Luaran yang dicapai berisi Identitas luaran penelitian yang dicapai oleh peneliti sesuai dengan skema penelitian yang dipilih.
IDENTITAS JURNAL
1 Nama Jurnal JURNAL KIMIA VALENSI
2 Website Jurnal http://journal.uinjkt.ac.id/index.php/valensi/index 3 Status Makalah In review
4 Jenis Jurnal Nasional Terakreditasi (Terindeks Sinta 2) 5 Tanggal Submit 7 Agustus 2019
6 Bukti Screenshot submit
35
DAFTAR PUSTAKA
Aldrich S. 2016. Xantin Oksidase Activity Assay Kit. MAK078. Hlm. 1-4
Al-Quais K. 2015.Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak n-Heksana dan Identifikasi Senyawa Steroid Akar Rumput Bambu (Lophatherum gracile Brongn). Skripsi. Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim. Malang
Ansel HC. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Terjemahan: Farida Ibrahim, Asmanizar, Iis Aisyah, Edisi IV. UI Press. Jakarta. Hlm. 255-271, 607, 608,700
Akiyah SZ. 2013. Isolasi Senyawa Aktif Antioksidan dari Fraksi n-Heksana dari Tumbuhan Paku Nephrolepis falcata (Cav.)C.Chr. Skripsi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi Farmasi. Jakarta
Bustanji Y. Hudaib M, Tahawa K, Mohammad KH, Almasari I, Hamed S, Oran S. 2011. In Vitro Xanthine Oksidase Inhibition by Selected Jordanian Medicinal Plants. Jordania Journal of Pharmaceutical Sciences. 4(1): 49-55.
Cendrianti F, Muslichah S, dan Ulfa EU. 2013. Uji Aktivitas Antihiperurisemia Ekstrak n-Heksan, Etil Asetat, dan Etanol 70% Daun Tempuyung (Sonchus Arvensis L.) pada Mencit Jantan Hiperurisemia. Skripsi. Fakultas Farmasi Universitas Jember
Departemen kesehatan RI. 1995. Materia Medika Indonesia Jilid IV. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. Jakarta. Hlm. 182-185
Departemen kesehatan RI. 2000. Buku Panduan Teknologi Ekstrak. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. Jakarta. Hlm. 17-39Hariana A. 2007. Tumbuhan Obat dan Khasiatnya. Edisi III.
Penebar Swadaya. Jakarta. Hlm. 5
Departemen kesehatan RI. 2014. Farmakope Indonesia Edisi V. Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia. Jakarta. Hlm. 42,83
Dira, Eka F, Novita S. 2014. Uji Aktivitas Antihiperurisemia Ekstrak Etanol Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) dan Buah Asam Gelugur (Garcinia atroviridis Griff .ex. T. Anders.) secara In Vitro. Scientia. 4(2): 67-70
Furst DE, Munster T. 2002. Obat-obat Antiinflamasi Nonsteroid, Obat- obat Antireumatik Pemodifikasi Penyakit, Analgesik Nonopioid dan Obat-obat untuk Pirai. Dalam: Katzung BG. Farmakologi Dasar dan Klinik. Edisi VIII. Salemba Medika. Jakarta. Hlm 449-460
Goicoechea M, García de Vinuesa S, Verdalles U, Ruiz-Caro C, Ampuero J, RincónA. 2010. Effect of Allopurinol in Chronic Kidney Disease Progression and Cardiovascular Risk. Clinical Journal of the American Society Nephrology. 5:1388-1393
Hanani E. 2014. Analisis Fitokimia. EGC. Jakarta. Hlm. 7,9
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisa Tumbuhan. Terjemahan:
Padmawinata K, Soediro I. Edisi II. ITB. Bandung. Hlm. 147-148
