Dalam Penuntun Praktikum ini diberikan teori pengantar dan metode pengujian cemaran mikroba yang yang mengacu pada prosedur Standar Kompetensi Kerja Nasional Indonesia (SKKNI) di laboratorium Mikrobiologi Politeknik ATI Padang. Walaupun demikian mungkin dapat pula digunakan bagi yang memerlukannya, baik pelajar maupun karyawan yang bekerja di laboratorium Mikrobiologi. Teknik aseptik adalah serangkaian praktik yang digunakan di laboratorium mikrobiologi untuk mencegah kontaminasi dari mikroorganisme yang tidak diinginkan ke dalam sampel atau kultur mikroba yang sedang diteliti.
Gunakan Api Bunsen: Menggunakan api Bunsen (nyala api) di laboratorium mikrobiologi membantu menghindari kontaminasi dengan memastikan bahwa uap panas membunuh mikroorganisme yang mungkin terdapat di udara dan di sekitar area kerja. Memahami Prosedur Aseptik: Setiap orang yang bekerja di laboratorium mikrobiologi harus memahami dan mengikuti prosedur aseptik dengan cermat untuk mencegah risiko kontaminasi.
INOKULASI DAN SUB KULTUR MIKROBA
Tujuan
Teori Dasar
Sanitasi ruangan dan peralatan/ Isolasi Mikroba Udara
Bahan dan Alat
Prosedur Kerja dan Pengamatan
Isolasi Mikroba Sanitasi pada Peralatan
Bahan dan Alat
Prosedur Kerja dan Pengamatan
Sample makanan atau air, kapas, cotun bath, kapas steril, neraca, wadah steril, media NA, PDA steril, kertas label atau spidol permanent, cawan petri steril, larutan pengencer atau aqquadest dalam labu erlenmeyer sebanyak 180 ml dan masing-masing 9 ml di dalam tabung reaksi yang telah steril, pipet takar steril, rak tabung, , pembakar spiritus, panci masak, alat pemanas dan vortex, autoklaf. Masukkan masing-masing 1 ml sampel suspensi dari tabung reaksi ke dalam cawan yang bertanda sama. Tuangkan sebanyak 12 – 15 ml ke dalam masing-masing cawan Petri yang telah berisi suspensi sampel, putar sekitar 10 X sampai sampel tercampur merata dengan media agar.
Penyediaan Biakan Murni 3.7. Bahan dan Alat
- Prosedur Kerja dengan metode Penggoresan
- Prosedur Kerja dengan metoda Penuangan
- Pertanyaan
- PENGAMATAN MIKROBA
Inkubasi cawan Petri tersebut pada suhu kamar (bila diinginkan bakteri patogen, eramkan pada inkubator dengan suhu 35 – 37 oC) selama 1-2 untuk bakteri 4-5 untuk jamur. Hitung jumlah koloni bakteri dan koloni jamur dan tentukan berapa banyaknya bakteri atau jamur per gram sampel dengan rumus : jumlah koloni X Faktor pengenceran (kebalikan konsentrasi). Inkubasi pada suhu kamar seperti yang disebutkan sebelumnya, setelah mikroba tumbuh ambil dengan jarum ose dan inokulasikan kedalam media miring yang sudah disediakan.
Periksa apakah mikroba yang tumbuh di dalam media miring hanya satu macam atau masih bercampur. Bila lebih dari satu macam, pekerjaan diulangi sampai didapatkan biakan yang terdiri dari satu macam saja. 1.Panaskan jarum ose sampai merah, dinginkan dan ambil sedikit koloni bakteri atau jamur dan masukkan ke dalam media PDA dan NA cair yang tersedia, kocok- kocok supaya mikrobanya tersuspensi dan putar beberapa kali supaya suspensi tercampur merata.
2.Secara aseptik celupkan jarum ose kedalam media agar yang telah berisi suspensi mikroba dan pindahkan kedalam media agar steril kedua, kocok dan putar dan selanjutnya lakukan untuk tabung agar berikutnya. 3.Tuangkan semua media berisi suspensi masing-masing kedalam cawan Petri kosong yang steril, goyang ± 10X supaya tersebar merata. Setelah mikroba tumbuh, ambil sedikit koloni yang terpisah dan pindahkan ke atas permukaan agar miring, inkubasikan kembali sampai mikrobanya tumbuh.
Bila telah didapatkan hanya satu macam berarti biakan murni sudah tersedia, dan siap untuk diidentifikasi.
PEMBUATAN PREPARAT SEGAR
- Tujuan
- Teori Dasar
- Bahan dan Alat ;
- Prosedur Kerja dan Pengamatan
- Pertanyaan
- Prosedur Kerja Dan Pengamatan
- Pertanyaan
- Bahan dan Alat
- Tujuan
- OBJEK PENGUJIAN MIKROBA
Ambil sedikit jamur dari biakan murni secara aseptik yaitu tarik sumbat biakan dengan jari kelingking, kait sedikit koloni jamur, lalukan mulut tabung di atas pembakar spiritus dan sumbat kembali. Jamur yang ada di jarum kait tersebut celupkan ke dalam air suling di atas kaca alas tersebut setipis dan sejarang mungkin. Simpanlah biakan murni tersebut pada tempat yang bersih (seperti lemari steril atau di dalam lemari pendingin untuk pengkajian berikutnya).
