Isolasi bakteri merupakan teknik untuk pemisahan bakteri. Pemisahan bakteri diperlukan untuk mengetahui jenis, mempelajari kultural, morfologi, fisiologi, dan karakteristik. Isolasi bakteri yakni suatu proses memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba dari medium/lingkungan asalnya lalu menumbuhkannya di medium buatan/kultur sehingga diperoleh biakan yang murni (Singleton & Sainsbury, 2006). Media kultur untuk isolasi bakteri dinamakan nutrient broth blood agar.
Proses isolasi bakteri dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni sel yang tetap pada tempatnya. Beberapa cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakan campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah metode cawan gores dan metode cawan tuang. Yang didasarkan pada prinsip pengenceran dengan maksud untuk memperoleh spesies individu.
Dengan anggapan bahwa setiap koloni dapat terpisah dari satu jenis sel yang dapat diamati (Afrianto, 2004).
Medium agar merupakan substrat yang sangat baik untuk memisahkan campuran mikroorganisme. Teknik yang digunakan memungkinkan bakteri tumbuh pada jarak yang berjauhan dari sesamanya dan membentuk koloni. Semua sel dalam koloni dianggap sebagai turunan atau progeni suatu mikroorganisme yang disebut dengan biakan murni.
Bahan yang diinokulasikan pada medium disebut inokulum. Dengan menginokulasikan medium agar nutrien dengan metode yang benar, maka sel-sel bakteri akan terpisah sendiri-sendiri. Setelah diinkubasi, bakteri akan memperbanyak diri dengan cepat selama 18-24 jam, sehingga terbentuk massa sel (koloni) yang dapat terlihat dengan mata telanjang (Pelczar dan Chan, 1986).
Untuk memastikan mikrobia yang diisolasi telah berupa biakan murni dan sesuai dengan yang dimakudkan maka diperlukan pengujian. Uji yang bisa digunakan adalah dengan cara pengecatan gram. Apabila bakteri tidak berubah maka bakteri yang diisolasi sudah merupakan biakan murni dan bila di dalam uji pengecatan gram berubah bakteri gramnya maka isolasi tidak berhail karena belum berubah menjadi biakan murni. Hal ini mungkin disebabkan karena adanya kontaminan di dalam isolasi bakteri ( Volk dan Wheeler, 1993).
Pada saat isolasi, mikroba perlu dilakukan inokulasi mikroba. Sebelum dan sesudah menginokulasikan mikroba jarum ose yang digunakan harus dipanaskan terlebih dahulu. Hal ini bertujuan agar jarum ose yang digunakan bersifat steril dan bebas kontaminasi dari mikroorganisme yang tidak diinginkan. Sedangkan pada cawan petri, setelah sampel dimasukan ke dalam cawan petri setiap membuka dan menutup cawan petri harus terlebih dahulu dipanaskan untuk meminimalkan terkontaminasinya sampel. Wadah media yang menggunakan cawan petri, pada saat inkubasi mikroba pada cawan petri selalu dalam posisi terbalik. Hal ini dimaksudkan untuk mencegah mikroba terkena uap air yang dihasilkan pada
saat inkubasi, sehingga kualitas mikroba tidak rusak atau mengalami gangguan (Dwijoseputro, 1987).
Adapun beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam mengisolasi bakteri menurut Jutono (1980), yaitu :
1. Sifat-sifat spesies mikrobia yang akan diisolasi 2. Tempat hidup atau asal mikroba tersebut 3. Medium untuk pertumbuhannya yang sesuai 4. Cara menanam mikroba tersebut
5. Cara inkubasi mikroba tersebut
6. Cara menguji bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa biakan murni dan sesuai dengan yang dimaksud
7. Cara memelihara agar mikroba yang telah diisolasi tetap merupakan biakan murni Ada 3 metode yang digunakan dalam mengisolasi bakteri, yaitu :
1. Metode Taburan (pour plate)
Metode pour plate dilakukan dengan menginokulasikan suspensi bahan yang mengandung bakteri dengan bantuan mikropipet untuk disemprotkan ke dalam medium agar yang sedang mencair dan menuangkannya pada petridish.
Pada metode ini, volume suspensi yang digunakan lebih dari 0,1 ml, biasanya 1 ml. Suspensi bakteri tersebut diambil dengan mikropipet dan disemprotkan ke dalam petridish yang berisi medium. Setelah diinkubasi akan terlihat koloni bakteri yang bermacam-macam, kemudian satu koloni dipilih dan diambil dengan ose, kemudian dilanjutkan dengan pengecatan gram.
2. Metode Goresan (streak plate)
Streak plate yaitu suatu cara pengisolasian bakteri yang cara inokulasinya dengan menggoreskan suspensi bahan yang mengandung bakteri pada permukaan medium dengan kawat ose dan digoreskan sesuai dengan petridish. Kultur media untuk menumbuhkan atau mengisolasikan bakteri dengan metode streak merupakan suatu teknik untuk memisahkan sel bakteri secara individual. Setelah
inkubasi, maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni terpisah yang mungkin berasal dari satu sel bakteri.
3. Metode spread plate
Metode ini adalah metode isolasi bakteri dengan cara menginokulasikan suspensi bahan yang mengandung bakteri ke atas medium agar lalu diratakan dengan menggunakan trigalski. Setelah diinokulasikan akan terlihat koloni-koloni bakteri yang tumbuh tersebar dipermukaan medium agar sehingga dapat diisolasi lebih lanjut untuk mendapatkan biakan murni.
Karakteristik Isolasi terbagi menjadi 2, yaitu :
Fenotif, Identifikasi bakteri berdasarkan informasi hasil ekspresi gen (morfologi, pewarnaan gram, dan uji biokimia) lain.
Genotif, Identifikasi bakteri berdasarkan informasi genetik.