Hariana A. 2007. Tumbuhan Obat dan Khasiatnya. Edisi III. Penebar Swadaya. Jakarta. Hlm. 5
Hawkins DW, Ernst ME, Clark EZ. 2008. Gout and Hyperuricemia. McGraw-Hill Companies united states. New York. Hlm. 1539,1543-1545
36
Hidayat R. 2009. Gout dan Hiperurisemia. Dalam: Jurnal Medicinus. 22(2): Hlm. 47-50
Jang IT, Hyun SH, Shin JW, Lee YH, Ji JH, Lee JS. 2014. Characterization of an Anti-gout Xanthine Oksidase Inhibitor from Pleurotus ostreatus. Mycobiology. 42(3): 296-300
Juwita R, Saleh C, Sitorus S. 2017. Uji Aktivitas Antihiperurisemia dari Daun Hijau Tanaman Pucuk Merah ( Syzygium myrtifolium walp.) terhadap Mencit Jantan ( mus musculus ) Antihyperuricemia Activity Test from Green Leaf of Plant Red Bud ( Syzygium myrtifolium walp.) to male Mice ( mus mus). Jurnal Atomik. 02(1):62–68
Karlina Y, Adirestuti P, Agustini DM, Fadhillah NL, Fauziyyah N, Malita D. 2016. Pengujian Potensi Antijamur Ekstrak Air Kayu Secang Terhadap Aspergillus niger dan Candida albicans. Chimica et Natura Acta. 4 (2): 84-87
Kato S, Ando M, Mizukoshi T, Nagata T, Katsuno T, Kosugi T, Tsuboi N, and Maruyama S. 2016.
Randomized Control Trial for the Assessment of the Anti-albuminuric Effects of Topiroxostat in hyperurisemic Patients with Diabetic Nephropathy (the ETUDE study). Nagoya Journal of Medical Science. (78): 135-142
Kemenkes RI. 2012. Indonesian Herbal Pharmacopeia. Edisi I. Jakarta. Hlm.233-236 Marjoni MR. 2016. Dasar-dasar Fitokimia. CV Trans Info Media. Jakarta. Hlm. 40
Marks DB, Marks AD, Smith CM. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar: Sebuah Pendekatan Klinis.
Terjemahan: Suyono J, Sadikin V, Mandera LI. EGC. Jakarta. Hlm. 615
Mayes PA. 2003. Oksidasi Biologi , Dalam: Murray RK, Granner DK, Mayes PA Rodwell VW. Biokimia Harper. Edisi XXV. Terjemahan: Hartono A. EGC. Jakarta. Hlm. 120
Mohan C, Long KD, Mutneja M. 2015. An Introduction to Inhibitors and Their Biological Applications.
EMD Millipore. Germany. Hlm. 9
Montgomery R, Dryer RL, Conway TW, Spector AA. 1993. Suatu Pendekatan Berorientasi-Kasus.
Biokimia. Jilid IV. Terjemahan Ismadi M. UGM Press
Murray RK, Granner DK, Rodwell VW. 2006. Biokimia Harper. Edisi XXIV. Terjemahan: Brahm U, Nanda W. Buku Kedokteran ECG. Jakarta. Hlm. 65-77
Nasrul E, Safitri. 2012. Tinjauan Pustaka Hiperurisemia pada Pra Diabetes. 1(2):86–91 Ngili Y. 2013. Biokimia dasar. Penerbit Rekayasa Sains. Bandung: 351-354
Noerfitriani F. 2016. Uji Penghambatan Xantin Oksidase Dengan Ekstrak Polisakarida Jamur Shiitake (Lentinula adodes (Berk.) Pegler.) secara in vivo pada Mencit Hiperurisemia. Skripsi. Fakultas Farmasi dan Sains UHAMKA, Jakarta
Nurshiam I. 2016. Uji Penghambatan Xantin Oksidase dengan Ekstrak Poliakarida Jamur Tiram Putih (Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm.) secara in vitro pada mencit Hiperurisemia. Skripsi. Fakultas Farmasi dan Sains UHAMKA, Jakarta
O’Neil MJ, Ieckelman PE, Koch CB, Roman KJ, Kenny CM, D’Arecca. 2006. An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals. Edisi XIV. Merck. USA. Hlm. 1075