Pembesaran oleh mikroskop merupakan hasil dari dua sistem lensa yaitu lensa obyektif yang terletak di dekat spesimen dan lensa okuler (eyepiece lens) yang terletak di atas dekat mata yang melihatnya. Untuk melihat bakteri atau mikroba yang lebih kecil daripada jamur pakailah lensa objektif 100 X , sebelumnya tetesi preparat dengan minyak imersi, lihatlah dengan lensa okuler dan putarlah tombol pemfokus halus secara perlahan sampai sel-sel mikroba terlihat jelas. Pewarnaan dibedakan atas pewarnaan negative yaitu pewarnaan yang mikrobanya tidak menyerap zat warna; pewarnaan positif, sel-sel bakteri menyerap zat warna dan dapat dibedakan pula atas pewarnaan sederhana, pewarnaan gram, pewarnaan spora, pewarnaan flageldan sebagainya.
Fiksasi di atas nyala spiritus dan tetesi dengan larutan hijau malasit, biarkan selama 20 menit tanpa pemanasan, bila zat warna kering, tambah lagi. Khamir adalah sekelompok jamur yang terdiri dari sel-sel tunggal atau hifa sederhana maupun miselium sempurna yang berkembang biak dengan tunas, membelah atau dengan spora, mampu memfermentasikan gula menjadi alcohol. Salah satu cara menentukan kualitas ragi roti adalah penentuan persentase sel-sel yang sudah mati, dengan memberikan larutan metilen biru 0,1%.
Sel-sel yang telah mati tidak mampu mereduksi metilen biru sehingga tetap berwarna biru sedangkan sel-sel yang masih hidup mampu mengubah warna dari metilen yang berwarna biru menjadi metilen yang berwarna putih, jadi sel-selnya tetap berwarna bening. Bila dengan pembesaran 40 X 10 sel-sel khamir tersebut dihitung pada bidang pandang, encerkan lagi suspensi khamir itu dan ulangi membuat preparat basah deangan metilen biru sebagai media celup, demikian seterusnya sampai dapat dihitung. Periksa dan amati bentuk sel-sel khamir dari kedua macam sampel bahan yang tersedia dan buat gambarnya.
Pengujian Mikroba Phatogen ( Salmonella sp) 1. Tujuan
Bakteri ini tidak dapat berkompetisi decara baik dengan mikroorganisme lain pada bahan pangan, misalnya bakteri – bakteri pembusuk. Pada prinsipnya pengujian ini dilakukan menggunakan metode kualitatif pada media selektif dengan tahapan pra pengayaan (pre-enrichment) dan pengayaan (enrichment), yang dilanjutkan dengan uji biokimia dan uji serologi (analisa antigenik atau immunologi). Tahapan ini menggunakan media cair yaitu LB atau BPW dimana media ini mengandung cukup nutrisi dan merupakan media nonselektif.
Tahapan ini menggunakan media cair yaitu yaitu Tetra Thionate Broth (TTB) dan Rappapport Vassiliadis(RV), yang bertujuan untuk memberi kesempatan agar bakteri dapat tumbuh baik. Salmonella pada media HEA terlihat sebagai koloni spesifik dengan warna hijau kebiruan (hasil reaksi asam yang dihasilkan bakteri Salmonella dengan pH indikator, yaitu Bromtimol biru dan Acid Fuchsin) dengan atau tanpa titik hitam (yang menunjukkan produksi hidrogen sulfida, H2S). Pada media XLDA akan terlihat sebagai koloni merah muda atau translucent dengan atau tanpa titik mengkilat atau terlihat hampir seluruh koloni hitam.
Salmonella akan memfermentasi xylosesehingga pH media akan turun yang terlihat dari reaksi dengan pH indikator, yaitu phenol red. Pada media BSA terlihat sebagai koloni dengan warna keabu abuan atau kehitaman, kadang metalik, dengan media disekitar koloni berwarna coklat. Identifikasi Salmonella dilakukan dengan menumbuhkan pada media Triple Sugar Iron Agar(TSIA) miring dan Lysine Iron Agar (LIA) miring.
Pada bagian dasar TSIA, Salmonella akan memfermentasikan glukosa sehingga sehingga pH media akan turun yang terlihat dari reaksi dengan pH indikator, yaitu phenol red.
