BAB III
OBJEK/BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.1 Objek, Bahan dan Alat Penelitian 3.1.1 Objek Penelitian
Objek pada penelitian ini adalah bakteri Streptococcus pyogenes yang di biakan di Laboratorium Politeknik Analisis Kesehatan Bandung (Poltekkes Bandung).
3.1.2 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan pada penelitian adalah air perasan buah lemon lokal dan impor. Buah lemon lokal dan impor diperoleh dari supermarket modern yang ada di Bandung. Serta antibiotik penicilin yang diperoleh dari apotek di Bandung sebagai kontrol positif.
A. Kriteria Inklusi
Biakan bakteri Streptococcus pyogenes koleksi Laboratrium Terpadu Politeknik Kesehatan Bandung.
B. Kriteria Ekslusi
Biakan bakteri Streptococcus pyogenes yang terkontaminasi.
3.1.3 Alat Penelitian
Alat penelitian yang digunakan adalah : A. Alat perasan buah lemon
B. Inkubator C. Cawan petri
D. Tabung Erlenmeyer E. Jarum ose
F. Tabung Reaksi G. Pengaduk H. Hand gloves I. Pipet hisap J. Kertas cakram K. Bunsen burner L. Cotton swab
3.2 Jumlah Sample
Penentuan besar sampel pada penelitian ini dengan menggunakan Rumus Frederer.
(r-1)(t-1) ≥ 15 Keterangan: r: jumlah pengulangan
t: jumlah kelompok perlakuan
(r-1)(t-1) ≥ 15 (r-1)(6-1) ≥ 15
5r-5 ≥ 15 5r-5 ≥ 15 5r ≥ 20 r
≥ 4
Berdarkan penghitungan diatas dilakukan pengulangan percobaan untuk metode dilusi sebanyak 4 kali pengulangan.
3.3 Metode Penelitian
3.3.1 Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian ini yaitu eksperimental murni labolatorium secara in vitro.
3.3.2 Variable Penelitian
Variabel-variabel pada penelitian ini yaitu:
A. Variabel bebas: Konsentrasi Air perasan buah lemon lokal dan impor.
B. Variabel terikat: Luas zona hambat air perasan buah lemon lokal dan impor terhadap bakteri Streptococcus pyogenes, konsentrasi hambat minimal (KHM) dan konsentrasi bunuh minimal (KBM) dari air perasan buah lemon lokal dan impor terhadap bakteri Streptococcus pyogenes.
C. Variabel terkendali: Suhu, waktu inkubasi, dan media pertumbuhan.
3.3.3 Definisi Oprasional Tabel 3.1 Definisi Oprasional
No. Variabel Definisi Oprasional Skala Ukur Skala 1. Zona Hambat
Bakteri
Mengukur diameter zona hambat disekitar cakram dengan diukur oleh jangka sorong.
Diameter dalam milimeter (mm)
Numerik
2. Konsentrasi Hambat Minimal
Konsentrasi air perasan buah lemon lokal dan impor yang dibutuhkan untuk menghambat pertumbuhan bakteri Streptococcus pyogenes dengan metode dilusi.
Dinyatakan KHM apabila menunjukan bening.
Konsentrasi dalam persen (%)
Numerik
3. Konsentrasi Bunuh Minimal
Konsentrasi air perasan buah lemon lokal dan impor yang dibutuhkan
untuk membunuh
pertumbuhan bakteri Streptococcus pyogenes dengan metode dilusi.
Dinyatakan sebagai KBM apabila tidak menunjukan
pertumbuhann bakteri.
Konsentrasi dalam persen (%)
Numerik
4. Konsentrasi Air perasan buah lemon lokal
Daging buah lemon lokal yang di peras lalu di saring untuk diangkat biji dan bulirnya sehingga di dapatkan air perasan buah lemon lokal.
Konsentrasi dalam persen (%)
Numerik
5. Konsentrasi Air perasan buah lemon impor
Daging buah lemon impor yang di peras lalu di saring untuk diangkat biji dan bulirnya sehingga di dapatkan air perasan buah lemon impor.
