
a. Masukkan 10 gram sampel ke dalam 90 ml aquades steril, digojog hingga homogen
b. Masukkan 1 ml larutan 10-1 ke dalam 9 ml aquades, dan digojog hingga homogen (pengenceran 10-2)
c. Lakukan hal yang sama sampai pengenceran 10-6
d. Masukkan 0,1 ml dari pengenceran 10-6 dan 10-5 ke dalam cawan petri yang berisi media NA dan diratakan menggunakan driglasky steril
e. Untuk medium PDA ambil sebanyak 0,1 ml pengenceran 10-4 dan 10-5 f. Inkubasikan cawan-cawan petri yang berisi mikrobia pada suhu kamar,
dengan posisi petridish terbalik selama 3 hari g. Amati koloni-koloni dari mikroba yang terbentuk
h. Lakukan isolasi mikroba dari bahan sampel lain dengan cara yang sama
Cara Pengambilan sampel dengan pipet
ACARA V. IDENTIFIKASI MORFOLOGI MIKROORGANISME
5.1. Pendahuluan
Bakteri adalah mikrooganisme prokariot bersel tunggal yang hanya dapat dilihat morfologinya dengan bantuan mikroskop. Berdasarkan penampakan morfologinya, bakteri dikelompokkan ke dalam bentuk: batang (bacillus), koma (vibrio), per (spiral).
Mikrobia dapat tumbuh dengan luar biasa cepat ketika tersuplai dengan nutrisi yang melimpah. Beragam tipe mikrobia akan menghasilkan tampilan koloni yang beragam pula. Karakteristik koloni yang menggambarkan morfologi suatu koloni mikrobia dapat berupa bentuk, ukuran, pigmentasi, dll. Hasil identifikasi morfologi koloni dapat digunakan sebagai teknik menentukan jenis dari mikrobia yang diisolasi. Koloni bakteri dan jamur memiliki beragam karakteristik dan terkadang justru terlihat tidak umum, namun demikian ada beberapa dasar teknik identifikasi yang dapat dilakukan untuk semua jenis koloni, yakni:
a. Ukuran : dapat berupa pinpoint/punctiform (titik), small (kecil), moderate (sedang), large (besar) dsb.
b. Bentuk : bentuk koloni yang muncul berupa sirkular, filament dsb.
c. Elevasi : tampilan elevasi yang terbentuk berupa datar, timbul dsb.
d. Tepian (Margin) : berupa lekukan, ombak, licin, tak beraturan dsb.
e. Permukaan : permukaan koloni berupa kerutan (wrinkled), halus, berkontur dsb
f. Opacity : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni, seperti transparan, buram (opaque), hampir transparan dengan sedikit distorsi (translucent), warna berubah ketika terkena cahaya (iridescent) g. Chromogenesis (pigmentasi atau warna permukaan) : pada
mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler, beberapa jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media.
5.2. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa mampu membedakan bakteri dan jamur berdasarkan kenampakan morfologi koloninya
3. Mahasiswa mampu membuat dan menyimpan biakan murni 5.3. Prosedur Pelaksanaan
5.3.1. Alat dan Bahan Alat :
Mikroskop
Colony counter
Jarum ose
Lampu bunsen
Bahan :
Petridish yang berisi hasil isolasi
Media NA agar miring
5.3.2. Cara Kerja
5.3.2.1 Identifikasi koloni tunggal
a. Diamati koloni yang tumbuh di dalam petridish dengan syarat koloni tunggal (tumbuh sendirian, maksudnya tidak tumbuh berdesak-desakan) b. Koloni yang tumbuh sendirian dilihat dibawah mikroskop dengan
perbesaran 40X dan kemudian digambar/difoto. Dengan perbesaran ini maka akan tampak bentuk yang jelas dari ukuran koloni yang kecil.
c. Elevasi dan sifat permukaan koloni dapat diketahui dengan memantulkan cahaya lampu ke cawan. Namun perlu diperhatikan bahwa tidak semua jenis bakteri memiliki koloni yang sama dengan media yang berbeda.