Patcher P, Nivorozhkin A, Szabo C. 2006. Therapeutic Effects of Xanthine Oksidase Inhibitors:
Renaissance Half a Century After the Discovery of Allopurinol. Pharmacological Reviews. 59(1):
87-114
37
Pertamawati, Hardiyuna M. 2015. Uji Penghambatan Aktivitas Enzim Xantin Oksidase terhadap Ekstrak Kulit Kayu Secang (Caesalpinia sappan L.). Dalam: Jurnal Ilmiah Farmasi. 3(2):12-17
Priyanto. 2008. Farmakoterapi & Terminologi Medis. Lenkonfi. Jakarta. Hlm.109
Putri NE, Rissyelly, Mauldina MG. 2016. Uji Penghambatan Xantin Oksidase secara In Vitro Ekstrak Kulit Rambutan. Pharmaceutical Sciences and Research ISSN 2407-2354. 3(1): 12-20
Rizki KP, Muslichah S, Ningsih IY. 2018. Pengaruh Pemberian Kombinasi Ekstrak Etanol Daun Sidaguri (Sida rhombifolia L.) dan Rimpang Jahe Merah (Zingiber officinale Rosc.) pada Mencit Jantan Hiperurisemia (Effect of the Combination of Ethanol Extracts Sidaguri Leaves (Sida rhombifolia L.) and Red Ginger Rhizome (Zingiber officinale Rosc.) in Hyperuricemic Male Mice). e-Jurnal Pustaka Kesehatan.6(2):205-211
Rustamsyah A, Islami SN, Fitriana, dan Kusmiyati M. 2016. Akitivitas Penghambatan Enzim Xantin Oksidase Seduhan dan Ekstrak Etanol Teh Putih (Camellia sinensis L.). Jurnal Penelitian Teh dan Kina. 19(2): 196-201
Safira A, Sumiwi SA. 2017. Aktivitas Antihiperurisemia Beberapa Tanaman di Asia. Jurnal Farmaka.
15(1):53–66
Stryer L. 2000. Biosintesis Nukleotida. Dalam: Zahir SS, Setiadi E (Eds). Biokimia. 4(2). Terjemahan:
Sadikin M. EGC. Jakarta. Hlm. 756
Tonius J, Wibowo MA, Idiawati N. 2016. Isolasi dan Karakterisasi senyawa steroid Fraksi n-Heksan Daun Buas-Buas (Premna serratifolia L.). Jurnal Kimia dan Kemasan. 5(1):1-7
Utomo AB. 2017. Uji Penghambatan Aktivitas Enzim Xantin Oksidase oleh Ekstrak Polisakarida Jamur merang (Volvariella Volvacea (Bull.) Singer) secara In Vitro. Skripsi. Fakultas Farmasi dan Sains UHAMKA, Jakarta
Wahyudi P, Dwitiyanti, Zaelani BAQ, Maharani N. 2017. Uji Aktivitas Inhibitor Xantin Oksidase dari Ekstrak Polisakarida Jamur Tiram Putih (Pleurotus ostreatus (Jacq.) P.Kumm) dan Jamur Kancing (Agaricus bisporus (J.E.Lange) Imbach) secara In Vitro. Media Farmasi. 14(1):29-42
Wajdie F, Kartika R, Saleh C. 2018. Uji Aktivitas Antihiperurisemia dari Ekstrak Etanol Daun Kluwih (Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg) terhadap Mencit Jantan (Mus musculus).. Jurnal Atomik.
03 (2):111-115
38 LAMPIRAN
Lampiran 1. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis Fraksi n-heksan
Alkaloid (366nm) Alkaloid (254nm)
Saponin (366nm)
Saponin (254nm)
39
Terpenoid (366nm)
Terpenoid (254nm)
Perhitungan Rf Kromatrografi Lapis Tipis.
Rf =
1. Rf Alkaloid =
= 0,30 cm
2. Rf Saponin =
= 0,51 cm
3. Rf Terpenoid =
= 0,46 cm
40
Lampiran 2. Hasil Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Fraksi Etil Asetat
Tanin Flavonoid
Terpenoid Saponin
41 Alkaloid
Perhitungan Rf Kromatrografi Lapis Tipis.
