844 J. Nat. Prod. 1998, 61, 844-847
Cembranoid Sitotoksik Baru dari Karang Lunak Sinularia flexibilis
Chang-Yih Duh,*,† Shang-Kwei Wang,‡ Hsien-Kai Tseng,† Jyh-Horng Sheu,† dan Michael Y. Chiang§
Departemen Sumber Daya Kelautan, Universitas Nasional Sun Yat-sen, Kaohsiung, Taiwan, Republik Rakyat Tiongkok, Departemen Mikrobiologi, Sekolah Tinggi Kedokteran Kaohsiung, Kaohsiung, Taiwan, Republik Rakyat Tiongkok, dan Departemen Kimia, Universitas Nasional Sun Yat-sen, Kaohsiung, Taiwan, Republik Rakyat Tiongkok
Diterima 29 Januari 1998
Tiga diterpen cembranoid sitotoksik baru, sinuflexolide (1), dihydrosinuflexolide (2), dan sinuflexibilin (3), telah diisolasi dari karang lunak Sinularia flexibilis. Struktur senyawa 1-3 ditentukan dengan analisis spektral dan kristalografi sinar-X.
Dalam pencarian zat bioaktif dari organisme laut, karang lunak Sinularia flexibilis (Quoy dan Gaimard) (Alcyoniidae) (Alcyoniidae) dipilih untuk dipelajari karena ekstrak CH2 Cl2 menunjukkan sitotoksisitas yang signifikan pada kultur sel A549 (adenokarsinoma paru manusia), HT-29 (adenokarsinoma usus besar manusia), KB (karsinoma epidermoid manusia), dan P-388 (leukemia limfositik tikus) sebagaimana ditentukan oleh prosedur standar.1,2 Fraksinasi yang dipandu oleh bioassay menghasilkan isolasi tiga diterpen cembranoid sitotoksik baru, sinuflexolide (1), dihydrosinuflexolide (2), dan sinuflexibilin (3).
Senyawa 1 diperoleh sebagai prisma tak berwarna, tl 172-173 ° C. HRMS menetapkan rumus molekul C H O20325 , dan spektrum IR-nya (νmax 3406, 1716 cm-1 ) menunjukkan adanya gugus hidroksi dan ester tak jenuh R, ß - ester tak jenuh atau gugus lakton enam- berantai, secara spektroskopi. Spektrum1 H NMR 1 menunjukkan dua doublet pada δ 6,42 dan 5,69 (masing-masing 1H) dengan kopling alilik 2,4 dan 2,2 Hz, yang mengindikasikan adanya lakton ekso- metilena terkonjugasi. Fitur lain dari spektrum termasuk doublet doublet pada δ 5,22 (J
) 4,8, 11,7 Hz) dan singlet metil lebar pada δ 1,64 yang mengindikasikan gugus -C(CH3 )dCH-, dua singlet tiga proton tajam pada δ 1,37 dan 1,19 yang mengindikasikan dua gugus metil tersier, doublet satu proton dari doublet
* Kepada siapa korespondensi harus ditujukan. Tel.: 886-7-525- 2000 ext. 5036. Faksimile: 886-7-525-5020.
† Departemen Sumber Daya Kelautan, National Sun Yat-sen University.
‡ Sekolah Tinggi Kedokteran Kaohsiung.
§ Departemen Kimia, Universitas Nasional Sun Yat-sen.
Subscribe to DeepL Pro to translate larger documents.
Visit www.DeepL.com/pro for more information.
Gambar 1. Struktur Molekul (Konfigurasi Relatif) Senyawa 1.
