KINETIKA LAJU PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI DARI HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM CAMPURAN 25% BHMS + 75% LB.

(1)

KINETIKA LAJU PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI DARI HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM

CAMPURAN 25% BHMS + 75% LB

SKRIPSI

Disusun untuk Memenuhi Sebagian dari Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Sains Program Studi Biologi Jurusan Pendidikan Biologi

Oleh

Rizki Indah Permata Sari NIM 1001110

PROGRAM STUDI BIOLOGI JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA

(2)

KINETIKA LAJU PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI DARI HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM

Oleh

Rizki Indah Permata Sari

Sebuah skripsi yang diajukan untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana pada Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Desember 2014

Hak Cipta dilindungi undang-undang.

Skripsi ini tidak boleh diperbanyak seluruhya atau sebagian,

(3)

LEMBAR PENGESAHAN

KINETIKA LAJU PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI DARI HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM

Oleh :

Rizki Indah Permata Sari 1001110

disetujui dan disahkan oleh : Pembimbing I

Dr. Topik Hidayat, M.Si. NIP. 197004101997021001

Pembimbing II

Dr. Hj. Widi Purwianingsih, M.Si. NIP. 196209211991012001

Pembimbing III

Dr. Elvi Restiawaty, ST. Ph.D. NIP. 1975072720010122001

Mengetahui

Ketua Jurusan Pendidikan Biologi

(4)

(5)

Rizki Indah Permana Sari,2014

KINETIKA LAJU PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI DARI HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM CAMPURAN 25% BHMS + 75% LB

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu ABSTRAK

KINETIKA LAJK PERTKMBKHAN IAN ISOLASI GENOMIK

KONSORSIKM BAKTERI IARI HYDROTHERMAL VENT KAWIO

MENGGKNAKAN MEIIKM CAMPKRAN 25% BHMS + 75% LB

Rizki Indah Permata Sari

Telah dilakukan penelitian yang berjudul kinetika laju pertukbuhan dan isolasi genokik konsorsiuk bakteri dari hydrothermal vent Kawio kenggunakan kediuk cakpuran 25%BHMS + 75%LB. Penelitian ini bertujuan untuk kengetahui kinetika laju pertukbuhan konsorsiuk bakteri terkofilik dari

hydrothermal vent kawio dengan kenggunakan kediuk cakpuran 25% BHMS + 75% LB dan kengisolasi genoknya sebagai langkah awal dalak kengeksplorasi potensi-potensi yang ada pada bakteri hydrothermal vent Kawio secara kolekuler. Kinetika laju pertukbuhan konsorsiuk bakteri dilakukan dengan kekasukan sebanyak 10% (v/v) sakpel air hydrotherma lvent Kawio ke dalak kediuk 25% BHMS + 75% LB kekudian diinkubasi pada suhu 60ºC dengan kecepatan 175 rpk. Pengakatan dilakukan dengan kelihat nilai optical density (OD) 600 nk, berat basah dan berat kering biokassa sel setiap 2 jak sekali pengakatan selaka 24 jak. Diperoleh hasil laju pertukbuhan spesifik (µ) selaka fase eksponensial yaitu 0,18 jak-1_{, dengan nilai OD 600 nk kaksikuk 0,545 dan berat kering}

biokassa sel 8 g/L. Hasil elektroforesis kenunjukkan pita DNA hasil isolasi genok berukuran lebih besar dari 10000 bp. Uji kuantifikasi secara spektrofotoketri kenunjukkan nilai rasio OD 260 dan OD 280 sebesar 1,385 dengan konsentrasi DNA 372,5µg/kL.

Kata Kunci: kinetika laju pertukbuhan, isolasi genok, bakteri terkofilik,

(6)