Pengujian BAKTERI GOLONGAN COLI (Coliform Group) 1. Tujuan
Teori Dasar
Kehadiran bakteriColiform dinilai untuk menentukan keamanan mikrobiologi dari pasokan air dan makanan mentah atau makanan yang diolah. Ciri-ciri bakteri Coliform antara lain termasuk bakteri gram negatif, berbentuk batang, tidak membentuk spora, bersifat areob atau anaerob fakultatif, bakteri Coliform memproduksi gas dari glukosa (gula lainnya) dan memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 350C, bakteri Coliform yang berada di dalam makanan atau minuman menunjukkan kemungkinan adanya mikroba yang bersifat enteropatogenik atau toksigenik yang berbahaya bagi kesehatan. Oleh karena itu, kemasan yang digunakan sebagai wadah makanan atau penyimpanan makanan harus bebas dari semua jenis Coliform.
Semakin tinggi tingkat kontaminasi bakteri Coliform, semakin tinggi pula resiko kehadiran bakteri-bakteri patogen lain yang biasa hidup dalam kotoran manusia dan hewan yaitu dapat menyebabkan gejala diare, kram perut, mual, rasa tidak enak badan dan kanker. Pergerakan bakteri ini motil, tidak motil, dan peritrikus, ada yang bersifat aerobik dan anaerobik fakultatif (Elfidasari et al. 2011). Selain itu, mempunyai kapsul atau lapisan lendir yang merupakan polisakarida tebal dan air yang melapisi permukaan luar sel.
Berbagai makanan dan minuman yang dikonsumsi manusia dalam kehidupan sehari-hari tidak lepas dari keberadaan bakteri di dalamnya. Namun, jika makanan dan minuman tersebut diolah secara higienis, mungkin bakteri didalmnya masih memiliki batas toleransi untuk dikonsumsi, terutama bakteri patogen penyebab penyakit. Menurut Standar Nasional Indonesia (SNI) keberadaan E.coli pada bahan pangan makanan dan minuman berjumlah 0 (nol) koloni dalam 100 ml air.
Sampel makanan atau minuman atau sumber air yang akan diperiksa, media LB (Lactosa Broth), atau Mac Concey Broth, BGLB (Brilliant Green Lactosa Bile Broth) Endo Agar atau EMB Agar (Eosin Methylen Blue), tabung reaksi besar, tabung durham. kepala ampul) pipet takar 10 mL dan 1 mL, cawan petri steril, autoklaf, incubator, pembakar spiritus, rak tabung, jarum ose, zat-zat warna untuk pewarnaan gram dan spora dan lain-lain.
Prosedur Kerja dan Pengamatan 5. Penyediaan Sampel
Setelah steril, dinginkan, beri tanda masing-masing tabung BGLB sesuai dengan jumlah tabung LB positif. Secara aseptik, inokulasikanlah dengan jarum ose biakan yang ada di dalam tabung LB positif LB positif sebanyak 3 kali. Panaskan Endo Agar sampai mencair seluruhnya, dinginkan sampai suhu 45 – 50 oC, secara aseptik tuangkan ke dalam cawan-cawan petri steril sebanyak 12-15 mL, biarkan membeku.
Jika cawan petri dan media Endo Agar terbatas, dapat dilakukan dengan membuat sektor-sektor di bawah cawan petri dengan spidol permanen. Secara aseptic inokulasikan pula sampel yang positif pada tabung LB (uji sangkaan) tadi dengan menggunakan jarum ose ke atas permukaan Endo Agar secara penggoresan. Setelah masa inkubasi selesai, periksalah tabung-tabung yang positif pada BGLB (tabung durham berisi gas).
Periksa juga biakan di dalam Endo Agar, apakah terdapat koloni berwarna merah muda dengan atau tanpa dasar hitam dan kilap logam. Apakah boleh dilanjutkan ke uji penegasan bila dalam 24 jam saja semua tabung sudah dinyatakan positif ada bakteri coli pada uji sangkaan. Jika cirri bakteri coli yang tumbuh pada Endo Agar hanya warna merah muda saja, termasuk tipe apa bakteri tersebut.
Bila hasil pemeriksaan bakteri coli didapatkan jumlah yang tinggi, apakah sumber air atau minuman tersebut bias dinyatakan tercemar berat.
PEMELIHARAAN BAHAN ACUAN
Distribusi yang Terkelola: Jika kultur mikroba akan didistribusikan kepada pihak lain, prosesnya harus terkelola dengan baik. Hal ini mencakup pengiriman dalam kondisi yang tepat, dokumentasi yang akurat, serta persyaratan hukum dan peraturan yang relevan. Penting untuk dicatat bahwa pemeliharaan bahan acuan mikroba merupakan tanggung jawab yang serius dalam menjaga keberlanjutan dan keaslian kultur mikroba.
Dengan proses pemeliharaan yang tepat, para peneliti dapat terus melakukan studi dan penelitian yang valid serta bermanfaat dalam berbagai bidang ilmu pengetahuan.
Dasar Perundang-undangan
Objek Praktikum : Sterilisasi, Media dan Inokulasi dan Sub Kultur Mikroba serta Uji Sanitasi Ruangan dan Peralatan. Pemurnian Bakteri dan Jamur Sanitasi ruangan dan peralatan - Pengamatan Bakteri dan Jamur Sanitasi ruangan dan peralatan.