5.3.2.2. Pembuatan dan penyimpanan biakan murni
a. Panaskan jarum ose hingga memijar di atas bunsen,kemudian dinginkan sebentar
b. Gunakan ose yang telah dingin untuk menggores pada permukaan media agar dalam cawan petri yang terdapat koloni tunggal
c. Ambil 1 ose koloni tunggal bakteri dan goreskan pada permukaan media agar miring
d. Ose disentuhkan pada permukaan media agar dalam cawan petri, sewaktu menggores ose dibiarkan meluncur di atas permukaan agar.
e. Setiap kali menggoreskan ose untuk koloni tunggal berikutnya,pijarkan ose terlebih dahulu dan biarkan dingin.
f. Inkubasikan suhu kamar selama 24 jam dan amati pertumbuhannya.
g. Koloni yang tumbuh dalam agar miring dapat digunakan untuk acara praktikum yang lain
5.4. Parameter yang diamati
5.4.1. Tabel pengamatan jamur
No Jamur dari Karakteristik koloni
5.4.2. Tabel pengamatan bakteri
Koloni yang tumbuh Mikroorganisme dari Hari hari ke 1 Hari ke 2 Jumlah
Macam Bentuk Warna Ukuran Margin Elevasi
Penampakan (mengkilat/suram) Kepekatan
ACARA VI. PENGHITUNGAN JUMLAH MIKROORGANISME
6.1. Pendahuluan
Jumlah mikrobia pada suatu bahan dapat ditentukan dengan berbagai macam cara tergantung pada bahan dan jenis mikrobia yang akan ditentukan.
jenis populasi mikrobia dalam tanah, air, bahan makanan dll berbeda-beda tergantung dari susunan bahan tersebut. terdapat dua cara penghitungan
jumlah mikrobia yaitu perhitungan secara langsung (direct method) dan secara tidak langsung (indirect method) (Jutono et al., 1980).
Menurut Jutono et al., (1980) penghitungan jumlah mikrobia secara langsung digunakan untuk menentukan jumlah mikrobia keseluruhan baik yang hidup maupun yang mati. Beberapa cara diantaranya yaitu:
penghitungan dengan haemocytometer, penghitungan dengan pengecatan dan pengamatan secara mikroskopik, penghitungan dengan filter membran.
Penghitungan jumlah mikrobia secara tidak langsung digunakan untuk menentukan jumlah mikrobia keseluruhan baik yang hidup maupun yang mati. Untuk menentukan jumlah mikrobia yang hidup dapat dilakukan setelah suspensi bahan diencerkan beberapa kali dan ditumbuhkan dalam medium dengan cara tertentu tergantung dari macamnya bahan dan sifat mikrobia.
Beberapa metode yang dapat dilakukan yaitu: penggunaan sentrifuse, berdasarkan kekeruhan, Most Probable Number (MPN), dan berdasarkan jumlah koloni (plate count).
Penghitungan berdasarkan jumlah koloni (plate count) merupakan cara yang paling umum dilakukan dalam penghitungan jumlah mikrobia. Hasil inkubasi dalam proses isolasi mikrobia dihitung jumlah koloni tiap petridish dari masing-masing pengenceran. Dari jumlah koloni tiap petridish dapat ditentukan jumlah bakteri dalam tiap cc atau gram bahan.
6.2. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa mampu menentukan jumlah bakteri dan jamur dalam setiap gram bahan sampel yang diisolasi
6.3. Prosedur Pelaksanaan 6.3.1. Alat dan Bahan
Alat :
Mikroskop
Colony counter
Bahan :
Petridish yang berisi hasil isolasi
6.3.2. Cara Kerja
6.3.2.1. Penghitungan jumlah mikoorganisme berdasarkan jumlah koloni
a. Dihitung jumlah koloni yang tumbuh di dalam petridish dengan menerapkan syarat penghitungan koloni dibawah ini:
jumlah koloni tiap petridish antara 30-300 koloni, jika memang tidak ada yang memenuhi syarat dipilih jumlahnya yang mendekati 300
tidak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas petridish, atau disebut spreader
perbandingan jumlah bakteri dari hasil pengenceran yang berturut- turut antara pengenceran yang lebih besar dengan pengenceran sebelumnya, jika sama atau lebih kecil dari 2 hasilnya dirata-rata, tetapi jika lebih besar dari 2 yang dipakai jumlah mikrobia dari hasil pengenceran sebelumnya
jika dengan ulangan setelah memenuhi syarat hasilnya dirata-rata.
Contoh perhitungan dapat dilihat pada tabel dibawah ini:
No Pengencera n
Jumlah koloni tiap petridish
Jumlah bakteri tiap cc (gram) bahan
1 2
1 10-4 10-5
350 24
280 25
2.800.000 2 10-4
10-5
300 62
Spreader 50
4.300.000
3 10-4 315 Spreader 3.150.000
10-5 25 20 4 10-4
10-5
250 70
270 80
2.600.000
6.4. Parameter yang diamati
No Ulangan Jumlah koloni tiap
petridish Jumlah bakteri tiap cc (gram) bahan
10-4 10-5
1 1
2 2
3 3
4 4
ACARA VII. PEMANFAATAN MIKROBIA SEBAGAI PLANT GROWTH PROMOTING RHIZOBACTERIA (PGPR)
7.1. Pendahuluan
Rhizobakteri pemacu tumbuh tanaman atau yang lebih popular disebut Plant Promoting Rhizobacteria (PGPR) merupakan kelompok bakteri menguntungkan yang secara aktif mengkolonisasi daerah perakaran dan berperan penting dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman, hasil panen, dan kesuburan tanah (Wahyudi, 2009). Menurut Rai, (2006) PGPR mempunyai 3 peran utama bagi tanaman yaitu sebagai biofertilizer,
biostimulan dan bioprotektan. Beberapa jenis mikrobia yang termasuk kelompok PGPR diantaranya adalah: Azotobacter sp, Azospirillum sp, Pseudomonas sp, Bacillus sp, dan Acetobacter sp (Singh, 2013).