Rf =
a. Alkaloid
Rf = = 0,40
b. Flavonoid
Rf = = 0,27
c. Tannin
Rf = = 0,64
d. Saponin
Rf = = 0,65
e. Terpenoid
Rf = = 0,53
Potensi Fraksi Kayu Secang (Caesalpinia sappan L.) Terhadap Penghambatan Xantin Oksidase Dalam Menurunkan Kadar Asam Urat
Pada Hiperurisemia Secara In Vitro
Potential of Secang (Caesalpinia sappan L.) Fraction on The Inhibition of Xantine Oxidase in Reducing Uric Acid Levels in Hyperuricemia by In Vitro
Rizky Arcinthya Rachmania, Dwitiyanti Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi dan Sains Universitas Muhammadiyah Prof. DR. HAMKA Jakarta Islamic Center Jln. Delima II/IV Klender, Jakarta Timur
Email : arcinthya.rizky@gmail.com
Abstrak
Hiperurisemia adalah kondisi dimana terjadi peningkatan kadar asam urat diatas normal sehingga dapat menyebabkan penumpukan kristal asam urat di jaringan. Xantin oksidase merupakan enzim yang berperan dalam mengkatalisis oksidasi hipoxantin menjadi xantin dan asam urat. Obat tradisional yang digunakan secara empiris untuk menurunkan asam urat adalah kayu secang. Kayu secang memiliki kandungan antara lain brazilin, alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, dan terpenoid. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menguji aktivitas fraksi n-heksan dan fraksi etil asetat kayu secang terhadap penghambatan enzim xantin oksidase. Pengujian penghambatan dilakukan dengan menggunakan microplate reader dengan panjang gelombang 570 nm. Hasil inhibisi dari pengujian yang didapatkan pada Allopurinol adalah IC50 sebesar 2,2095 μg/ml. Sedangkan pada fraksi n-heksan dan etil asetat kayu secang secara berturut-turut didapatkan IC50 sebesar 51.331,32 μg/ml, dan 9.236 μg/ml. Hasil ini menunjukan bahwa fraksi n-Heksan kayu secang kurang berpotensi untuk menghambat kerja xantin oksidase secara in vitro di bandingkan fraksi etil asetat.
Kata kunci: kayu secang, hiperurisemia, xantin oksidase, n-heksan, etil asetat
Abstract
Hyperuricemia is a condition where there is an increase in uric acid levels above normal so that it can cause a buildup of uric crystals in the tissues. Xanthine oxidase is an enzyme that plays a role in catalyzing the oxidation of hypoxanthine to xanthine and gout. Traditional medicine used empirically to reduce uric acid is secang wood. Secang wood contains, among others, brazilin, alkaloids, flavonoids, saponins, tannins, and terpenoids. The purpose of this study was to examine the activity of n-hexane fraction and ethyl acetate fraction secang wood against inhibition of the xanthine oxidase enzyme. Inhibition testing is done using a microplate reader with a wavelength of 570 nm. The inhibition results from the tests obtained on Allopurinol were IC50 of 2.2095 μg / ml. Whereas in the n-hexane and ethyl acetate fraction of Secang wood, IC50 was obtained at 51,331.32 μg / ml, and 9.236 μg / ml. These results indicate that the n-hexane fraction of secang wood has the potential to inhibit the action of xanthine oxidase in vitro compared to the ethyl acetate fraction.
Key words : secang, hyperuricemia, xanthine oxidase, n-hexane, ethyl acetate
1. PENDAHULUAN
Hiperurisemia adalah suatu kondisi dimana kadar asam urat dalam darah lebih besar dari nilai normal, pada laki-laki yang dikatakan hiperurisemia apabila kadar asam uratnya diatas 7 mg/dL dan pada perempuan diatas 6 mg/dL. Hiperurisemia apabila dibiarkan akan memicu terjadinya kerusakan ginjal seperti nefrolitiasis, nefropatiurat, dan nefropati asam urat (Cendrianti dkk. 2013).
Keseimbangan produksi dan ekskresi asam urat merupakan kunci kendali asam urat dalam darah.
