http://jurnal.fkip.uns.ac.id/index.php/jkpk ISSN 2503-4154 (online)
33
ISOLASI, IDENTIFIKASI, DAN UJI SITOTOKSIK SENYAWA
ALKALOID DARI DAUN MINDI (Melia azedarach L.)
Fitriyani
*, Dewi Kusrini, dan Enny Fachriyah
Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas Diponegoro, Semarang, Indonesia
*Keperluan korespondensi, telp: 085643559247, email: [email protected]
Received: July 22, 2016 Accepted: August 15, 2016 Online Published: August 31, 2016
ABSTRAK
Mindi (Melia azedarach L.) dari suku Meliaceae merupakan salah satu jenis tanaman yang memiliki beberapa golongan senyawa salah satunya alkaloid. Daun Mindi (Melia azedarach L.) telah diekstrak dengan pelarut etanol 96% secara maserasi untuk penapisan fitokimianya. Alkaloid dapat diisolasi dari ektrak metanol-air daun Mindi dengan cara penggaraman yang kemudian diekstraksi dengan eluen etil asetat. Pemisahan alkaloid dengan KLT preparatif menggunakan eluen etil asetat:kloroform (6:4) dan uji kemurniannya dengan metode KLT berbagai eluen tunggal, campuran, dan dua dimensi. Analisis struktur terhadap isolat alkaloid menggunakan spektro meter UV-Vis, FT-IR, dan LC-MS serta uji sitotoksik ekstrak alkaloid dengan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test). Identifikasi isolat alkaloid menggunakan spektrometri UV-Vis menunjukkan alkaloid golongan indol, dengan panjang gelombang 220 nm dan 270 nm. Analisis menggunakan spektrometri FTIR menunjukan isolat alkaloid memiliki gugus fungsi N-H, O-H, CH3, CH2, C=C aromatik, C-N, dan C=O, dan analisis dengan LC-MS isolat alkaloid memiliki berat molekul 290,45 g/mol. Hasil uji sitotoksik ekstrak alkaloid menunjukkan LC50 sebesar 21,273 ppm, sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak alkaloid bersifat sangat sitotoksik.
Kata kunci: Mindi (Melia azedarach L.), alkaloid indol, BSLT
ABSTRACT
Mindi (Melia azedarach L.) from Meliaceae tribe is one kind of plant that has several classes of compounds, one is alkaloid. The Mindi leaf has been extracted using a solvent of 96% ethanol by maseration method for elucidation of its fitochemistry. Alkaloid can be isolated from methanol-water extract of mindi leaf by salting extracted with ethyl acetate eluent. Separation of alkaloids was performed by preparative TLC using the eluent ethyl acetate: chloroform (6:4) and test its purity by TLC method using eluent single variety, mix, and two-dimensional. Structure analysis of the alkaloid isolates were carried out using UV-Vis spectrophotometer, FT-IR, and LC-MS as well as test cytotoxic alkaloid extrac usingt BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) method. Identification of the alkaloid isolates using UV-Vis spectrometry showed that indole-group alkaloid has wavelengths of 220 nm and 270 nm. Analysis using FTIR spectrometry showed that alkaloids isolate has a functional group N-H, O-H, CH3, CH2, C = C aromatic, C-N and C = O. The isolat has a molecular weight of 290.45 g / mol by analysis using LC-MS. The cytotoxic test showed that LC50 of alkaloid extract of 21.273 ppm, so that it can be concluded that the alkaloid extract is highly cytotoxic.
Keywords: Mindi (Melia azedarach L.), indole alkaloids, BSLT .
PENDAHULUAN
Tanaman mindi (Melia azedarach L.)
adalah salah satu tanaman berfamili
Meliaceae, yang merupakan tanaman asli
dari Mexico dan Argentina. Tanaman ini
dapat tumbuh di Indonesia yang beriklim
tropis [7]. Dalam kehidupan sehari-hari,
tanaman mindi digunakan secara
tradisional untuk obat malaria, diabetes,
batuk, penyakit kulit, dan lain-lain [3].
Penelitian lain menyatakan bahwa ekstrak
daun mindi memiliki aktivitas sebagai
antibakteri, antioksidan, analgesik [2],
antidiabetes, antihipertensi, antireumatik
[7], insektisida, rodentisida, dan fungisida
[6].
