http://jurnal.fkip.uns.ac.id/index.php/jkpk
ISSN 2503-4154 (online)
33
ISOLASI, IDENTIFIKASI, DAN UJI SITOTOKSIK SENYAWA
ALKALOID DARI DAUN MINDI (Melia azedarach L.)
Fitriyani
*, Dewi Kusrini, dan Enny Fachriyah
Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas Diponegoro, Semarang, Indonesia
*Keperluan korespondensi, telp: 085643559247, email: fitriyanichemistry@gmail.com Received: July 22, 2016 Accepted: August 15, 2016 Online Published: August 31, 2016
ABSTRAK
Mindi (Melia azedarach L.) dari suku Meliaceae merupakan salah satu jenis
tanaman yang memiliki beberapa golongan senyawa salah satunya alkaloid. Daun Mindi (Melia azedarach L.) telah diekstrak dengan pelarut etanol 96% secara maserasi untuk penapisan fitokimianya. Alkaloid dapat diisolasi dari ektrak metanol-air daun Mindi dengan cara penggaraman yang kemudian diekstraksi dengan eluen etil asetat. Pemisahan alkaloid dengan KLT preparatif menggunakan eluen etil asetat:kloroform (6:4) dan uji kemurniannya dengan metode KLT berbagai eluen tunggal, campuran, dan dua dimensi. Analisis struktur terhadap isolat alkaloid menggunakan spektro meter UV-Vis, FT-IR, dan LC-MS serta uji sitotoksik ekstrak alkaloid dengan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test). Identifikasi isolat alkaloid menggunakan spektrometri UV-Vis menunjukkan alkaloid golongan indol, dengan panjang gelombang 220 nm dan 270 nm. Analisis menggunakan spektrometri FTIR menunjukan isolat alkaloid memiliki gugus fungsi N-H, O-H, CH3, CH2, C=C aromatik, C-N, dan C=O, dan analisis dengan LC-MS isolat alkaloid memiliki berat molekul 290,45 g/mol. Hasil uji sitotoksik ekstrak alkaloid menunjukkan LC50 sebesar 21,273 ppm, sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak alkaloid bersifat sangat sitotoksik.
Kata kunci: Mindi (Melia azedarach L.), alkaloid indol, BSLT
ABSTRACT
Mindi (Melia azedarach L.) from Meliaceae tribe is one kind of plant that has several classes of compounds, one is alkaloid. The Mindi leaf has been extracted using a solvent of 96% ethanol by maseration method for elucidation of its fitochemistry. Alkaloid can be isolated from methanol-water extract of mindi leaf by salting extracted with ethyl acetate eluent. Separation of alkaloids was performed by preparative TLC using the eluent ethyl acetate: chloroform (6:4) and test its purity by TLC method using eluent single variety, mix, and two-dimensional. Structure analysis of the alkaloid isolates were carried out using UV-Vis spectrophotometer, FT-IR, and LC-MS as well as test cytotoxic alkaloid extrac usingt BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) method. Identification of the alkaloid isolates using UV-Vis spectrometry showed that indole-group alkaloid has wavelengths of 220 nm and 270 nm. Analysis using FTIR spectrometry showed that alkaloids isolate has a functional group N-H, O-H, CH3, CH2, C = C aromatic, C-N and C = O. The isolat has a molecular weight of 290.45 g / mol by analysis using LC-MS. The cytotoxic test showed that LC50 of alkaloid extract of 21.273 ppm, so that it can be concluded that the alkaloid extract is highly cytotoxic.
Keywords: Mindi (Melia azedarach L.), indole alkaloids, BSLT .
PENDAHULUAN
Tanaman mindi (Melia azedarach L.)
adalah salah satu tanaman berfamili Meliaceae, yang merupakan tanaman asli dari Mexico dan Argentina. Tanaman ini dapat tumbuh di Indonesia yang beriklim tropis [7]. Dalam kehidupan sehari-hari,
tanaman mindi digunakan secara
tradisional untuk obat malaria, diabetes, batuk, penyakit kulit, dan lain-lain [3]. Penelitian lain menyatakan bahwa ekstrak daun mindi memiliki aktivitas sebagai
antibakteri, antioksidan, analgesik [2],
antidiabetes, antihipertensi, antireumatik [7], insektisida, rodentisida, dan fungisida [6].