Kelebihan produksi dan kurangnya ekskresi asam urat menyebabkan kadar asam urat dalam darah meningkat (Dipiro etal. 2011). Obat sintetik yang digunakan untuk hiperurisemia yaitu allopurinol.
Allopurinol bekerja mengurangi sintesa asam urat dengan cara menghambat aktivitas enzim xantin oksidase. Hipoxantin dan xantin dirombak oleh xantin oksidase menjadi asam urat, tetapi dengan adanya allopurinol xantin oksidase melakukan aktivitasnya terhadap obat ini sebagai pengganti purin(Kato etal. 2016).Allopurinol merupakan obat yang umum untuk menghambat pembentukan asam urat, tetapi tidak dapat dihindari bahwa obat ini memiliki beberapa efek samping yang merugikan (Goicoechea etal.2010).Efek samping utama dari allopurinol adalah ruam kulit, urtikaria, leukopenia, sakit kepala, dan berpotensi meningkatkan frekuensi serangan gout akut dengan inisiasi terapi. Oleh karena itu perlu penelitian lebih lanjut untuk menemukan adjuvant allopurinol sebagai inhibitor xantin oksidase (Rustamsyah dkk. 2016)
Xantin oksidase merupakan enzim yang berperan dalam mengkatalisis oksidasi hipoxantin menjadi xantin dan menjadi asam urat. Enzim xantin oksidase termasuk kelompok enzim oksido reduktase yang merupakan enzim flavoprotein dan terdapat di dalam susu, beberapa organ dan jaringan. Enzim ini berasal dari tubuh manusia yang disintesis menjadi bentuk dehidrogenase, akan tetapi dapat mudah diubah menjadi bentuk oksidase oleh proses oksidasi residu sufridil atau oleh enzim proteolisis (Patcher 2006). Pada penelitian sebelumnya, xantin oksidase dapat dihambat oleh ekstrak kayu secang (Caesalpinia sappan L.)(Pertamawati dan Mutia2015).
Kayu secang (Caesalpinia sappan L.) termasuk suku Caesalpiniaaceae yang tersebar di Indonesia.Bagian tanaman kayu secang yang digunakan sebagai obat ialah kayu.Kayu secang (Caesalpinia sappan L.) secara empiris dimanfaatkan sebagai bahan untuk pengobatan penyakit asam urat.Kulit kayu secang mengandung berbagai macam zat antara lain brazilin, alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, fenil propane, dan terpenoid. Kandungan lain dari kayu secang yaitu asam galat brasilein, delta-a phellandrene, oscimene, resin, dan resorcin (Pertamawati dan Hardhiyuna 2015).
Penelitian kulit kayu secang (Caesalpinia sappan L.) yang dilakukan oleh Pertamawati dan Hardhiyuna (2015) menyatakan kayu secang memiliki kemampuan sebagai antiasam urat. Hasil penelitian yang telah dilakukan memperlihatkan bahwa ekstrak etanol kulit kayu secang mampu menghambat aktivitas enzim xantin oksidase sampai 56,47%, sementara allopurinol mampu menghambat aktivitas enzim xantin oksidase sampai 87,47% (Pertamawati dan Mutia 2015).
Berdasarkan data empiris perlu dilakukan eksplorasi tentang pemanfaatan kayu secang sebagai antihiperurisemia dimana pada penelitian ini akan dilakukan pada tahap fraksi etil asetat dan framksi n-heksan secara in vitro unutk membukatikan bahwa kayu secang memiliki kemampuan sebagai antihiperurisemia.
2. METODE PENELITIAN Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan pada penelitian ini yaitu blender, timbangan, tabung maserasi, kain flanel, rotary evaporator,oven, waterbath , pipet mikro ,mikro tip, microplate reader, ice box, dan peralatan umum di laboratorium.
Penelitian ini bahan yang digunakan adalah serbuk kayu secang (Caesalpinia sappan L.) yang didapat dari BALITRO bogor dan juga dideterminasi di LIPI Cibinong Bogor.Etanol 70%, n-heksan, Etil asetat, dragendrof, mayer, HCl, H2SO4, logamMg, Dimetil Sulfoksida (DMSO), Kit Xantin Oksidase dari Sigma Aldrich, Akuades.Allopurinol.