a. Biofertilizer
PGPR berfungsi sebagai penambat nitrogen, pelarut fosfat dan menghasilkan asam organik sehingga meningkatkan ketersediaan unsur hara mikro seperti Fe dan Mn. Bakteri yang berperan sebagai penambat nitrogen adalah Azotobacter sp dan Azospirillum sp, sedangkan bakteri yang berperan sebagai pelarut fosfat adalah Pseodomonas fluorescens.
b. Biostimulan
PGPR memproduksi ZPT/fitohormon alami seperti auksin, sitokinin dan giberellin serta memproduksi zat anti etylen, dimana zat etylen inilah yang menyebabkan tanaman cepat tua dan mati.
c. Bioprotektan
PGPR berfungsi sebagai agen antagonis atau sebagai agens hayati yang dapat mengendalikan penyakit tular tanah, seperti layu fusarium, layu bakteri, phitophtora, phytium, bulai pada jagung, dsb. Bakteri dan cendawan yang berperan sebagai agens antagonis untuk mengendalikan penyalit tular tanah adalah Pseuodomonas fliorescens, Bacillus subtilis, Trichoderma sp dan Gliocladium sp.
7.2. Tujuan
1. Mahasiswa mampu memperbanyak PGPR secara sederhana
2. Mahasiswa mampu memformulasi PGPR dalam bentuk cair dan padat 7.3. Prosedur Pelaksanaan
7.3.1. Alat dan bahan Alat :
Mikroskop
Haemocytometer
Bahan :
Biakan murni yang didapat dari hasil isolasi mikrobia
Mikropipet dan tip
2 set fermentor sederhana Galon air/jerigen 20 L Selang 3 meter
Sambungan selang 3 buah Botol aqua 3 buah
Permanganas Kalicus 1 buah Lem G 1 buah
Kapas 1 gulung
Erlenmeyer
Autoklaf
Shaker/penggojok
Botol simpan ukuran 1 L
Oven
Jarum ose
Sentrifugasi
Media perbanyakan dengan fermentor sederhana (Dedak/bekatur halus 1 kg, Gula pasir 500 gr, Terasi 100 gr, MSG 20 gr, Kapur 50 gr, air)
Media Nutrien Broth
Larutan stimulan (Manitol 1% dan seng 0,1 mM)
Formula tepung (bubuk talc, CaCO3, karboksi metil selulosa)
Aluminium foil
Alkohol 70%
Methilene blue 0,3% b/v
Aquades steril
7.3.2. Cara Kerja
7.3.2.1. Perbanyakan starter
a. Panaskan jarum ose hingga memijar di atas bunsen, kemudian dinginkan sebentar
b. Gunakan ose yang telah dingin untuk menggores pada permukaan biakan murni dalam agar miring
c. Ambil 1 ose koloni biakan murni dan dimasukkan ke dalam 25 ml media NB yang telah disterilkan yang selanjutnya disebut starter
d. Inkubasikan suhu kamar selama 24 jam dalam mesin penggojok 150 rpm e. Hitung jumlah populasi sel bakteri yang terdapat dalam media dengan cara
sampling menggunakan alat haemocytometer
a. Semprotkan alkohol 70% ke tangan dan meja yang akan digunakan untuk menghitung populasi
b. Semprot permukaan bidang haemocytometer dan cover glass dengan alkohol 70%
c. Hidupkan mikroskop dan atur intensitas cahayanya
d. Haemocytometer diletakkan di meja preparat dan dicari kamar-kamar hitungnya menggunakan mikroskop dengan perbesaran terkecil terlebih dahulu.