Pada daun mindi terdapat kandungan metabolit sekunder antara lain alkaloid, tannin, saponin, fenolik, glikosida, steroid, terpenoid dan flavonoid [1]. Berdasarkan
kemotaksonomi tanaman Dysoxylum
binectanferum (Meliceae) yang telah
teridentifikasi mengandung senyawa
alkaloid yaitu chromene alkaloid dan rohitukine.
Penelitian yang dilakukan
menyebutkan bahwa tanaman mindi
memiliki aktivitas sebagai antikanker,
dengan IC50 range of 8.18- 60.10 ppm. Daun dari tanaman mindi belum banyak diteliti, oleh karena itu pada penelitian ini akan dilakukan isolasi, identifikasi, dan uji sitotoksik senyawa alkaloid dari daun mindi.
Berdasarkan informasi di atas,
penelitian mengenai isolasi alkaloid,
penentuan struktur, dan uji aktivitasnya belum banyak dilakukan. Penelitian ini akan dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa golongan alkaloid, serta aktivitas sitotoksik
ekstrak alkaloid pada daun Mindi. Hasil penelitian ini nantinya diharapkan dapat memberikan informasi mengenai jenis senyawa alkaloid yang terkandung dalam
daun Mindi (Melia azedarach L.) dan uji
sitotoksiknya.
METODE PENELITIAN
Alat dan bahan.Alat yang digunakan dalam penelitian ini
terdiri dari rotary evaporator, blender,
neraca analitik, kertas saring,erlenmeyer, pipet tetes,gelas beker, corong gelas, corong pisah, botol vial, pipa kapiler, tabung reaksi, pengaduk kaca, penangas air, cawan penguap, wadah pengembang,
lampu UV, spektrofotometer UV–Vis, FT-IR
(Perkin Elmer Spectrum Version 10.4.00, dan LC-MS.
Bahan yang diperlukan dalam penelitian ini
yaitu daun Mindi (Melia azedarach L.) dari
daerah Purworejo, Jawa Tengah, aquades, etanol 96% teknis, n-heksana teknis, kloroform teknis, etil asetat teknis, plat KLT
silika gel GF254 (Merck), plat KLT Preparatif
silika gel GF254 (Merck), n-heksana p.a.
(Merck), etil asetat p.a. (Merck), asam asetat p.a. (Merck), kloroform p.a. (Merck), metanol p.a. (Merck), asam klorida (Merck),
natrium hidroksida (Merck), pereaksi
dragendorf, pereaksi Mayer.
Ekstraksi senyawa alkaloid: Serbuk daun Mindi sebanyak 1000 g dimaserasi dengan pelarut etanol 96% selama 8 x 24 jam. Ekstrak etanol diuapkan pada kondisi vakum sampai ekstrak kental, selanjutnya dilarutkan dalam metanol dan ditambahkan aquades dengan rasio 1:1, didiamkan selama semalam untuk memisahkan antara
klorofil dengan filtrat. Simplisa dan ekstrak
yang didapatkan dilakukan analisis
penapisan fitokimia yang meliputi alkaloid, flavonoid, tanin, kuinon, saponin, dan steroid/ triterpenoid.
Isolasi Alkaloid: Fraksi yang berupa metanol–air dilakukan partisi menggunakan n-heksan dan kloroform. Fraksi metanol-air yang didapatkan dilakukan penggaraman menggunakan HCl 2 M hingga pH 3 lalu diekstraksi dengan pelarut etil asetat sehingga didapatkan lapisan asam. Pada
lapisan asam dilakukan penambahan
NH4OH hingga pH 9 kemudian dilakukan
ekstraksi kembali dengan pelarut etil asetat. Setelah itu diuapkan hingga didapatkan ekstrak alkaloid, dan dilakukan pemisahan menggunakan KLT sebagai fase diam
berupa silika gel GF254 dan eluen berupa
etil asetat : kloroform (6:4). Noda yang terbentuk dilakukan uji alkaloid dengan pereaksi Dragendorf. Noda positif alkaloid dilakukan pemisahan menggunakan KLT preparatif dengan fase diam silika gel
GF254, ketebalan 2 mm dan eluen berupa
etil asetat : kloroform (6:4).