Prosedur Penelitian a) Determinasi Tanaman
Kayu secang (Caesalpinia sappan L.) diperoleh dari BALITRO, Bogor, setelah simplisia diperoleh dilakukan determinasi di Herbarium Bogoriense, BalitbangBotani-PuslitbangBiologiLIPI- Bogor.Tujuandariprosesdeterminasi yaitu untuk mengindentifikasi jenis dan memastikan kebenaran simplisia.Setelah melalui proses determinasi, simplisia masuk ke tahap berikutnya yaitu proses ektraksi.
b) Pengolahan Simplisia
Simplisia yang digunakan serbuk kering kayu secang sebanyak 1500 gram. Serbuk diayak dengan pengayak nomor 40 lalu diperoleh bobot 1000 gram serbuk halus simplisia yang disimpan dalam wadah tertutup rapat.
c) Pembuatan ekstrak kayu secang
Kayu secang yang sudah dideterminasi kemudian disortir.Setelah itu simplisia dirajang, dicuci dan dikeringkan, setelah kering simplisia dibuat serbuk.Ditimbang 1 kg serbuk simplisia, kemudian diekstraksi dengan menggunakan metode maserasi dengan pelarut etanol 70%.Ekstrak yang diperoleh dipekatkan dengan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental.
d) Pemeriksaan organoleptik
Pemeriksaan organoleptik meliputi pemeriksaan bentuk, warna, bau dan rasa terhadap ekstrak air kayu secang (Depkes RI 2000).
e) Rendemen
Perhitungan rendemen dilakukan dengan menghitung jumlah ekstrak kering yang didapat terhadap jumlah serbuk kering sebelum dilakukan ekstraksi kemudian dikalikan 100% (Depkes RI 2000).
Rendemen (%) = 100% ...(1) f) Penetapan susut pengeringan
Ekstrak kering ditimbang seksama sebanyak 2 g, kemudian dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 1050C dalam oven selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum ditimbang serbuk diratakan dalam botol timbang dengan menggoyangkan botol hingga merupakan lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm.
Selanjutnya dikeringkan pada suhu 1050C hingga bobot tetap.Botol dibiarkan dalam keadaan tertutup lalu didinginkan dalam deksikator hingga suhu kamar (Depkes RI 2000).
Susut pengeringan = x 100%...(2) Keterangan : a = berat botol timbang kosong
b = berat botol timbang + 2 gram ektrak
c = berat botol timbang + berat konstan akhir/konstan g) Fraksinasi kayu secang
Setelah diperoleh ekstrak kental dilakukan fraksinasi dengan menggunakan pelarut n-heksan pada perbandingan 1:1 dalam corong pisah, kemudian dihomogenkan dengan cara dikocok sampai terbentuk 2 lapisan yaitu lapisan n-heksan dan residu etanol. Lapisan residu etanol yang telah dipisahkan dengan n-heksan kemudian difraksinasi dengan pelarut etil asetat pada perbandingan 1:1 dalam corong pisah, kemudian dihomogenkan dengan di kocok sampai terbetuk 2 lapisan, yaitu lapisan etil asetat dan etanol. Lapisan etil asetat yang telah dipisahkan dari etanol disebut fraksi etil asetat.Masing-masing fraksi diuapkan dengan rotary evaporator, kemudian diuapkan pada suhu 50oC.Hasilnya digunakan untuk pengujian selanjutnya (Nurshiam2016).
h) Identifikasi golongan senyawa kimia
Uji penapisan fitokimia dilakukan untuk mengetahui kandungan senyawa.