e. Preparasi sampel yaitu kultur hasil sampling sebanyak 100 ul dicampur dengan methilene blue 0,3% b/v sebanyak 100 ul sehingga total volume sebanyak 200 ul
f. Sebanyak 200 ul campuran sampel diambil menggunakan mikropipet kemudian diteteskan ke dalam haemocytometer
g. Jumlah sel bakteri yang berada di kotak kecil dalam kamar-kamar dihitung dengan menggunakan hand counter
h. Dipilih 5 kotak besar pada keempat kotak yang berada di setiap sudut dan satu kotak yang berada di tengah untuk dihitung kerapatan bakterinya i. Dicatat jumlah sel bakteri dan dihitung kepadatannya
7.3.2.3. Pembuatan PGPR dengan fermentor sederhana
a. Campurkan seluruh bahan untuk media perbanyakan dengan fermentor sederhana
b. Sterilisasi media tersebut dengan autoklaf selama 20 menit
c. Untuk mensterilkan galon/jerigen yang akan digunakan untuk fermentor maka rebus galon/jerigen ke dalam dandang/panci yang besar selama 20 menit
d. Masukkan media perbanyakan yang telah disteril ke dalam galon sewaktu masih panas untuk meminimalkan kontaminasi
e. Masukkan sebanyak 10 ml starter ke dalam media perbanyakan sesaat setelah dingin
f. Inkubasikan selama 7 hari sampai keluar aroma khas fermentasi, dan media perbanyakan berwarna lebih cerah dari hari sebelumnya.
g. PGPR siap untuk diaplikasikan 7.3.2.4. Formulasi cair PGPR
a. Sebanyak 10 ml (kerapatan 108 cfu/ml) starter yang berumur 24 jam dimasukkan ke dalam fermentor sederhana yang berisi 18 L media NB yang telah disterilkan
b. Inkubasikan selama 3 hari
c. Kultur tersebut dipanen dengan menggunakan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm
d. Kultur hasil panen dicuci dengan air steril (sebanyak 2 kali) untuk menghilangkan sisa media
e. Pelet yang terbentuk disuspensikan dengan air steril untuk menghasilkan kerapatan 1012 cfu/ml
f. Suspensi bakteri kerapatan 1012 cfu/ml dimasukkan ke dalam botol penyimpan (kapasitas 1 L)
g. Suspensi sebanyak 1 L ditambahkan larutan stimulan PGPR yang berupa manitol 1% dan seng dengan konsentrasi akhir 0,1 mM
7.3.2.5. Formulasi padat PGPR
a. Campurkan bahan yang terdiri dari (bubuk talc, CaCO3, karboksi metil selulosa) yang selanjutnya disebut formula tepung
b. Campuran formula tepung disterilisasi menggunakan autoklaf selama 30 menit
c. Sebanyak 100 ml suspensi bakteri pada kerapatan 1012 cfu/ml yang telah ditambahkan larutan stimulan dicampurkan dengan 10 Kg formula tepung
d. Campuran formula tepung dikeringkan ke dalam oven pada suhu 800C e. Campuran fomula tepung yang telah dikeluarkan dari oven dicampur
f. Campuran formula tepung dan PGPR dikeringanginkan (hingga kelembaban mencapai 35%)
g. Dikemas dalam alumunium foil (masing-masing 500 gr) h. Disimpan pada suhu ruang hingga siap digunakan
ACARA VIII. PEMANFAATAN MIKROBIA SEBAGAI BIOPESTISIDA
8.1. Pendahuluan
Hama dan penyakit tanaman banyak dijumpai pada setiap musim tanam dan sampai saat ini belum dapat diatasi permasalahannya. Berbagai macam pestisida kimia digunakan untuk dapat mengatasi permasalahan hama dan penyakit tanaman. Penggunaan pestisida yang berlebihan mengakibatkan timbulnya polusi. Fenomena ini perlu diantisipasi dengan mengurangi
penggunaan pestisida atau bahan kimia sintetis melalui pengendalian hayati.
Pengendalian hayati dengan memanfaatkan mikrobia antagonis untuk mengendalikan patogen tanaman dapat mendukung keseimbangan ekosistem pertanian dan mendukung keberlanjutan sistem produksi pertanian.
Penggunaan mikorbia antagonis untuk meningkatkan hasil panen dan melindungi tanaman dari organisme pengganggu tanaman (OPT) merupakan pendekatan yang menjanjikan dalam sistem pertanian modern (Kuswinanti, 2014).
Mikroba yang bersifat menguntungkan bagi tanaman, seperti rizobakteri dari kelompok Pseudomonas spp., dapat berfungsi sebagai sarana pengendali hayati patogen tanaman (McMilan, 2007). Mikroba antagonis dapat berfungsi sebagai agen pengendali hayati patogen melalui mekanisme kompetisi, antibiosis, parasitisme atau ketahanan terinduksi. Mekanisme penghambatan yang dilakukan oleh mikrobia antagonis juga ditentukan oleh metabolit sekunder yang dihasilkan. Perlakuan penggunaan mikrobia antagonis untuk mencegah timbulnya penyakit tanaman dapat dimulai sejak perlakuan benih, awal tanam, hingga awal berbunga. Berdasarkan hal tersebut, maka masalah penyakit tanaman dapat dicegah, khususnya pada tanaman di tanah yang sudah tercemar patogen.