Uji Kemurnian: Uji kemurnian isolat alkaloid dilakukan dengan KLT berbagai pelarut tunggal (etil asetat, etanol, n-heksana), campuran (etil asetat:etanol (7:3), etil asetat:etanol (8:2), etil asetat:n-heksana (7:3), etil asetat:n-asetat:n-heksana (8:2)), juga KLT dua dimensi (etil asetat: etanol (9:1) dan etil asetat: n-heksana (9:1)) hingga diperoleh satu noda.
Karakterisasi Isolat Alkaloid: Untuk mengetahui struktur isolat alkaloid yang
didapatkan, dilakukan analisis
menggunakan spektrofotometer UV-Vis, FT-IR, dan LC-MS.
Uji Aktivitas: Telur Artemia salina
dimasukkan di dalam air garam selama 2 x
24 jam. Suhu penetasan adalah ± 25-300C
dan pH ± 6-7. Telur akan menetas setelah
18–24 jam dan larvanya siap untuk uji BSLT. Sampel dari ekstrak alkaloid diambil 62,5 mg, dilakukan pengenceran dengan konsentrasi 1000, 100, dan 10 ppm. Pengujian dilakukan dengan memasukkan
10 ekor larva Artemiasalina berumur 48 jam
ke dalam botol vial yang telah berisi larutan ekstrak alkaloid. Setelah 24 jam, jumlah larva yang mati dihitung dan dilakukan analisis probit untuk menentukan aktivitas LC50 ([5].
PEMBAHASAN
Penapisan fitokimia berfungsi untuk mengetahui keberadaan golongan senyawa metabolit sekunder yang terkandung di dalam simplisia serbuk maupun di dalam ekstrak etanol. Penapisan fitokimia yang
dilakukan secara kualitatif dengan
mengidentifikasi keberadaan suatu
senyawa tanpa menentukan kadarnya. Prinsip penapisan fitokimia ialah analisis golongan kimia tumbuhan dengan uji spesifik dengan reagen yang memberikan
uji spesifik terhadap golongan kimia
tertentu. Golongan yang diidentifikasi pada penelitian ini antara lain alkaloid, flavonoid,
tanin, saponin, kuinon, steroid dan
triterpenoid. Hasil penapisan fitokimia dapat dilihat pada Tabel 1.
Pada tabel 1 menunjukkan bahwa penapisan fitokimia pada serbuk dan ekstrak etanol daun Mindi mengandung senyawa golongan alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, kuinon dan steroid. Hasil
penapisan fitokimia yang diperoleh berbeda dengan penelitian yang dilakukan [1] yang melaporkan dalam ekstrak etanol daun mindi mengandung senyawa metabolit sekunder alkaloid, tannin, saponin, fenolik, glikosida, steroid, terpenoid dan flavonoid.
Tabel 1. Hasil uji fitokimia daun Mindi
Uji Fitokimia Serbuk Ekstrak
Alkaloid + + Saponin + + Flavonoid + + Tanin + + Kuinon + + Steroid + + Triterpenoid - -
Proses isolasi alkaloid dari ekstrak
metanol-air dilakukan dengan reaksi
penggaraman menggunakan HCl 2M untuk membentuk garam alkaloid, karena alkaloid
bersifat basa sehingga apabila
ditambahkan dengan asam akan
membentuk garam. Garam alkaloid ini kemudian diekstraksi dengan pelarut etil
asetat, untuk memisahkan senyawa
alkaloid dengan senyawa yang bukan alkaloid, karena alkaloid terikat pada lapisan asam ini. Untuk membebaskan alkaloid dari bentuk garamnya, maka
ditambahkan NH4OH sampai suasana
menjadi basa, sehingga alkaloid akan terbentuk menjadi basa alkaloid kembali. Lapisan ini kemudian diekstraksi kembali dengan pelarut etil asetat, selanjutnya diuapkan hingga terbentuk ekstrak alkaloid. Untuk mengetahui ekstrak alkaloid yang didapatkan mengandung alkaloid atau tidak maka ditambahkan pereaksi Dragendorff, terbentuknya endapan merah bata berarti positif adanya alkaloid.