Konsentrasi dalam persen (%)
Numerik
3.3.4 Prosedur Penelitian
3.3.4.1 Pembuatan Air Perasan Buah Lemon
1. Buah lemon dicuci terlebih dahulu dengan menggunakan akuades steril 2. Lalu buah lemon dipotong secara melintang menggunakan pisau steril.
3. Potongan buah lemon tersebut kemudian diperas dengan menggunakan alat pemeras jeruk yang steril lalu airnya ditampung dalam gelas ukur steril.
4. Air hasil perasan tersebut kemudian disaring menggunakan kertas saring untuk memisahkan biji dan bulir lemon.
3.3.4.2 Pembuatan Suspensi Bakteri Cara pembuatan suspense bakteri adalah :
1. Ambil bakteri Streptococcus pyogenes dari stok menggunakan ose.
2. Masukan ose kedalam larutan NaCl 0,9% lalu homogenkan.
3. Kekeruhan disesuaikan dengan standar turbiditas 0,5 McFarland (0,05ml BaCl2 konsentrasi 1% dicampurkan dengan 9,95ml H2SO4 dengan konsentrasi 1%) setara dengan jumlah bakteri 1,5 × 108 CFU/ml.
3.3.4.3 Persiapan agar Muller-Hinton
1. Tuangkan larutan agar yang masih panas pada cawan petri.
2. Kemudian homogenisasi dengan cara menggoyangkan cawan.
3. Cawan ditutup dan diamkan sampai mengeras.
3.3.4.4 Persiapan Cakram
Kertas saring yang digunakan adalah Whatman filter nomor 1 dengan diameter 5mm kemudian disterilisasi dengan autoklaf. Kertas saring dengan bentuk cakram ini kemudian ditetesi dengan air perasan buah lemon lokal dan lemon impor dengan konsentrasi 100%.
3.3.4.5 Prosedur Uji Sensitifitas metode difusi A. Prosedur Inokulasi pada Media
1. Ambil cotton swab steril
2. celupkan cotton swab kedalam suspensi bakteri
3. buang suspensi yang berlebihan dengan cara menekan cotton swab pada sekeliling dinding tabung
4. goreskan cotton swab ke seluruh permukaan agar
5. lakukan penggoresan sebanyak 2 kali atau lebih pada seluruh permukaan sampai homogen.
B. Penempelan Cakram Pada Media
1. Siapkan cakram yang telah diteteskan dengan konsentrasi 100%, aquades sebagai kontrol negatif dan eritromisin sebagai kontrol positif.
2. Cakram kemudian diletakan di atas media yang sebelumnya telah diinokulasi.
3. Tiap cakram dipastikan kontak langsung dengan permukaan media secara keseluruhan.
C. Pembacaan Hasil dan Interpretasi
1. Setelah diinkubasi, setiap cawan diamati zona inhibisi berwarna bening yang tidak ditumbuhi bakteri.
2. Diameter dari zona hambat diukur dengan satuan milimeter menggunakan jangka sorong.
3. Menurut kriteria Greenwood zona hambat yang telah diukur dapat diklasifikasikan berdasarkan klasifikasi respon hambatan pertumbuhan bakterinya, yaitu:25
a) Sensitif atau kuat apabila besar zona hambat >20mm,
b) Intermediet atau sedang apabila besar zona hambat 16-20mm, c) Resisten atau lemah apabila zona hambat 1-15mm.
3.3.4.6 Prosedur Uji Sensistivitas :Konsentrasi Hambat Minimum
1. Siapkan 11 buah tabung dan masukan masing-masing 1mL akuadestilata.
Dengan diberi label sesuai konsentrasi dengan warna biru untuk lemon lokal dan hitam untuk lemon impo, dan label (-) untuk kontrol negatif yaitu akudest.
2. Two-fold serial dilution: Ambil 1mL air perasan buah lemon lokal dan impor dengan konsentrasi 100%, lalu masukan ke tabung IA lemon lokal dan IB lemon impor yang berisi 1mL akuadestilata lalu homogenkan.