pada δ 4,06 (J) 2,0, 11,6 Hz), menunjukkan atom hidrogen pada karbon yang mengandung oksigen lakton, dan doublet satu proton doublet pada δ 3,42 (J) 5,8, 11,2 Hz) yang mengindikasikan adanya hidrogen pada karbon yang mengandung gugus hidroksil kedua. Spektrum13 C NMR menunjukkan 20 sinyal (3CH3 , 8CH2 , 4CH, dan 5C) yang nilai pergeseran kimia dan multiplisitasnya mengkonfirmasi keberadaan metilen lakton eksosiklik terkonjugasi [δ 168.3 (s), 85,2 (d), 140,9 (s), 126,1 (t)], olefin trisubstitusi [δ 127,1 (d), 136,0 (s)]
dan tiga karbon yang mengandung oksigen [δ 73,8 (d), 78,1 (s), 77,6 (s)]. Bukti spektral dengan demikian menuntut bahwa senyawa 1 adalah bisiklik dengan
dua olefin dan satu gugus karbonil. Dengan demikian, sama dengan mayoritas metabolit alcyonarian, tampaknya senyawa 1 mengandung kerangka membran.3-5 Struktur
1 ditentukan dan stereokimia relatif ditetapkan dari analisis difraksi sinar-X kristal tunggal (Gambar 1).6
Spektrum1 H NMR (Tabel 1) senyawa 2 hampir identik dengan senyawa 1 dengan pengecualian bahwa resonansi proton ekso-metilen dari senyawa 2 digantikan oleh doublet metil pada δ 1,31 (3H, J) 6,3 Hz) yang digabungkan dengan sinyal pada δ 2,06 (1H-1H 2D COSY). Penggantian gugus metilen eksosiklik 1 oleh gugus metil selanjutnya dikonfirmasi oleh spektrum13 C NMR, yang menunjukkan sinyal pada δ 15,7(s) yang sesuai dengan doublet metil δ 1,31 dalam spektrum1 H NMR (1H-13C 2D HETCOR). Relatif
S0163-3864(98)00021-4 CCC: $15.00 © 1998 American Chemical Society dan American Society of Pharmacognosy Diterbitkan di Web 06/04/1998
Catatan Jurnal Produk Alami, 1998, Vol. 61, No. 6 845
Tabel 1. Data NMR 1H dari 1-3a compd
proton 1 2 3
H-1 2.82 m 2.10 m 2,97 d (12,3)b
H-2R 1.36 m 1.46 m 1.25 m
H-2ß 2.12 m 2.02 m 2.00 m
H-3 4,06 dd (2,0, 11,6) 4,04 dd (2,7, 11,7) 3.66 d (11.8)
H-5R 1.83 m 1.72 m 1.98 m
H-5ß 1.62 m 1.70 m 1.50 m
H-6R 2.38 m 2.42 m 2.35 m
H-6ß 2.28 m 2.31 m 2.24 m
H-7 5,22 dd (4,8, 11,7) 5,25 dd (4,5, 9,0) 5.44 t (5.7)
H-9 2.16 m 2.19 m 2.18 m
H-10R 1.65 m 1.50 m 1.79 m
H-10ß 1.46 m 1.48 m 1.42 m
H-11 3,42 dd (5,8, 11,2) 3.44 d (8.7) 3.48 d (11.4)
H-13R 1.56 m 1.85 m 1.46 m
H-13ß 1.32 m 1.54 m 1.21 m
H-14 1.66 m 1.90 m 1.48 m
H-15 2.06 m
Gambar 2. Korelasi NOESY dari senyawa 3.
Gambar 3. Korelasi HMBC dari senyawa 3.
Tabel 3. Sitotoksisitas 1-3 (N) 8)
ED50 (yg / mL) dalam garis sel yang ditunjukkan
H-17 5.69 d (2.0) 1.31 d (6.3) 5.52 s
6.42 d (2.4) 6.15 s
H-18 1.37 s 1.36 s 1.09 s
H-19 1.64 s 1.63 s 1.67 s
H-20 1.19 s 1.13 s 1.08 s
OMe 3.74 s
a Pergeseran kimiawi ditentukan pada 400 MHz dalam CD OD. The
compd A549 HT-29 KB P-388
1
2 0.68
16.8 0.39
32.4 0.46
>50 0.16
3.86
3 0.72 0.22 1.73 0.27
a Untuk aktivitas yang signifikan dari senyawa murni, ED50 dari e4.0
nilai dalam ppm downfield dari TMS.
tanda kurung.
Tabel 2. Data NMR 13C dari 1-3a
3
Nilai b J (dalam Hz) dalam
Diperlukan yg/mL.1
tionalitas. Kopling 3J HMBC dari C-16 dengan meto- oksil proton dan H2 -17 mendukung penggantian fungsi lakton oleh metil ester. Spektrum1 H-NMR COSY 3 menunjukkan kopling antara 1R-H pada b 2,97 dan 2ß-H pada b 2,00 dan antara 3-H pada b 3,66 dan 2R-H pada b 1,25. Dalam spektrum NOESY 3, kopling antara 1R-H dan 2R-H serta 3ß-H dan 2ß-H membenarkan stereokimia relatif yang ditetapkan pada C-1 dan C-3. Posisi relatif gugus fungsi lainnya secara jelas didukung oleh hasil 1H-1H COSY, NOESY (Gambar 2), HMQC, dan HMBC (Gambar 3).