Ekstrak alkaloid selanjutnya
dianalisis menggunakan KLT untuk
mengetahui jumlah senyawa yang ada di dalam ekstrak (Gambar 1).
Gambar 1. Hasil KLTekstrak alkaloid
dengan eluen etil asetat:
kloroform (6:4) pada panjang gelombang 254 nm (kiri) dan
setelah disemprot pereaksi
Dragendorf (kanan)
Pada gambar 1 terlihat jumlah senyawa (noda) ada 4 dengan harga Rf masing-masing 0,22; 0,36; 0,64; dan 0;89. Selanjutnya disemprot dengan pereaksi Dragedorf untuk mengetahui noda mana yang positif alkaloid, dan yang positif yaitu pada noda ke-4, dengan Rf 0,89, yang ditandai dengan terbentuknya warna merah bata.
Gambar 2. Hasil KLT preparative ekstrak
alkaloid dengan eluen etil
asetat:kloroform (6:4) pada
Gambar 3. KLT isolat alkaloid pita 4 menggunakan berbagai eluen, (A) etil asetat, (B) etanol, (C)
n-heksana, (D) etil
asetat:etanol (7:3), (E) etil asetat:etanol (8:2), (F) etil asetat:n-heksana (7:3), (G) etil asetat:n-heksana (8:2), pada lampu UV λ 365 nm
Pemisahan alkaloid dengan KLT preparatif menggunakan eluen etil asetat : kloroform (6:4) pada gambar 2, terlihat ada 4 pita dan yang positif alkaloid adalah pita ke-4 dengan Rf 0,9. Selanjutnya pita ke-4 dikerok dan dilarutkan dalam pelarut etil asetat untuk memisahkan isolat dengan
silika gel. Selanjutnya isolat alkaloid dilakukan uji kemurnian dengan KLT berbagai eluen tunggal, campuran, dan dua dimensi.
Pada gambar 3, terlihat hasil KLT hanya satu noda yang berwarna biru, diduga isolat alkaloid yang didapatkan sudah murni.
Hasil analisis isolat alkaloid
menggunakan spektrofotometer UV-Vis, pada gambar 4, didapatkan serapan pada panjang gelombang 220 nm dan 270 nm,
merupakan serapan dari ikatan
terkonjugasi aromatik dan merupakan
serapan alkaloid yang mempunyai
kerangka dasar indol, seperti yang terlihat pada gambar 5.
Gambar 5. Kerangka dasar senyawa alkaloid indol [8]
Gambar 6. Spektrum FTIR isolat alkaloid daun Mindi Serapan pada panjang gelombang
220 nm dan 270 nm mengindikasikan adanya senyawa aromatik dan ikatan terkonjugasi [4].
Hasil analisis FTIR, pada gambar 6,menunjukkan serapan pada panjang
gelombang 3452,94 cm-1 yang merupakan
serapan dari vibrasi ulur gugus N-H. Vibrasi ulur C-H alifatik muncul pada panjang
gelombang 2927,26 cm-1 dan 2860,37 cm-1.
Serapan pada panjang gelombang 1735,83
cm-1 menunjukkan adanya vibrasi ulur C=O.
Vibrasi ulur C=C aromatik muncul pada
panjang gelombang 1643,49 cm-1. Adanya
serapan 1552,66 cm-1 menunjukkan
adanya N-H tekuk.Vibrasi tekuk C-H
alifatikasimetri muncul pada panjang
gelombang 1460,28 cm-1. Vibrasi tekuk C-H
alifatik simetri muncul pada panjang
gelombang 1385,65 cm-1. Adanya serapan
pada panjang gelombang 1095,97 cm-1
menunjukkan adanya vibrasi ulur C-N. Serapan pada panjang gelombang 799,19
cm-1 menunjukkan adanya substitusi pada
cincin aromatik.
Isolat alkaloid dianalisis lebih lanjut
menggunakan Liquid Chromatography –
Mass Spectroscophy (LC–MS) untuk mengetahui kemurnian dan berat molekul senyawa alkaloid. Hasil kromatogram hasil LC-MS isolat alkaloid dapat dilihat pada gambar 7.