Pada daun mindi terdapat kandungan
metabolit sekunder antara lain alkaloid,
tannin, saponin, fenolik, glikosida, steroid,
terpenoid dan flavonoid [1]. Berdasarkan
kemotaksonomi tanaman Dysoxylum
binectanferum (Meliceae) yang telah
teridentifikasi mengandung senyawa
alkaloid yaitu chromene alkaloid dan
rohitukine.
Penelitian yang dilakukan
menyebutkan bahwa tanaman mindi
memiliki aktivitas sebagai antikanker,
dengan IC50 range of 8.18- 60.10 ppm.
Daun dari tanaman mindi belum banyak
diteliti, oleh karena itu pada penelitian ini
akan dilakukan isolasi, identifikasi, dan uji
sitotoksik senyawa alkaloid dari daun mindi.
Berdasarkan informasi di atas,
penelitian mengenai isolasi alkaloid,
penentuan struktur, dan uji aktivitasnya
belum banyak dilakukan. Penelitian ini akan
dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa
golongan alkaloid, serta aktivitas sitotoksik
ekstrak alkaloid pada daun Mindi. Hasil
penelitian ini nantinya diharapkan dapat
memberikan informasi mengenai jenis
senyawa alkaloid yang terkandung dalam
daun Mindi (Melia azedarach L.) dan uji
sitotoksiknya.
METODE PENELITIAN
Alat dan bahan.
Alat yang digunakan dalam penelitian ini
terdiri dari rotary evaporator, blender,
neraca analitik, kertas saring,erlenmeyer,
pipet tetes,gelas beker, corong gelas,
corong pisah, botol vial, pipa kapiler,
tabung reaksi, pengaduk kaca, penangas
air, cawan penguap, wadah pengembang,
lampu UV, spektrofotometer UV–Vis, FT-IR
(Perkin Elmer Spectrum Version 10.4.00,
dan LC-MS.
Bahan yang diperlukan dalam penelitian ini
yaitu daun Mindi (Melia azedarach L.) dari
daerah Purworejo, Jawa Tengah, aquades,
etanol 96% teknis, n-heksana teknis,
kloroform teknis, etil asetat teknis, plat KLT
silika gel GF254 (Merck), plat KLT Preparatif
silika gel GF254 (Merck), n-heksana p.a.
(Merck), etil asetat p.a. (Merck), asam
asetat p.a. (Merck), kloroform p.a. (Merck),
metanol p.a. (Merck), asam klorida (Merck),
natrium hidroksida (Merck), pereaksi
dragendorf, pereaksi Mayer.
Ekstraksi senyawa alkaloid: Serbuk daun
Mindi sebanyak 1000 g dimaserasi dengan
pelarut etanol 96% selama 8 x 24 jam.
Ekstrak etanol diuapkan pada kondisi
vakum sampai ekstrak kental, selanjutnya
dilarutkan dalam metanol dan ditambahkan
aquades dengan rasio 1:1, didiamkan
klorofil dengan filtrat. Simplisa dan ekstrak
yang didapatkan dilakukan analisis
penapisan fitokimia yang meliputi alkaloid,
flavonoid, tanin, kuinon, saponin, dan
steroid/ triterpenoid.
Isolasi Alkaloid: Fraksi yang berupa
metanol–air dilakukan partisi menggunakan
n-heksan dan kloroform. Fraksi metanol-air
yang didapatkan dilakukan penggaraman
menggunakan HCl 2 M hingga pH 3 lalu
diekstraksi dengan pelarut etil asetat
sehingga didapatkan lapisan asam. Pada
lapisan asam dilakukan penambahan
NH4OH hingga pH 9 kemudian dilakukan
ekstraksi kembali dengan pelarut etil asetat.
Setelah itu diuapkan hingga didapatkan
ekstrak alkaloid, dan dilakukan pemisahan
menggunakan KLT sebagai fase diam
berupa silika gel GF254 dan eluen berupa
etil asetat : kloroform (6:4). Noda yang
terbentuk dilakukan uji alkaloid dengan
pereaksi Dragendorf. Noda positif alkaloid
dilakukan pemisahan menggunakan KLT
preparatif dengan fase diam silika gel
GF254, ketebalan 2 mm dan eluen berupa
etil asetat : kloroform (6:4).