3. Ambil 1mL larutan dari tabung IA dan IB kemudian masukan ke tabung IIA dan IIB yang berisi 1mL akuadestilata.
4. Ulangi prosedur 2 dan 3 pada tabung selanjutnya sampai tabung VA dan VB.
5. Ambil 1cc bakteri dengan standar kekeruhan 0,5 mcFarland dan masukan ke tabung reaksi I, II, III, IV, dan V pada label A dan B.
6. Pada tabung ke VI hanya dimasukan 1mL bakteri sebagai kontrol.
7. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 370C.
8. Amati kekeruhan pada masing-masing tabung dan bandingkan kekeruhan dengan kontrol.
9. Interpretasikan hasil dari konsentrasi hambat minimal jika tidak menunjukan pertumbuhan bakteri (tidak keruh).
3.3.4.7 Prosedur Uji Sensistivitas :Konsentrasi Bunuh Minimum
1. Ambilkan suspensi dari setiap tabung KHM yang bening menggunakan ose.
2. Goreskan pada agar Muller-Hinton
3. Inkubasi pada suhu 370 C selama 24 jam.
4. Lalu interpretasikan, apakah terjadi pertumbuhan atau tidak, selanjutnya konsentrasi yang tidak menunjukan adanya pertumbuhan dinyatakan sebagai konsentrasi bunuh minimum (KBM).
3.3.5 Analisis Data
Hasil yang diperoleh akan diuji dengan menggunakan uji normalitas dengan menggunakan metode Shapiro-Wilks karena sampel pada penelitian ini <
50. Jika sebaran data tidak normal (P<0.05) maka akan dilakukan uji alternatif yaitu uji Kruskal-Wallis selanjutnya dilakukan dilakukan uji Mann Whitney, jika sebaran normal (P > 0,05) lalu akan dilanjutkan oleh uji ANOVA. Uji ini bertujuan untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan antara dua kelompok perlakuan.
Apabila uji tersebut didapatkan hasil yang bermakna maka akan di lanjutkan oleh analisis post-hoc dengan uji Tukey untuk mengetahui kelompok perlakuan yang bermakna.
3.3.6 Skema dan Alur Penelitian
Pengambilan Sample Lemon lokal dan lemon impor dari perkebunan lemon
Lembang.
Biakan bakteri Streptococcus pyogenes, dan pembuatan air perasan buah lemon lokal dan impor di Laboratorium Terpadu Poltekes Bandung
Pembuatan Suspensi bakteri di Laboratorium Terpadu Poltekes Bandung.
Pembuatan Agar Muler Hinton di Laboratorium Terpadu Poltekes Bandung
Persiapan cakram air perasan buah lemon lokal dan impor dalam konsentrasi 100%, aquades dan eritromisin.
Uji sensitivitas metode difusi : dari air perasan buah lemon lokal dan impor
Uji sensitivitas dilusi :KHM, KBM dari air perasan buah lemon lokal dan impor
Interpretasi dan Analisis Data
3.3.7 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Juli-Agustus 2019 3.3.8 Aspek Etika Penelitian
1. Setiap kegiatan yang dilakukan oleh peneliti harus memiliki izin dari institut terkait. Seperti permintaan determinasi Lemon ke Labolatorium SITH ITB.
2. Bakteri yang telah ditentukan harus sesuai standar.
3. Setiap prosedur yang dilakukan di labolatorium Poltekkes Bandung untuk biakan bakteri dan uji sensitivitas harus sudah terstandar. Serta labolatorium harus memiliki standar Chemical savety, Fire Safety, Electrical Savety, dan Biosafety yang bisa menjaga peneliti serta laboran dari bahaya kebakaran, bahaya kimia, bahaya tersengat listrik dan bahaya yang ditimbulkan oleh bakteri patogen yang diteliti.
4. Setelah prosedur penelitian selesai maka setiap bakteri yang digunakan harus dimusnahkan menggunakan autoklaf untuk mencegah penyebaran yang tidak diinginkan.
5. Setiap proses yang dilakukan oleh peneliti dilakukan secara sistematis dan berdasarkan ilmiah.