Tabel 1. Identifikasi Senyawa Kimia (Depkes RI 2000)
Uji Fitokimia Pereaksi Hasil Kesimpulan
Alkaloid Dragendrof Endapan merah Positif alkaloid Mayer Endapan putih Positif alkaloid
Flavonoid HCl P + Logam Mg Merah Positif flavonoid
Saponin HCl 2N Buih tidak hilang Positif saponin
Tanin FeCl₃ 1% Biru tua atau
hijau kehitaman Positif tanin Triterpenoid
dan steroid
Asam Asetat
Anhidrat + H₂ SO₄ Merah atau ungu Terpenoid
Hijau Steroid
i) Kromatografi Lapis Tipis
Larutan bahan uji dan atau pembanding yang sudah disiapkan ditotolkan pada lempeng (jarak antar totolan sekitar 1-1,5 cm) dengan volume tertentu, jarak 1,5 hingga 2 cm dari tepi bawah lempeng. Diameter totolan diusahakan sekecil mungkin dan dibiarkan mengering. Pada jarak rambat yang dikehendaki sebaiknya beri tanda. Lempeng dimasukkan ke dalam bejana (yang sudah dijenuhkan dengan fase gerak) dengan posisi tegak dan bagian tepi bawah tercelup dalam fase gerak, tetapi totolan tidak sampai terendam, bejana ditutup rapat dan fase gerak dibiarkan merambat hingga batas jarak rambat. Lempeng dikeluarkan dan dikeringkan di udara kemudian perhatikan bercak yang timbul dengan sinar tampak, ultraviolet pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Selanjutnya diukur dan dicatat jarak rambat setiap bercak yang timbul dan fase gerak dari titik penotolan sehingga diperoleh nilai Rf atau Rx (Rx= jarak rambat bercak dibagi jarak rambat pembanding). Lempeng disemprot dengan pereaksi yang sesuai, warna yang terjadi dicatat pada setiap pengamatan. Kadang- kadang pengamatan yang dilakukan sesudah penyemprotan memerlukan suhu yang lebih tinggi agar pembentukan warna lebih optimum. Setiap kali pengamatan sebaiknya dilakukan pada suhu yang sama (Hanani 2015).
Rf = ...(3)
Tabel 2. Skema Penapisan Fitokimia dengan Metode KLT (Harborne 1987, Yanti 2014) Senyawa Fase diam Fase gerak Pereaksi
sepmprot
Hasil positif Flavonoid Silika Gel
GF254
n-heksan : etil asetat (5 : 5)
Amonia Bercak berwarna ungu dilihat pada sinar UV 366 nm Saponin Silika Gel
GF254
CHCl3 : MeOH (10 : 1)
Vanilin – Asam Sulfat
Bercak berwarna kuning dilihat pada
sinar tampak Alkaloid Silika Gel
GF254
Kloroform : MeOH (9 : 1)
Dragendorff Bercak berwarna coklat dilihat pada
sinar tampak Tanin Silika Gel
GF254
n-heksan : etil asetat (3 : 7)
FeCl3 Bercak berwarna biru dilihat pada
sinar tampak Terpenoid Silika Gel
GF254
Kloroform : metanol (10 : 1)
Liebermann- Bouchard
Bercak berwarna coklat dilihat pada
sinar tampak j) Pembuatan larutan enzim xantin oksidase
Enzim yang ada dalam vial diencerkan dengan 220 μl aquadest, kemudian dihomogenkan dan terbentuk larutan enzim.
k) Pembuatan substrat xantin oksidase
Substrat yang ada dalam vial di encerkan dengan 220 μl aquadest, kemudian dihomogenkan dan terbentuk larutan substrat.
l) Pengujian Kontrol Blangko
Pengujian kontrol blangko ini merujuk pada modifikasi Sigma Aldrich 2017, pada panjang gelombang 570 nm larutan kontrol blangko diukur serapannya menggunakan microplate reader setelah inkubasi selesai. Sebelumnya, substrat xantin 2 μl, dapar 46 μl, dan 2 μl enzim xantin oksidase dicampur ke dalam lempeng mikro, lalu diinkubasi selama 20 menit pada suhu 25°C. Penambahan enzim dilakukan di atas ice box untuk menyambungkan waktu dari tiap plate.