Uji Kemurnian: Uji kemurnian isolat
alkaloid dilakukan dengan KLT berbagai
pelarut tunggal (etil asetat, etanol,
n-heksana), campuran (etil asetat:etanol
(7:3), etil asetat:etanol (8:2), etil
asetat:n-heksana (7:3), etil asetat:n-asetat:n-heksana (8:2)),
juga KLT dua dimensi (etil asetat: etanol
(9:1) dan etil asetat: n-heksana (9:1))
hingga diperoleh satu noda.
Karakterisasi Isolat Alkaloid: Untuk
mengetahui struktur isolat alkaloid yang
didapatkan, dilakukan analisis
menggunakan spektrofotometer UV-Vis,
FT-IR, dan LC-MS.
Uji Aktivitas: Telur Artemia salina
dimasukkan di dalam air garam selama 2 x
24 jam. Suhu penetasan adalah ± 25-300C
dan pH ± 6-7. Telur akan menetas setelah
18–24 jam dan larvanya siap untuk uji
BSLT. Sampel dari ekstrak alkaloid diambil
62,5 mg, dilakukan pengenceran dengan
konsentrasi 1000, 100, dan 10 ppm.
Pengujian dilakukan dengan memasukkan
10 ekor larva Artemiasalina berumur 48 jam
ke dalam botol vial yang telah berisi larutan
ekstrak alkaloid. Setelah 24 jam, jumlah
larva yang mati dihitung dan dilakukan
analisis probit untuk menentukan aktivitas
LC50 ([5].
PEMBAHASAN
Penapisan fitokimia berfungsi untuk
mengetahui keberadaan golongan senyawa
metabolit sekunder yang terkandung di
dalam simplisia serbuk maupun di dalam
ekstrak etanol. Penapisan fitokimia yang
dilakukan secara kualitatif dengan
mengidentifikasi keberadaan suatu
senyawa tanpa menentukan kadarnya.
Prinsip penapisan fitokimia ialah analisis
golongan kimia tumbuhan dengan uji
spesifik dengan reagen yang memberikan
uji spesifik terhadap golongan kimia
tertentu. Golongan yang diidentifikasi pada
penelitian ini antara lain alkaloid, flavonoid,
tanin, saponin, kuinon, steroid dan
triterpenoid. Hasil penapisan fitokimia dapat
dilihat pada Tabel 1.
Pada tabel 1 menunjukkan bahwa
penapisan fitokimia pada serbuk dan
ekstrak etanol daun Mindi mengandung
senyawa golongan alkaloid, flavonoid,
penapisan fitokimia yang diperoleh berbeda
dengan penelitian yang dilakukan [1] yang
melaporkan dalam ekstrak etanol daun
mindi mengandung senyawa metabolit
sekunder alkaloid, tannin, saponin, fenolik,
glikosida, steroid, terpenoid dan flavonoid.
Tabel 1. Hasil uji fitokimia daun Mindi
Uji Fitokimia Serbuk Ekstrak
Alkaloid + +
Proses isolasi alkaloid dari ekstrak
metanol-air dilakukan dengan reaksi
penggaraman menggunakan HCl 2M untuk
membentuk garam alkaloid, karena alkaloid
bersifat basa sehingga apabila
ditambahkan dengan asam akan
membentuk garam. Garam alkaloid ini
kemudian diekstraksi dengan pelarut etil
asetat, untuk memisahkan senyawa
alkaloid dengan senyawa yang bukan
alkaloid, karena alkaloid terikat pada
lapisan asam ini. Untuk membebaskan
alkaloid dari bentuk garamnya, maka
ditambahkan NH4OH sampai suasana
menjadi basa, sehingga alkaloid akan
terbentuk menjadi basa alkaloid kembali.
Lapisan ini kemudian diekstraksi kembali
dengan pelarut etil asetat, selanjutnya
diuapkan hingga terbentuk ekstrak alkaloid.
Untuk mengetahui ekstrak alkaloid yang
didapatkan mengandung alkaloid atau tidak
maka ditambahkan pereaksi Dragendorff,
terbentuknya endapan merah bata berarti
positif adanya alkaloid.