Senyawa 1 dan 3 menunjukkan sitotoksisitas yang signifikan terhadap pertumbuhan sel A549, HT-29, KB, dan P-388. Senyawa 2 menunjukkan sitotoksisitas yang signifikan terhadap pertumbuhan sel P-388. Nilai sitotoksisitas untuk senyawa 1-3 disajikan pada Tabel 3.
Bagian Eksperimental
Prosedur Eksperimental Umum. Titik leleh ditentukan dengan menggunakan peleburan mikro Yanagimoto
a Pergeseran kimiawi ditentukan pada 100,6 Hz dalam CD3OD.
Nilai-nilai tersebut dalam ppm downfield dari TMS.
Konfigurasi gugus metil sekunder pada C-15 ditetapkan berada pada sisi yang sama dengan proton H-1 dari cincin b-lakton melalui perbandingan data spektra1H NMR dengan data spektra dihidrosinularin [b 1,35 (3H, d, J) 7 Hz, H3 -17), 2,2 (1H, m, H-15)] dan 15- epimernya [b
1,21 (3H, H3 -17; 2,80 (1H, m, H-15)].7,8 Struktur
2 selanjutnya didukung oleh spektrum NMR 2D yang mencakup COSY, NOESY, HMQC, dan HMBC.
Rumus molekul C H O21366 ditetapkan untuk senyawa 3 dari HREIMS ditambah data1H dan13 C NMR. Spektrum IR mengandung pita karbonil pada 1718 cm-1 yang konsisten dengan keberadaan gugus ester di samping pita peregangan hidroksil yang
kuat pada 3440 cm-1. Seperti halnya 2, pergeseran kimia1H NMR (Tabel 1) dan13 C NMR (Tabel 2) dari 3 sangat mirip dengan 1 kecuali hilangnya fungsi lakton.
compd
karbon 1 2 3
C-1 36.5 d 37.1 d 36.6 t
C-2 29.8 t 32.1 t 33.7 t
C-3 85.2 d 86.2 d 71.2 d
C-4 78.1 s 75.4 s 75.8 s
C-5 38.5 t 39.7 t 39.5 t
C-6 22.5 t 23.3 t 24.3 t
C-7 127.1 d 128.7 d 128.9 d
C-8 136.0 s 135.7 s 133.9 s
C-9 36.1 t 36.5 t 35.9 t
C-10 30.0 t 32.0 t 27.8 t
C-11 73.8 d 73.3 d 70.7 d
C-12 77.6 s 74.8 s 75.3 s
C-13 35.6 t 38.9 t 34.9 t
C-14 29.2 t 28.8 t 24.4 t
C-15 140.9 s 45.7 d 146.6 s
C-16 168.3 s 177.8 s 169.6 s
C-17 126.1 t 15.7 q 124.3 t
C-18 24.8 q 24.9 q 23.7 q
C-19 16.3 q 16.2 q 16.8 q
C-20 24.7 q 24.5 q 24.1 q
OMe 52.4 q
titik peralatan dan dilaporkan tanpa dikoreksi.
Rotasi optik ditentukan pada pola rimeter JASCO DIP-181. Spektrum UV diperoleh pada spektrofotometer Shimadzu UV-160A, dan spektrum IR direkam pada spektrofotometer Hitachi 26-30.
Spektrum1 H dan13 C NMR direkam dengan spektrometer NMR Varian Unity Plus 400 NMR pada 400 dan 100,6 MHz, masing-masing, dalam CDCl3 menggunakan TMS sebagai standar internal.
Spektra EIMS diperoleh dengan spektrometer massa JEOL JMS-SX/SX 102A pada 70 eV. Silika gel 60 (Merck, 230-400 mesh) digunakan untuk kromatografi kolom; pelat silika gel yang telah dilapisi sebelumnya (Merck, Kieselgel 60 F-254, 0,50 mm) digunakan untuk KLT preparatif.