Rizki Indah Permana Sari,2014

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu ABSTRACT

KINETICS OF GROWTH ANI GENOMIC ISOLATION OF CONSORTIKM MARINE BACTERIAL FROM HYIROTHERMAL

VENT KAWIO KSING A 25% BHMS + 75% LB MEIIKM

Rizki Indah Permata Sari

Study of kinetics of growth and genokic isolationof consortiuk karine bacterial frok hydrotherkal vent area, Kawio North Sulawesi has been done. The purpose of this study was to deterkine the kinetics of growth and result of genokic isolation frok therkophilic bacteria using a 25% BHMS + 75% LB kediuk. The observation of bacteria growth has been done for 24 hours and has been checked in every 2 hours. After the optikuk tike of bacteria growth was found, then the isolation of the genoke was done. Genoke isolation kethod was perforked by the isolation kethod of chlorofork isoakyl alcohol with soke kodifications. The results showed that the bacteriuk had a kaHikuk OD value with 0.545 and dry weight of cells 8 g/L. Logarithkic phase of bacterial growth occured in the growth tike of 2nd hours until 16th. The specific value of growth rate (μ) of this bacteriuk is 0.18 hours-1. Phase isolation of genokic DNA was perforked using chlorofork isoakil alkohol kethod, obtained DNA bands larger than 10000 bp. Quantitative results frok isolation of genokic reachedthe ratio 1,385 and the concentration 372,5 ng / kL .

(7)

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI... i

DAFTAR TABEL... iii

DAFTAR GAMBAR... iv

DAFTAR LAMPIRAN... v

BAB I PENDAHULUAN... 1

A. Latar Belakang... 1

B. Rumusan Masalah... 5

C. Batasan Masalah... 5

D. Tujuan Penelitian... 6

E. Manfaat Penelitian... 6

BAB II KINETIKA LAJU PERTUMBUHAN BAKTERI DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI TERMOFILIK DARI PERAIRAN HYDROTHERMAL VENT KAWIO GENOM... 7

A. Konsorsium Bakteri... 7

B. Kinetika Laju Pertumbuhan Bakteri... 8

C. Bakteri Termofilik... 16

D. Perairan Hydrothermal Vent Kawio... 19

E. Medium Buhsnell Haas Mineral Salts (BHMS) dan Luria Bertani (LB) Sebagai Medium Pertumbuhan Bakteri... 22

F. Genom dan Isolasi DNA Genom... 26

G. Elektroforesis... 30

BAB III METODE... 34

A. Jenis Penelitian... 34

B. Populasi dan Sampel... 34

C. Waktu dan Lokasi Penelitian... 34

D. Alat dan Bahan... 35

E. Prosedur Penelitian... 38

F. Analisis Data... 43

(8)

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN... 46

A. Kinetika Laju Pertumbuhan Konsorsium Bakteri hydrothermal vent Kawio pada Medium Campuran 25% BHMS + 75% LB... 46

B. Isolasi DNA Genom... 52

C. Kemurnian dan Konsentrasi DNA... 56

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN... 57

A. Kesimpulan... 57

B. Saran... 57

DAFTAR PUSTAKA... 58

(9)

KINETIKA LAJU PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI DARI HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM CAMPURAN 25% BHMS + 75% LB

DAFTAR TATEL

Tabel Halaman

2.1 Unsur yang Dibutuhkan Oleh Bakteri dan Fungsi Fisiologisnya... 23 2.2 Karakteristik Gel Agarosa dan Poliakrilamida... 31 4.1 Pengukuran Pertumbuhan Biomassa Sel Konsorsium Bakteri dari Perairan

(10)

Rizki Indah Permana Sari,2014

DAFTAR GAMTAR

Gambar Halaman

2.1 Kurva Sigmoid Pertumbuhan Bakteri... 9

2.2 Lokasi Ekspedisi INDEX SATAL yang Dilakukan Di Sangihe Talaud, Sulawesi Utara... 21

2.3 Hydrothermal Vent Gunung Bawah Laut Kawio Barat... 21

2.4 Gen adalah segmen DNA yang mengkode protein/polipeptida... 27

3.1 Sampel Air Hydrothermal Vent Kawio, Sulawesi Utara... 35

3.2 Bagan Alir Pengamatan Kinetika Laju Pertumbuhan Konsorsium Bakteri Hydrothermal Vent Kawio... 36

3.3 Bagan Alir Perhitungan Biomassa Sel Konsorsium Bakteri Hydrothermal Vent Kawio... 37

3.4 Bagan Alir Isolasi DNA Genom Konsorsium Bakteri Hydrothermal Vent Kawio... 39

3.5 Bagan Alir Elektroforesis DNA... 40

3.6 Alur Penelitian... 42

4.1 Kurva Pertumbuhan Konsorsium Bakteri Hydrothermal Vent Kawio... 45

4.2 Diagram Perbandingan Berat Basah dan Berat Kering Biomassa Sel Konsorsium Bakteri dari Perairan Hydrothermal Vent Kawio Dalam Medium Campuran 25% BHMS+75% LB Pada Inkubasi Suhu 60ºC... 48

[image:10.595.103.526.136.555.2]

(11)

Rizki Indah Permana Sari,2014

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1 Daftar Alat dan Bahan yang Digunakan Selama Penelitian………… 59 2 Dokumentasi Penelitian... 63 3 Protokol Pembuatan Reagen dan Medium yang Digunakan dalam

Penelitian...