8.2. Tujuan
1. Mahasiswa mampu memanfaatkan mikrobia dari hasil isolasi dalam pembuatan biopestisida
8.3. Prosedur Pelaksanaan 8.3.1. Alat dan Bahan
Alat :
2 set fermentor sederhana Galon air/jerigen 20 L Selang 3 meter
Sambungan selang 3 buah Botol aqua 3 buah
Bahan :
Biakan murni yang didapat dari hasil isolasi mikrobia
Media Nutrien Broth
Aquades steril
Permanganas Kalicus 1 buah Lem G 1 buah
Kapas 1 gulung
Erlenmeyer
Autoklaf
Shaker/penggojok
Sentrifugasi
Gelas beaker
Panci
Kompor
Saringan
pH meter
Alkohol 70%
Gula pasir/Molase
Kascing
KOH
8.3.2. Cara Kerja
8.3.2.1. Perbanyakan starter mikroba antagonis
a. Sebanyak 10 ml (kerapatan 108 cfu/ml) starter yang berumur 24 jam dimasukkan ke dalam fermentor sederhana yang berisi 1 L media NB yang telah disterilkan
b. Inkubasikan selama 3 hari
c. Kultur tersebut dipanen dengan menggunakan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm
d. Kultur hasil panen dicuci dengan air steril (sebanyak 2 kali) untuk menghilangkan sisa media
e. Pelet yang terbentuk disuspensikan dengan 10 ml air steril untuk menghasilkan kerapatan 1012 cfu/ml
f. Suspensi bakteri tersebut yang dimasukkan dalam media perbanyakan masal dengan konsentrasi 10%
8.3.2.2. Perbanyakan masal mikroba antagonis dalam bahan pembawa biopestisida cair
a. Campurkan kascing 10% dan kentang rebus 30% dan kemudian disaring b. Air hasil saringan ditambah gula pasir 1,5%, atau molase 10%
c. Ukur pH air hasil campuran tersebut
d. Sterilisasi air campuran tersebut menggunakan autoklaf selama 20 menit e. Masukkan air campuran yang telah disetrilisasi ke dalam fermentor
sederhana selagi masih panas untuk mengurangi kontaminasi
f. Tambahkan 10 ml suspensi bakteri dengan kerapatan 1012 cfu/ml ke dalam fermentor setelah media dalam keadaan dingin
g. Inkubasikan fermentor selama 3 minggu h. Ukur pH kembali
i. Apabila larutan biopestisida hasil fermentasi menunjukkan pH asam (1,0- 5,0), maka pada larutan tersebut ditambahkan 1 m KOH dengan tujuan mengingkatkan pH menjadi 7,4.
ACARA IX. PEMANFAATAN MIKROBIA DALAM PEMBUATAN NATA DE FRUIT
9.1. Pendahuluan
Kata nata berasal dari bahasa Spanyol yang berarti krim. Nata merupakan produk makanan yang dihasilkan dari air sari buah yang mengalami proses fermentasi dengan melibatkan bakteri Acetobacter xylinum, sehingga membentuk kumpulan biomassa yang terdiri dari selulosa
dibuat dari air kelapa, santan kelapa, tetes tebu (molases), limbah cair tebu, atau sari buah (nanas, melon, pisang, jeruk, jambu biji, strawberry dan lain- lain), sehingga pemberian nama untuk nata tergantung dari bahan baku yang digunakan. Nata de pina untuk yang berasal dari nanas, nata de tomato untuk tomat, serta nata de soya yang dibuat dari limbah tahu.
Acetobacter sp dapat diisolasi dari nanas. Isolat-isolat murni yang didapatkan tersebut dipelihara dalam medium agar miring. Untuk memastikan bahwa koloni-koloni tersebut adalah Acetobacter sp, maka dilakukan serangkaian pengujian yang bersifat spesifik yaitu pengecatan gram, pengecatan negatif dan motilitasnya (Wedhastri, 2002). Acetobacter sp merupakan bakteri gram negatif dengan sel batang pendek, tidak membentuk endospora, bersifat aerob obligat, tidak melakukan fermentasi alkohol. Secara fisik Acetobacter sp. mampu mengoksidasi glukosa menjadi rantai atau polimer yang panjang yang disebut dengan polisakarida atau selulosa berupa serat-serat putih yang merupakan metabolit sekunder, selain metabolit sekunder Acetobacter sp juga menghasilkan metabolit primer berupa asam asetat, air, dan energi yang digunakan kembali dalam siklus metabolismenya.