Bahan Hewan. Karang lunak S. flexibilis dikumpulkan di dekat Kenting, Taiwan, pada kedalaman 12 m dan disimpan di dalam freezer sampai ekstraksi. Spesimen voucher (NSUMR-1040) disimpan di Departemen Sumber Daya Kelautan, Universitas Nasional Sun Yat-sen.
w
D
846 Jurnal Produk Alami, 1998, Vol. 61, No. 6
Catata n
Ekstraksi dan Isolasi. Tubuh karang lunak S.
flexibilis (2 kg, berat basah) dibekukan dan diekstraksi dengan CH2 Cl2 (3 L × 3). Setelah penghilangan pelarut secara vakum, residu (300 g) dikromatografi lapis tipis di atas silika gel 60 menggunakan campuran CHCl3 dan CHCl3 - MeOH dengan peningkatan kepolaran. Elusi dengan CHCl3 -MeOH (19:1) menghasilkan fraksi yang mengandung cem-branoid 1 dan 2, yang dimurnikan dengan kromatografi partisi sentrifugal (mode menaik) menggunakan n-heksana- EtOAc-aseton-aseton-air (1: 1: 1: 1) (lapisan atas) sebagai sistem pelarut elusi. Elusi dengan CHCl3 - MeOH (9:1) menghasilkan fraksi yang mengandung cembranoid 3, yang dimurnikan dengan kromatografi kolom di atas silika gel dengan n-heksan-EtOAc sebagai pelarut elusi.
Sinufleksolida (1): 20 mg; prisma tidak berwarna; tl 172-
Tabel 4. Data Kristal dan Data Pengumpulan Intensitas untuk Sinufleksolida (1)
rumus empiris C20H30O5
FW 350.45
warna, kebiasaan tidak berwarna, prisma difraktometer yang digunakan Rigaku AFL6S
kelompok ruang P21(#4)
a, Å 10.252(4) Å
b, Å 10.483(5) Å
c, Å 10.25(2) Å
ß, derajat 116.71(8)°
V, Å3 983(1) Å3
Z 2
Dcalcd, g cm-3 1,183 g/cm3
h (Mo KR), Å 0.71069 Å
F(000) 380.00
detn sel satuan (no. 2ϴ rentang, deg) 20, ϴ (8,7- 14,5 °) jenis pemindaian ω-2ϴ Kisaran 2ϴ, derajat 13-47.2°
rentang h, k, l 0 ≈ +11, 0 ≈ +11, -11 ∼ +11
173 °C; [R] 25 -8,6° (c 0,17, CHCl3 ); UV
(MeOH) h maks y (Mo KR), cm-1 0,83 cm-1
(log ') 242 (4,1) nm; IR (CCl4 ) umax 3460, 2972, 1716
cm-1; 1H NMR lihat Tabel 1; 13C NMR lihat Tabel 2;
EIMS (70 eV) m/z [M]+ 352 (2), 334 (5), 317 (4), 301 (5), 275
(6), 209 (12), 123 (24), 55 (68), 43 (100); HREIMS m/z 352.2238 (dihitung untuk C H O20325 352.2241).
Dihydrosinuflexoilde (2): 8 mg; prisma tidak berwarna;
tl 165-167 ° C; [R] 25 -3,8° (c 0,066, MeOH); UV (MeOH) hmax (log ') 208 (4,4) nm; IR (KBr) umax 3404, 2924, 1732, 1450, 710 cm-1; 1H NMR lihat Tabel 1; 13C NMR lihat Tabel 2; EIMS m/z [M]+ 354 (5), 336 (5), 319 (4), 301 (5), 275 (8), 209 (10), 123 (26), 55 (80), 43 (100);
HREIMS m/z 354.2398 (dihitung untuk C H O20345
354.2397).
Sinufleksibilin (3): 8 mg; prisma tidak berwarna; mp 169-
ukuran kristal, mm 0,40 × 0,45 × 0,50 mm
faktor transm 0.624-1.000
suhu, K 23.0 °C
jumlah refln measd 1666
jumlah reflektor unik 1572 (Rint) 0,083) jumlah reflektor obsd (Tidak) 1134
R, a R a 0.065, 0.052
GOFa 3.96
jumlah parameter ref (Np) 224
puncak maksimum pada peta perbedaan akhir 0,27 e-
/Å3 puncak minimum pada peta perbedaan akhir -0,25
e-/Å3
a R ) [∑ ||Fo| - |Fc||/∑ |Fo|. Rw ) [∑ w(|Fo| - |Fc|)2 /∑ w|Fo| ]21/2 . GOF
) [∑ w(|Fo| - |Fc|)2 /(No - Np)]1/2 .