64

(12)

1

Rizki Indah Permana Sari,2014

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu BABBIB

PENDAHULUANB

A. LatarBBelakangB

Indonesia adalah negara tropis yang dikelilingi oleh perairan dengan luas lebih dari 60% dari wilayah teritorialnya. Perairan Indonesia memiliki sumberdaya hayati laut dengan keanekaragaman yang tinggi (Srimariana, 2000). Lingkungan laut merupakan lingkungan yang memiliki keunikan karakteristik fisik, kimia, dan biologis (Steele et al., 2005). Salah satu manifestasi lingkungan laut di Indonesia yaitu berupa kawasan perairan

hydrothermal vent. Hydrothermal vent adalah kawasan kebulan asap gelap dari kegiatan vulkanik pada lingkungan laut dalam yang menyemburkan air panas hingga mencapai suhu 400 ºC (Nganro, 2009). Salah satu hydrothermal vent di perairan laut Indonesia telah berhasil ditemukan dekat dengan gunung berapi bawah laut Kawio Barat, Sulawesi Utara (BPPT, 2010).

Salah satu kajian biologis menarik yang dapat dilakukan pada perairan

hydrothermal vent Kawio, Sulawesi Utara ini yaitu mengenai keberadaan bakteri termofilik. Istilah termofilik digunakan pertama kali oleh Miquel pada tahun 1879, yaitu untuk mendeskripsikan organisme yang mampu hidup pada suhu tinggi (Morrison & Tanner, 1921). Suhu tinggi umumnya bersifat fatal bagi organisme, namun bakteri termofilik masih mampu hidup bahkan tumbuh dengan optimal. Bakteri termofilik diketahui dapat tumbuh optimal pada rentang suhu 55 – 80 ºC (Andrade et al., 1999).

(13)

2

Rizki Indah Permana Sari,2014

Bakteri termofilik mampu mensintesis molekul stabil, salah satunya adalah enzim termostabil yang mampu mengkatalis reaksi-reaksi biokimia pada suhu tinggi dan lebih stabil dibandingkan dengan enzim dari bakteri mesofilik. Enzim ini tidak hanya stabil terhadap suhu tinggi tetapi juga terhadap protein-protein denaturan, seperti detergen, pelarut organik, serta enzim protease (Andrade et al., 1999). Sifat-sifat bakteri termofilik tersebut sangat diperlukan oleh industri-industri berbasis enzim. Oleh karena itu, bakteri termofilik menawarkan keuntungan yang lebih besar dalam bidang industri dan bioteknologi (Mayende, 2006). Enzim-enzim yang diketahui dapat dihasilkan oleh bakteri termofilik yaitu enzim amilase, xylanase, selulase, kitinase, protease, lipase, dan DNA polimerase (Haki & Rakshit, 2003).

Penelitian mengenai bakteri dari laut dalam kepulauan Kawio telah dilakukan oleh Agung & Moeis (2013), pada penelitian tersebut telah berhasil mengisolasi DNA metagenom dari sampel air dan sedimen laut-dalam perairan Kawio menggunakan teknik Whole Genome Amplification (WGA). Berdasarkan hasil analisis sekuensing yang dilakukan pada penelitian tersebut diperoleh kemiripan tertinggi dengan gen pengkode replication protein (Rep) dari bakteri Pseudomonas putida.