9.2. Tujuan
1. Mahasiswa mampu mengisolasi Acetobacter xylinum dari bahan-bahan di alam
2. Memahami prinsip kerja dari Acetobacter xylinum dalam pembuatan nata de fruit.
3. Mahasiswa mampu membuat nata de fruit.
9.3. Prosedur Pelaksanaan 9.3.1. Alat dan Bahan
Alat :
Timbangan
Pisau
Talenan
Bahan :
Karet Gelang
Alkohol 70%
Aquades steril
Baskom
Nampan
Saringan dan kain saring
Blender
Pengaduk
Kompor
Panci
Tabung reaksi
Media NB
Kertas koran
Air bersih
Gula pasir
ZA
Buah salak, buah strawbery, melon, pisang, nanas
9.3.2. Cara Kerja
9.3.2.1. Isolasi Acetobacter xylinum dari buah nanas
a. Kupas buah nanas kemudian dibusukkan selama 3-4 hari
b. Nanas yang telah busuk dipotong-potong dan dimasukkan kedalam botol yang telah ditambah air sebanyak 600 ml dan gula
c. Botol ditutup dengan kain kasa d. Inkubasikan selama 7 hari
e. Setelah 7 hari kemudian dilakukan isolasi bakteri Acetobacter xylinum seperti yang telah dilakukan pada acara sebelumnya sampai didapatkan biakan murni Acetobacter xylinum
f. Biakan murni Acetobacter xylinum tersebut yang digunakan untuk pembuatan nata de fruit
9.3.2.2. Pembuatan nata de fruit dari berbagai bahan
a. Siapkan beberapa buah yang akan digunakan dengan kriteria sudah kelewat masak atau rusak saat dipanen, kemudian dikupas dan dibuang jika ada bijinya (ditimbang sebanyak 1 kg)
b. Cuci bersih buah yang telah dikupas kemudian diblender hingga halus dengan air bersih
c. Saring hasil blender dan ambil air sarinya
d. Tambahkan 200 gram gula pasir dan 4 sendok teh ZA e. Aduk sampai larut
g. Setelah mendidih tuang media nata ke nampan sampai ± separuh penuh h. Tutup nampan berisi media nata dengan kertas koran dan diikat
kencang
i. Diamkan media nata selama sehari atau hingga dingin di tempat yang rata dan tidak mudah terguncang
j. Setelah satu hari buka sedikit nampan yang telah berisi media nata di bagian pojok nampan
k. Tuang starter nata sebanyak 10 ml secara perlahan ke dalam media nata l. Tutup kembali nampan kemudian goyang secara perlahan agar media
dan starter nata dapat bercampur rata
m. Hindari menggoyang terlalu kencang dan jangan sampai kertas penutup basah
n. Diamkan media nata selama 7-10 hari
o. Setelah 7-10 hari buka kertas penutup nampan kemudian ambil nata yang telah terbentuk
p. Cuci nata dengan air bersih
ACARA X. KULTUR JARINGAN
10.1. Pendahuluan
Organisme multiselluler mempunyai kemampuan totipotensi yaitu kemampuan sel untuk memperbanyak diri dan membentuk organisme lengkap. Kondisi ini akan terjadi jika sel tersebut ditumbuhkan pada lingkungan yang sama kondisinya dengan lingkungan aslinya. Teknik yang digunakan untuk menghasilkan tanaman baru seperti tersebut di atas adalah dinamakan teknik kultur jaringan.
Kultur jaringan merupakan salah satu perbanyakan tanaman secara vegetatif dengan cara menumbuhkan bagian-bagian tertentu dari tanaman, seperti sel, jaringan dan organ dalam kondisi yang aseptik dan secara in vitro.
Dalam teknik ini juga digunakan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi yang lengkap dan zat pengatur tumbuh serta kondisi ruang kultur yang suhu dan pencahayaannya terkontrol. Dengan teknik kultur jaringan ini maka akan didapatkan tanaman dalam jumlah yang banyak dan dalam waktu yang singkat.
Dalam teknik kultur jaringan dibutuhkan beberapa faktor untuk bisa menghasilkan tanaman seperti yang diharapkan. Salah satu faktor yang menunjang keberhasilan dalam teknik kultur jaringan adalah tahap preparasi yang terdiri dari persiapan alat dan bahan yang akan digunakan serta pada pembuatan media. Media kultur jaringan terdiri dari campuran garam-garam anorganik/garam mineral, gula, vitamin, asam amino, zat pengatur tumbuh, air serta bahan pemadat. Senyawa kimia yang terkandung dalam media kultur in vitro (unsur hara makro dan mikro) perlu disusun dalam komposisi tertentu (berimbang), karena perimbangan yang tepat akan sangat menentukan tipe pertumbuhan yang akan terbentuk dari eksplan yang akan ditanam.