Tabel 5. Parameter Atom untuk Sinufleksolida (1)
170 °C; [R] 25 -3,9° (c 0,14, MeOH); UV (MeOH)
h maks
(log ') 206 (4,01) nm; IR (KBr) umax 3440, 2936, 1718, 1635 cm-1; 1H NMR lihat Tabel 1; 13C NMR lihat Tabel 2;
EIMS m/z [M] + 384 (1), 366 (2), 348 (2), 330 (1), 316 (3), 299 (3), 298 (2), 273 (4), 43 (100); HREIMS m/z 384.2506 (dihitung untuk C H O21366 384.2502).
Analisis Sinar-X Kristal Tunggal dari Sinuflexolide (1): Data cyrstal: C H O20325 , grup ruang P21 , a) 10,252 (4) Å, b) 10,483 (5) Å, c) 10,25 (2) Å, ß) 116.71- (8) °; V ) 983 (1) Å3, Z ) 2,
D calcd ) 1,183 g/cm3, h (Mo
KR)) 0,710 69 Å. Data intensitas diukur pada difraktometer Rigaku AFL6S hingga 2ϴ 47,2°.
Sebanyak 1666 refleksi (+h, +k, (l) diamati [I > 3σ- (I)]. Struktur diselesaikan dengan metode langsung (SIR92),9 dan parameter struktur akhir diperoleh dengan proses kuadrat terkecil matriks penuh.
Mengingat tidak adanya atom berat dalam struktur, pasangan Friedel tidak dikumpulkan dan konfigurasi absolut sinufleksolida (1) tidak ditentukan melalui metode difraksi. Posisi hidrogen yang dihitung dimasukkan ke dalam siklus akhir perhitungan faktor struktur tetapi tidak disempurnakan. Indeks
kesepakatannya adalah R (F)) 0,065, Rw (F)) 0,052 dengan penghalusan anisotropik yang dilakukan pada semua atom non-hidrogen. Rincian eksperimen ditunjukkan pada Tabel 4. Koordinat atom akhir dicantumkan dalam Tabel 5.
Pengujian Sitotoksisitas. Aktivitas sitotoksik senyawa atau fraksi yang diuji terhadap P-388, KB, A549, dan HT-29 diuji dengan modifikasi metode kolorimetri MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolium bromida]. Untuk sel P-388, 200 yL kultur dibuat pada 1500 sel/sumur dalam pelat kultur jaringan 96 sumuran (Falcon). Senyawa yang diuji
D
D atom x y z Beq
O(1) 0.4116(5) 0.2249 0.5329(6) 3.7(2)
O(2) 0.5146(6) 0.4451(8) 0.7151(7) 4.3(2) O(3) 1.0391(6) 0.2669(7) 0.4625(6) 2.8(1) O(4) 0.7890(5) -0.0025 0.4117(6) 3.1(2) O(5) 0.2158(6) 0.2078(9) 0.3267(6) 4.7(2) C(1) 0.5968(7) 0.2412(10) 0.3922(8) 2.6(2) C(2) 0.6331(8) 0.3142(10) 0.5331(9) 3.1(2) C(3) 0.5671(8) 0.249(1) 0.6233(9) 3.0(2) C(4) 0.5752(9) 0.318(1) 0.7550(10) 3.5(3) C(5) 0.742(1) 0.346(1) 0.8671(10) 4.2(3) C(6) 0.8431(9) 0.229(1) 0.9151(9) 3.5(2) C(7) 0.9568(8) 0.224(1) 0.8600(8) 2.8(2) C(8) 1.0000(9) 0.122(1) 0.8178(8) 2.4(2) C(9) 1.1247(8) 0.128(1) 0.7747(8) 2.9(2) C(10) 1.0829(8) 0.081(1) 0.6192(9) 3.0(2) C(11) 0.9697(9) 0.1625(9) 0.5000(10) 2.4(2) C(12) 0.8622(9) 0.0916(10) 0.3642(9) 2.4(2) C(13) 0.7456(9) 0.1817(10) 0.2553(9) 3.1(2) C(14) 0.6828(8) 0.285(1) 0.3154(8) 2.8(2) C(15) 0.4327(8) 0.247(1) 0.3045(9) 4.4(3) C(16) 0.3483(9) 0.227(1) 0.3860(10) 3.5(2) C(17) 0.3632(8) 0.242(1) 0.162(1) 5.0(3) C(18) 0.5040(9) 0.242(1) 0.8299(10) 4.8(3)
kemudian disalurkan ke pelat kultur yang telah ditetapkan
C(19) 0.940(1) -0.011(1) 0.810(1) 5.2(3) C(20) 0.9369(8) 0.021(1) 0.2876(9) 3.3(2) pada delapan konsentrasi masing-masing dengan tiga kali pengulangan. Setelah 3 hari inkubasi, sel P-388 dihitung dengan MTT.