m) Pengujian Kontrol Allopurinol
Pengujian kontrol allopurinol ini merujuk pada modifikasi Sigma Aldrich 2017, pada panjang gelombang 570 nm larutan kontrol allopurinol diukur serapannya menggunakan microplate reader setelah inkubasi selesai. Ditimbang allopurinol 10 mg dilarutkan terlebih dahulu dengan 5 tetes dimetil sulfoksid (DMSO) hingga larut dan dicukupkan volumenya menggunakan air bebas karbondioksida sampai 100 ml, sehingga didapat konsentrasi 100 μg/ml. Pengujian kontrol allopurinol ini dibuat 6
konsentrasi (1, 2, 4, 6, 8, dan 10 μg/ml). Sebelumnya, substrat xantin 2 μl, larutan allopurinol 2 μl, 44 μl dapar, kemudian ditambahkan enzim xantin oksidase 2 μl lalu dicampurkan ke dalam masing- masing lempeng mikro, lalu diinkubasi selama 20 menit pada suhu 25 °C. Penambahan enzim dilakukan di atas ice box untuk menyamakan waktu inkubasi dari tiap plate.
n) Pengujian Larutan Fraksi
Pengujian kontrol uji ini merujuk pada modifikasi Sigma Aldrich 2016, pada panjang gelombang 570 nm campuran larutan kontrol uji sebanyak 100 μl diukur serapannya menggunakan microplate reader.
Tabel 3.Uji Aktivitas Fraksi n-Heksan dan etil asetat Kayu Secang Terhadap Penghambatan Enzim Xantin Oksidase
Larutan Kontrol Blanko Kontrol Allopurinol
Larutan Fraksi Enzim Xantin Oksidase
(dilarutkan dengan 220μl aquadest)
2 μl 2 μl 2 μl
Substrat Xantin Oksidase (dilarutkan dengan 220μl
aquadest)
2 μl 2 μl 2 μl
Dapar Fosfat 46 μl 44 μl 44 μl
Allopurinol 1 mg + DMSO 5
tetes + aquadest ad 100 ml - 2 μl -
dibuat konsentrasi 1,2,4,6,8 dan 10 μl Fraksi n-heksan atau etil asetat
kayu secang 1 g + DMSO 5 tetes + aquadest ad 10 ml
- - 2 μl
dibuat konsentrasi 1,10,100,1000 dan 100.000 μg/ml
diukur pada panjang gelombang 570 nm di inkubasi selama 20 menit pada suhu 25
°C
Ditimbang 1000 mg kemudian dilarutkan terlebih dahulu dengan 5 tetes di dimetil sulfoksid (DMSO) hingga larut dan dicukupkan volumenya menggunakan air bebas karbondioksida sampai 10,0 ml, sehingga diperoleh konsentrasi 100.000 μg/ml. Kemudian dibuat menjadi 5 konsentrasi (1, 10, 100, 1000, dan 10000 μg/ml). Sebelumnya, substrat xantin 2 μl, enzim xantin oksidase 2 μl, dan dapar 44 μl ditambahkan larutan fraksi n-heksan dan etil asetatsebanyak 2 μl dengan konsentrasi 1, 10, 100, 1000, dan 10000 μg/ml dicampurkan pada masing-masing lempeng mikro. Penambahan enzim dilakukan di atas ice box untuk menyamakan waktu inkubasi dari tiap plat.
o) Analisa Data
Perhitungan persentase penghambatan xantin oksidase dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Penghambatan Xantin Oksidase (%) = x 100%...(4) Keterangan: A = Absorbansi larutan uji tanpa fraksi/blangko
B = Absorbansi larutan uji dengan fraksi
Dari persen inhibisi yang didapatkan kemudian dilakukan analisis probit untuk mendapatkan IC50.Nilai IC50 menunjukkan jumlah penghambatan yang dibutuhkan untuk mencapai penghambatan 50% enzim. IC50 ditentukan melalui regresi linier dimana sumbu x menunjukkan konsentrasi sampel dan sumbu y menunjukkan % penghambatan dengan mendapatkan hasil a, b, dan r. Dari persamaan y
= a + bx dapat dihitung nilai IC50 menggunakan rumus berikut:
IC50 = ...(5)