Komposisi dan konsentrasi hormon pertumbuhan yang ditambahkan dalam media sangat mempengaruhi arah pertumbuhan dan regenerasi eksplan yang dikulturkan. Komposisi dan konsentrasi hormon pertumbuhan yang ditambahkan ke dalam media kultur sangat tergantung dari jenis eksplan yang dikulturkan dan tujuan pengkulturannya. Konsentrasi hormon pertumbuhan optimal yang ditambahkan ke dalam media tergantung pula dari eksplan yang dikulturkan serta kandungan hormon pertumbuhan endogen yang terdapat pada eksplan tersebut. Komposisi yang sesuai ini dapat diperkirakan melalui percobaan-percobaan yang telah dilakukan sebelumnya disertai percobaan untuk mengetahui komposisi hormon pertumbuhan yang sesuai dengan kebutuhan dan arah pertumbuhan eksplan yang diinginkan.
1. Mahasiswa mampu membuat komposisi media kultur jaringan sesuai kebutuhan
2. Mahasiswa mampu melakukan teknik kultur jaringan tanaman 10.3. Prosedur Pelaksanaan
10.3.1. Alat dan Bahan Alat :
Timbangan analitik
autoklaf
pH meter
Hot plate dan magnetic stirer
Erlenmeyer
Pipet tetes
Beaker gelas
Gelas ukur
Mikropipet dan tip
Spatula
Pinset
Gunting
Scalpel
Botol kultur
Lampu bunsen
Bahan :
Larutan stok unsur hara makro
Larutan stok unsur hara mikro
ZPT
Vitamin
MS media
NaOH
HCl
Sukrosa
Agar
Bayclin 10%
Alkohol 70% dan 90%
Alumunium foil
Detergen
Aquades steril
Kertas label
Plastik
Karet gelang
Spirtus
Tunas pucuk tanaman anggrek
Tisu steril
10.3.2. Cara Kerja
10.3.2.1. Sterilisasi Alat
a. Bungkus rapi alat-alat gelas dan peralatan untuk kultur jaringan dengan kertas
b. Masukkan alat-alat yang telah terbungkus kedalam autoklaf c. Sterilisasi dengan autoklaf selama 30 menit
d. Setelah selesai steril masukkan alat-alat tersebut ke dalam oven 10.3.2.2. Pembuatan larutan stok
a. Buat larutan stok yang terdiri dari stok hara makro, stok hara mikro, stok vitamin dan stok zat pengatur tumbuh
b. Cara pembuatan larutan stok: misalkan kita ingin membuat stok A maka dalam 1 liter media MS terdapat 1650 mg NH4NO3. Untuk memudahkan pembuatan media, konsentrasi dinaikkan 50 kali sehingga dalam 1 liter larutan stok terdapat 1650 mg x 50 = 82.500 mg = 82,50 gr NH4NO3.
Untuk mengetahui banyaknya volume yang harus diambil, dipergunakan rumus pengenceran yaitu:
V1.M1 = V2.M2
Keterangan: V1: Volume awal , M1: Konsentrasi awal, V2: Volume akhir (stok yang harus diambil), M2: Konsentrasi larutan stok
Contoh:
Berapakah volume larutan stock yang harus diambil (V2) jika dalam 1 liter media MS (V1) terdapat 1650 mg NH4NO3 (M1) dan untuk membuat larutan stok konsentrasi dinaikkan sebesar 50 kali?