Kajian mengenai bakteri termofilik yang berasal dari kawasan

hydrothermal vent Kawio sampai saat ini juga telah dilakukan oleh Restiawaty

et al., (2013), pada penelitian tersebut berhasil mengidentifikasi bakteri yang memiliki kemiripan dengan Geobacillus sp. dianalisis menggunakan gen 16S rRNA. Dari hasil penelitian tersebut diketahui karakteristik pertumbuhan isolat bakteri termofilik dari kawasan hydrothermal vent Kawio memiliki suhu inkubasi optimum pada suhu 60ºC. Isolat bakteri dari hydrothermal vent

Kawio tersebut diketahui dapat tumbuh pada medium BHMS+gliserol sebagai sumber karbon untuk melakukan petumbuhan biomassa sel dan memproduksi suatu produk fermentasi (Restiawaty et al., 2013).

(14)

3

Rizki Indah Permana Sari,2014

tinggi. Bakteri yang terdapat pada lingkungan perairan laut dalam kawasan

hydrothermal vent Kawio tidak hanya berada dalam bentuk tunggal tetapi campuran dari berbagai jenis bakteri. Istilah yang sering digunakan untuk campuran beberapa jenis bakteri disebut konsorsium bakteri (Komarawidjaja, 2009). Menurut Komarawidjaja (2009), penggunaan konsorsium bakteri cenderung memberikan hasil yang lebih baik dibandingkan penggunaan isolat tunggal. Kerja enzim-enzim dari konsorsium bakteri memungkinkan adanya kerjasama dalam penggunaan nutrisi yang tersedia di lingkungan sebagai pertahanan hidupnya (Okoh, 2006).

Untuk dapat melakukan kajian biologis pada konsorsium bakteri termofilik dari kawasan hydrothermal vent Kawio dapat dilakukan dengan mempelajari kinetika laju pertumbuhan dari konsorsium bakteri tersebut. Mempelajari kinetika laju pertumbuhan bertujuan untuk mengetahui sifat-sifat pertumbuhan bakteri pada medium pertumbuhan tertentu. Salah satu manfaat informasi kinetika pertumbuhan yaitu dapat digunakan untuk menentukan waktu untuk melakukan isolasi DNA genom. Pertumbuhan bakteri mengacu pada pertambahan total massa sel dan pertambahan massa sel bakteri berbanding lurus dengan pertambahan komponen seluler lain seperti DNA (Deoxyribosa Nucleotida Acid), RNA (Ribosa Nucleotida Acid) dan protein (Pelczar & Chan, 2005).

Pertumbuhan didefinisikan sebagai peningkatan secara teratur pada semua komponen-komponen kimiawi sel dan struktur sel. Kecepatan pertumbuhan untuk sistem uniseluler seperti pada bakteri didefinisikan sebagai peningkatan jumlah sel atau massa sel per satuan waktu (Middelbeek et al., 1992). Sehingga dengan mengamati kinetika laju pertumbuhan sel pada konsorsium bakteri dari perairan hydrothermal vent Kawio, dapat ditentukan waktu yang tepat untuk melakukan isolasi DNA genom (Restiawaty, 2013).

(15)

4

Rizki Indah Permana Sari,2014

bakteri termofilik dari perairan hydrothermal vent Kawio. Genom merupakan keseluruhan informasi genetik yang ada pada sel, di dalam genom inilah terdapat gen-gen pengkode enzim yang dapat dieksploitasi manfaatnya (Gaffar, 2007). Sehingga tahapan isolasi DNA genom merupakan tahapan yang penting dilakukan untuk melakukan analisis karakter genetika selanjutnya (Tenruilo, 2001).

Pertumbuhan sel bakteri dipengaruhi oleh kondisi lingkungan medium tumbuh misalnya suhu dan komposisi medium (Middelbeek et al., 1992). Komposisi medium kultur yang baik untuk petumbuhan konsorsium bakteri perairan hydrothermal vent Kawio yaitu medium yang mengandung komposisi garam-garam mineral yang sesuai dengan habitat asli bakteri tersebut (Restiawaty, 2013).

Medium Buhsnell Haas Mineral Salt (BHMS) merupakan medium yang sering digunakan sebagai medium pertumbuhan bagi bakteri dari sampel air laut. Medium BHMS mengandung unsur makro nutrien dan mikro nutrien yang penting bagi pertumbuhan bakteri. Unsur makro nutrien dan mikro nutrien tersebut berasal dari komposisi mediumnya, yaitu KH2PO4, K2HPO4,

MgSO4, CaCl2, NH4NO3, dan FeCl3 (Cappello et al., 2012; Nunal, 2014).