Untuk mengukur aktivitas sitotoksik senyawa murni atau fraksi kasar terhadap A549, HT-29, KB, dan P- 388, setiap lini sel diinisiasi pada 750, 750, 2000, dan 1500 sel/sumur, masing-masing, dalam pelat mikrotiter 96 sumur. Tiga hingga delapan konsentrasi yang mencakup kisaran 8 hingga 128 kali lipat dievaluasi pada setiap garis sel. Sel A549, HT-29, KB, dan P-388 dievaluasi menggunakan MTT setelah terpapar sampel uji masing-masing selama 6, 6, 3, dan 3 hari. Lima puluh mL 1 mg / mL MTT ditambahkan ke setiap sumur, dan pelat diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 4 jam lebih lanjut.
Catatan Jurnal Produk Alami, 1998, Vol. 61, No. 6 847 mesin cuci otomatis. Kristal formazan dilarutkan
dalam DMSO (Merck) selama 10 menit dengan pengocokan, dan pelat segera dibaca pada pembaca pelat mikrotiter (Dynatech) pada panjang gelombang 540 nm. Nilai ED50 didefinisikan sebagai konsentrasi senyawa uji yang menghasilkan pengurangan 50%
absorbansi dibandingkan dengan sel yang tidak diberi perlakuan dalam uji MTT.10
Ucapan terima kasih. Kami berterima kasih kepada Prof. J. M. Pezzuto, Program Penelitian Kolaboratif dalam Ilmu Farmasi, College of Pharmacy, University of Illinois di Chicago, atas penyediaan garis sel P-388 dan KB. Penelitian ini didukung oleh hibah dari Dewan Ilmu Pengetahuan Nasional Republik Tiongkok yang diberikan kepada C.-Y. Duh.
Referensi dan Catatan
(1) Geran, RI; Greenberg, NH; MacDonald, MM; AM Schumacher, AM; Abbott, BJ Cancer Chem. Rep. 1972, 3, 1- 91.
(2) Hou, R.-S.; Duh, C.-Y.; Chiang, M. Y.; Lin, C.-N. J. Nat. Prod.
1995, 58, 1126-1130.
(3) Coll, J. C.; Hawes, G. B.; Liyanage, N.; Oberha¨ nsli, W.; Wells, R. J. Aust. J. Chem. 1977, 30, 1305-1309.
(4) Bowden, B. F.; Coll, J. C.; Hicks, W.; Kazlauskas, R.; Mitchell, S. J. Aust. J. Chem. 1978, 31, 2707-2712.
(5) Bowden, B. F.; Coll, J. C.; Mitchell, S. J. Aust. J. Chem. 1980, 33, 879-884.
(6) Data kristalografi untuk 1 telah disimpan di Pusat Data Kristalografi Cam- bridge. Data tersebut dapat diperoleh berdasarkan permintaan dari Dr. Olga Kennard, University Chemical Labora- tory, 12 Union Road, Cambridge, CB2 1EZ, Inggris.
(7) Weinheimer, AJ; Matson, JA; Hossain, MB; van der Helm, D., Tetrahedron Lett. 1977, 2923-2926.
(8) Kazlauskas, R.; Murphy, P. T.; Wells, R. J.; Schonholzer, P. Aust.
J. Kimia, 1978, 31, 1817-1824.
(9) Attomare, A.; Cascarano, M.; Giacovazzo, C.; Guagliardi, A.
J. Appli. Cryst, 1993, 26, 343-348.
(10) Mosmann, T. J. Imunol. Metode 1983, 65, 55-63.
NP980021V