Jawab: V1.M1 = V2.M2
1000 ml x 1650 mg = V2 x (1650 x 50) mg 1000ml x 1650 mg = V2 x 82500 mg V2 = 1.650.000: 82.500
V2 = 20 ml
10.3.2.3. Pembuatan Media
a. Pipet larutan stok (unsur makro, mikro, vitamin, Fe-Na-EDTA) sesuai kebutuhan
b. Masukkan dalam beaker gelas dan tambahkan aquades sampai volume yang diinginkan
c. Larutan dihomogenkan dengan menggunakan magnet stirer sambil dipanaskan diatas hot plate
d. Tambahkan sukrosa (30g/L) ke dalam beaker gelas sampai larut e. Ukur pH larutan dengan pH meter
f. Jika pH telah sesuai tambahkan agar-agar (6,7 g/L) g. Panaskan sampai mendidih dan larut sempurna
h. Tuangkan ke dalam botol kultur masing-masing 20 ml i. Tutup botol kultur dengan alumunium foil
j. Sterilisasi media menggunakan autoklaf selama 20 menit
k. Setelah selesai di sterilisasi pindahkan botol berisi media ke dalam ruang kultur dan media siap untuk digunakan
10.3.2.4. Sterilisasi Eksplan
a. Potong batang/pucuk tanaman sesuai kebutuhan (lebihkan ukuran pemotongannnya) yang selanjutnya disebut eksplan
b. Masukkan eksplan ke dalam botol yang berisi detergen dan kocok selama 10 menit
c. Bilas pada air yang mengalir
d. Masukkan eksplan ke dalam botol yang berisi bayclin 10% dan kocok selama 10 menit
e. Bilas dengan aquades
f. Masukkan eksplan ke dalam botol yang telah fungisida dan rendam selama 5 menit
g. Bilas dengan aquades
h. Masukkan eksplan ke dalam botol yang berisi aquades steril dan masukkan ke dalam Laminar Air Flow (LAF)
10.3.2.5. Penanaman Eksplan
a. Siapkan alat dan bahan serta eksplan yang telah disteril
b. Semprot LAF menggunakan alkohol 70% dan sterilkan dengan sinar UV selama 20 menit
c. Alat-alat yang akan digunakan diatur dengan rapi pada LAF, posisi scalpel dan pinset serta alkohol 90% yang akan digunakan untuk mensterilkan disebelah kiri bunsen sedangkan botol kultur di sebelah kanan
d. Masukkan eksplan ke dalam LAF
e. Ambil eksplan dan keringkan dengan tisu steril
f. Sterilisasi pinset dan scalpel dengan cara celupkan ke dalam alkohol 90%
lalu dibakar diatas bunsen setiap kali akan digunakan
g. Potong eksplan dengan scalpel dengan ditaruh diatas petridish
h. Tanam eksplan pada media tanam yang telah disteril dalam botol kultur i. Botol kultur ditutup yang telah ditanami eksplan ditutup dengan
alumunium foil dan diikat dengan karet gelang j. Simpan botol kultur pada ruang kultur
k. Amati perkembangannya selama 14 hari
10.4. Parameter yang diamati 10.4.1. Pembuatan media
No Kontaminasi
Kapan muncul Jenis kontaminan Persentase botol kultur yg terkontaminasi 1
2
10.4.2. Penanaman eksplan
No % kontaminasi Jenis kontaminan Saat muncul tunas dan akar pertama kali
Jumlah tunas dan akar per eksplan
2
DAFTAR PUSTAKA
Djaenuddin, N. 2016. Interaksi bakteri antagonis dengan tanaman: ketahanan terinduksi pada tanaman jagung. Iptek Tanaman Pangan 11(2): 143-148 Jutono, Soedarsono, J., Hartadi, S., Kabirun, S., Suhadi, dan Soesanto. 1980.
Pedoman Praktikum Mikrobiologi Umum (Untuk Perguruan Tinggi).
Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada.
Gadjah Mada University Press. Yogyakarta
Hadioetomo, R.S. 1985. Mikrobiologi Pangan dalam Praktek Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. Gramedia. Jakarta
Hanudin., Nuryani, W., Silvia, E., Djatnika, I., dan Marwoto, B. 2010. Formulasi biopestisida berbahan aktif Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, dan Corynebacterium sp. nonpatogenik untuk mengendalikan penyakit karat pada krisan. Jurnal Hortikultura 20(3): 247-261
Khamidinal. 2009. Teknik Laboratorium Kimia. Pustaka Pelajar. Yogyakarta
Kuswinanti, T., Baharuddin, dan S. Sukmawati. 2014. Efektivitas isolat bakteri dari rizosfer dan bahan organik terhadap Ralstonia solanacearum dan Fusarium oxysporum pada tanaman kentang. Jurnal Fitopatologi Indonesia 10(2): 68-72
McMilan, S. 2007. Promoting growth with PGPR. The Canadian Organic Grower.
Soil Foodweb Canada Ltd. Soil Biology Lab. &Learning Centre
Poedjiadi, A. 1984. Buku Pedoman Praktikum dan Manual Alat Laboratorium Pendidikan Kimia. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Jakarta
Rai, M.K. 2006. Hand Book of Microbial Biofertilizers. Food Products Press, An Imprint of the Haworth Press, Inc., New York
Singh, J.S. 2013. Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR): Potential Microbes for Sustainable Agriculture. Resonance
Wahyudi, A.T. 2009. Rhizobacteria Pemacu Pertumbuhan Tanaman: Prospeknya sebagai Agen Biostimulator dan Biokontrol. Nano Indonesia
Wahyudi, A. R. 2011. Pengajaran Sains di Laboratorium. Erlangga. Jakarta
Wedhastri S., 2002. Isolasi dan Seleksi Azotobacter Spp. penghasil faktor tumbuh dan penambat nitrogen dari tanah masam. Jurnal Ilmu Tanah dan Lingkungan 3(1): 45-51
Zulkarnain. 2002. Kultur Jaringan Tanaman (Solusi Perbanyakan Tanaman Budi Daya). Bumi Aksara. Jakarta.