Ekstrak alkaloid selanjutnya
dianalisis menggunakan KLT untuk
mengetahui jumlah senyawa yang ada di
dalam ekstrak (Gambar 1).
Gambar 1. Hasil KLTekstrak alkaloid
dengan eluen etil asetat: kloroform (6:4) pada panjang gelombang 254 nm (kiri) dan setelah disemprot pereaksi Dragendorf (kanan)
Pada gambar 1 terlihat jumlah
senyawa (noda) ada 4 dengan harga Rf
masing-masing 0,22; 0,36; 0,64; dan 0;89.
Selanjutnya disemprot dengan pereaksi
Dragedorf untuk mengetahui noda mana
yang positif alkaloid, dan yang positif yaitu
pada noda ke-4, dengan Rf 0,89, yang
ditandai dengan terbentuknya warna merah
bata.
Gambar 2. Hasil KLT preparative ekstrak
Gambar 3. KLT isolat alkaloid pita 4 menggunakan berbagai eluen, (A) etil asetat, (B) etanol, (C) n-heksana, (D) etil asetat:etanol (7:3), (E) etil asetat:etanol (8:2), (F) etil asetat:n-heksana (7:3), (G) etil asetat:n-heksana (8:2), pada
lampu UV λ 365 nm
Pemisahan alkaloid dengan KLT
preparatif menggunakan eluen etil asetat :
kloroform (6:4) pada gambar 2, terlihat
ada 4 pita dan yang positif alkaloid adalah
pita ke-4 dengan Rf 0,9. Selanjutnya pita
ke-4 dikerok dan dilarutkan dalam pelarut
etil asetat untuk memisahkan isolat dengan
silika gel. Selanjutnya isolat alkaloid
dilakukan uji kemurnian dengan KLT
berbagai eluen tunggal, campuran, dan
dua dimensi.
Pada gambar 3, terlihat hasil KLT hanya
satu noda yang berwarna biru, diduga
isolat alkaloid yang didapatkan sudah
murni.
Hasil analisis isolat alkaloid
menggunakan spektrofotometer UV-Vis,
pada gambar 4, didapatkan serapan pada
panjang gelombang 220 nm dan 270 nm,
merupakan serapan dari ikatan
terkonjugasi aromatik dan merupakan
serapan alkaloid yang mempunyai
kerangka dasar indol, seperti yang terlihat
pada gambar 5.
Gambar 5. Kerangka dasar senyawa
alkaloid indol [8]
Gambar 6. Spektrum FTIR isolat alkaloid daun Mindi
Serapan pada panjang gelombang
220 nm dan 270 nm mengindikasikan
adanya senyawa aromatik dan ikatan
terkonjugasi [4].
Hasil analisis FTIR, pada gambar
6,menunjukkan serapan pada panjang
gelombang 3452,94 cm-1 yang merupakan
serapan dari vibrasi ulur gugus N-H. Vibrasi
ulur C-H alifatik muncul pada panjang
gelombang 2927,26 cm-1 dan 2860,37 cm-1.
Serapan pada panjang gelombang 1735,83
cm-1 menunjukkan adanya vibrasi ulur C=O.
Vibrasi ulur C=C aromatik muncul pada
panjang gelombang 1643,49 cm-1. Adanya
serapan 1552,66 cm-1 menunjukkan
adanya N-H tekuk.Vibrasi tekuk C-H
alifatikasimetri muncul pada panjang
gelombang 1460,28 cm-1. Vibrasi tekuk C-H
alifatik simetri muncul pada panjang
gelombang 1385,65 cm-1. Adanya serapan
pada panjang gelombang 1095,97 cm-1
menunjukkan adanya vibrasi ulur C-N.
Serapan pada panjang gelombang 799,19
cm-1 menunjukkan adanya substitusi pada
cincin aromatik.
Isolat alkaloid dianalisis lebih lanjut
menggunakan Liquid Chromatography –
Mass Spectroscophy (LC–MS) untuk
mengetahui kemurnian dan berat molekul
senyawa alkaloid. Hasil kromatogram hasil
LC-MS isolat alkaloid dapat dilihat pada
gambar 7.