Berdasarkan kromatogram pada
gambar 7, menunjukkan bahwa isolat alkaloid belum murni, karena terdapat 3
puncak. Puncak pertama (T1) pada waktu
retensi 1,8 menit, puncak kedua (T2) pada
2,3 menit, dan puncak ketiga (T3) pada 3,0
menit.
Gambar 8. Spektrogram dari puncak pertama waktu retensi 1,8 menit
Spektrogram dari intensitas
tertinggi yaitu pada puncak pertama, dapat dilihat pada gambar 8, menunjukkan bahwa muncul puncak dengan protonasi ion
molekular [M+H+MeOH]+ m/z 324,91 dari
(m/z) [M+33], sehingga dapat disimpulkan bahwa berat molekul isolat yaitu 291,45 g/mol.
Berdasarkan analisis dengan
spektrofotometer UV-Vis, FT-IR, dan
LC-MS, diduga senyawa alkaloid T1adalah
alkaloid jenis indol (gambar 5), dengan berat molekul 291,45 g/mol.
Hasil uji aktivitas sitotoksik ekstrk alkaloid daun Mindi menggunakan metode
BSLT diperoleh harga LC50 sebesar 21,273
ppm. Harga tersebut menunjukkan bahwa ekstrak alkaloid bersifat sangat sitotoksik. Hasil uji sitotoksik ekstrak alkaloid daun Mindi dapat dilihat pada tabel 2 sebagai berikut:
KESIMPULAN
1. Senyawa alkaloid T1(waktu retensi 1,8
menit) yang terkandung dalam daun Mindi mempunyai kerangka dasar indol, yang mempunyai gugus fungsi N-H,
C-N, C=O, C=C, CH2, CH3, dengan berat
molekul 291,45 g/mol.
2. Uji aktivitas sitotoksik menggunakan metode BSLT diketahui bahwa ekstrak alkaloid bersifat sangat sitotoksik
dengan LC50 sebesar 21,273 ppm.
UCAPAN TERIMAKASIH
1. Dr. Dwi Hudiyanti, M.Sc selaku Ketua Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Matematika, Universitas Diponegoro 2. Seluruh dosen Laboratorium Kimia
Organik yang telah memberikan kritik dan saran dalam penyusunan naskah penelitian ini
3. Seluruh staff laboratorium jurusan kimia
Fakultas Sains dan Matematika
Universitas Diponegoro yang telah
DAFTAR RUJUKAN
[1] Article in Journal: Ahmed, M. F., et al.,2012, Phytochemical Studies and
Antioxidant Activity of Melia
azedarach Linn Leaves By DPPH
Scavenging Assay. Journal of
Pharmaceutical Applications, 3(1), 271-276.
[2] Article in Journal:Asadujjaman, e. a. (2013). Assessment of Bioactivities of
Ethanolic Extract of Melia azedarach
(Meliaceae) Leaves. Journal of
Coastal Life Medicine, 1, 118-122. [3] Article in Journal:Azam, M. M., et al.
(2013). Pharmacological Potentials of
Melia azedarach L. -A review.
American Journal of BioScience, 1, 44-49.
[4] Chapter in Book:Jameel, F dan
Hershenson, S., Formulation and
Process Development Strategies for Manufacturing Biopharmaceutical,
John Willey & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey,2010, 872-873
[5] Chapter in Book:Meyer, B. N., Ferrigni, N. R., Putman, J. E., Jacbsen, L. B., Nicols, D. E., and Mc Laughlin, J. L.,
Brine Shrimp : A Comvenient general
Bioassay For Active Plant
Constituents, West Lafayette : Plant medica,1982, 31-41
[6] Article in Journal:Mishra, G. e. a. (2013). Melia azedarach: A Review.
Medicinal Chemistry & Analysis, 3(2), 53-56.
[7] Article in Journal:Sharma, D. a. Y. P.
(2013). Preliminary and
Pharmacological Profile of Melia
azedarach L.: An Overview. Journal of
Applied Pharmaceutical Science,
3(12), 133-138.
[8] Chapter in Book:Trease dan Evan,
W.C., Pharmacognosy, Sixteenth
Edition, Sauders Elsevier, Inggris, 2009, 353-355