Berdasarkan kromatogram pada
gambar 7, menunjukkan bahwa isolat
alkaloid belum murni, karena terdapat 3
puncak. Puncak pertama (T1) pada waktu
retensi 1,8 menit, puncak kedua (T2) pada
2,3 menit, dan puncak ketiga (T3) pada 3,0
menit.
Gambar 8. Spektrogram dari puncak pertama waktu retensi 1,8 menit
Spektrogram dari intensitas
tertinggi yaitu pada puncak pertama, dapat
dilihat pada gambar 8, menunjukkan bahwa
muncul puncak dengan protonasi ion
molekular [M+H+MeOH]+ m/z 324,91 dari
(m/z) [M+33], sehingga dapat disimpulkan
bahwa berat molekul isolat yaitu 291,45
g/mol.
Berdasarkan analisis dengan
spektrofotometer UV-Vis, FT-IR, dan
LC-MS, diduga senyawa alkaloid T1adalah
alkaloid jenis indol (gambar 5), dengan
berat molekul 291,45 g/mol.
Hasil uji aktivitas sitotoksik ekstrk
alkaloid daun Mindi menggunakan metode
BSLT diperoleh harga LC50 sebesar 21,273
ppm. Harga tersebut menunjukkan bahwa
ekstrak alkaloid bersifat sangat sitotoksik.
Hasil uji sitotoksik ekstrak alkaloid daun
Mindi dapat dilihat pada tabel 2 sebagai
berikut:
KESIMPULAN
1. Senyawa alkaloid T1(waktu retensi 1,8
menit) yang terkandung dalam daun
Mindi mempunyai kerangka dasar indol,
yang mempunyai gugus fungsi N-H,
C-N, C=O, C=C, CH2, CH3, dengan berat
molekul 291,45 g/mol.
2. Uji aktivitas sitotoksik menggunakan
metode BSLT diketahui bahwa ekstrak
alkaloid bersifat sangat sitotoksik
dengan LC50 sebesar 21,273 ppm.
UCAPAN TERIMAKASIH
1. Dr. Dwi Hudiyanti, M.Sc selaku Ketua
Jurusan Kimia Fakultas Sains dan
Matematika, Universitas Diponegoro
2. Seluruh dosen Laboratorium Kimia
Organik yang telah memberikan kritik
dan saran dalam penyusunan naskah
penelitian ini
3. Seluruh staff laboratorium jurusan kimia
Fakultas Sains dan Matematika
Universitas Diponegoro yang telah
DAFTAR RUJUKAN
[1] Article in Journal: Ahmed, M. F., et
al.,2012, Phytochemical Studies and
Antioxidant Activity of Melia
azedarach Linn Leaves By DPPH
Scavenging Assay. Journal of
Pharmaceutical Applications, 3(1),
271-276.
[2] Article in Journal:Asadujjaman, e. a.
(2013). Assessment of Bioactivities of
Ethanolic Extract of Melia azedarach
(Meliaceae) Leaves. Journal of
Coastal Life Medicine, 1, 118-122.
[3] Article in Journal:Azam, M. M., et al.
(2013). Pharmacological Potentials of
Melia azedarach L. -A review.
American Journal of BioScience, 1,
44-49.
[4] Chapter in Book:Jameel, F dan
Hershenson, S., Formulation and
Process Development Strategies for
Manufacturing Biopharmaceutical,
John Willey & Sons, Inc., Hoboken,
New Jersey,2010, 872-873
[5] Chapter in Book:Meyer, B. N., Ferrigni,
N. R., Putman, J. E., Jacbsen, L. B.,
Nicols, D. E., and Mc Laughlin, J. L.,
Brine Shrimp : A Comvenient general
Bioassay For Active Plant
Constituents, West Lafayette : Plant
medica,1982, 31-41
[6] Article in Journal:Mishra, G. e. a.
(2013). Melia azedarach: A Review.
Medicinal Chemistry & Analysis, 3(2),
53-56.
[7] Article in Journal:Sharma, D. a. Y. P.
(2013). Preliminary and
Pharmacological Profile of Melia
azedarach L.: An Overview. Journal of
Applied Pharmaceutical Science,
3(12), 133-138.
[8] Chapter in Book:Trease dan Evan,
W.C., Pharmacognosy, Sixteenth
Edition, Sauders Elsevier, Inggris,
2009, 353-355