Medium lain yang biasa digunakan untuk pertumbuhan bakteri dari air laut yaitu medium Luria Bertani (LB) Broth. Medium LB mengandung komposisi trypton, NaCl, dan yeast extract yang kaya nutrisi bagi pertumbuhan bakteri. Kandungan garam yang ada pada medium LB diperoleh dari NaCl, namun perlu ditambahkan lagi variasinya, seperti dengan penambahan MgSO4.

Penambahan MgSO4 dapat meningkatkan pertumbuhan bakteri hydrothermal vent Kawio (Restiawaty, 2013).

(16)

1

Rizki Indah Permana Sari,2014

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu B. RumusanBMasalahB

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan diatas dapat dirumuskan masalah sebagai berikut:

“Bagaimanakah kinetika laju pertumbuhan dan hasil isolasi DNA genomik konsorsium bakteri dari perairan hydrothermal vent Kawio menggunakan medium campuran 25% BHMS + 75% LB?”

Berdasarkan rumusan masalah tersebut muncul beberapa pertanyaan penelitian sebagai berikut:

1. Bagaimanakah kurva pertumbuhan konsorsium bakteri dari perairan

hydrothermal vent Kawio menggunakan medium campuran 25% BHMS + 75% LB?

2. Berapakah nilai laju pertumbuhan spesifik konsorsium bakteri dari perairan hydrothermal vent Kawio menggunakan medium campuran 25% BHMS + 75% LB?

3. Bagaimanakah hasil elektroforesis dari hasil isolasi DNA genom konsorsium bakteri dari perairan hydrothermal vent Kawio yang ditumbuhkan pada medium campuran 25% BHMS + 75% LB?

4. Bagaimanakah nilai kemurnian dan konsentrasi DNA hasil isolasi DNA genom konsorsium bakteri dari perairan hydrothermal vent Kawio yang ditumbuhkan pada medium campuran 25% BHMS + 75% LB?

C. BatasanBMasalahB

Agar permasalahan dalam penelitian ini terfokus pada hal yang diharapkan, ruang lingkup dibatasi pada:

1. Konsorsium bakteri yang digunakan sebagai sampel merupakan sampel air yang berasal dari perairan hydrothermal vent Kawio, Sulawesi Utara Indonesia yang sudah tersedia di laboratorium rekayasa genetika PAU ITB.

(17)

6

KINETIKA LAJU PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI DARI HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM CAMPURAN 25% BHMS + 75% LB

3. Konsorsium bakteri termofilik yang akan diisolasi DNA genomnya adalah bakteri yang mampu hidup pada medium campuran 25% BHMS + 75% LB, dalam keadaan aerob, dan pada suhu 60 ºC.

D. TujuanBPenelitianB

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mempelajari kinetika laju pertumbuhan dan mengisolasi DNA genom konsorsium bakteri dari perairan

hydrothermal vent Kawio menggunakan medium campuran 25% BHMS + 75% LB, yang dapat dirinci sebagai berikut:

1. Mengetahui kurva pertumbuhan konsorsium bakteri dari perairan

hydrothermal vent Kawio yang ditumbuhkan pada medium campuran 25% BHMS + 75% LB.

2. Mengetahui laju pertumbuhan spesifik konsorsium bakteri dari perairan

hydrothermal vent Kawio menggunakan medium campuran 25% BHMS + 75% LB.

3. Mengetahui hasil elektroforesis, nilai kemurnian, dan konsentrasi DNA dari hasil isolasi DNA genom konsorsium bakteri dari perairan

hydrothermal vent Kawio yang ditumbuhkan pada medium campuran 25% BHMS + 75% LB.

E. ManfaatBPenelitianB

(18)

34

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu BABBIIIB

METODEB B A. JenisBPenelitianB

Penelitian ini merupakan penelitian murni atau pure research yang

dilakukan dengan metode deskriptif, yaitu suatu metode penelitian untuk membuat deskripsi, gambaran atau lukisan secara sistematis, faktual dan akurat mengenai fakta-fakta, sifat-sifat serta hubungan antar fenomena yang diselidiki (Nazir, 1988).

B. PopulasiBdanBSampelB

Populasi yang diamati pada penelitian ini adalah seluruh konsorsium

bakteri pada sampel air dari perairan hydrothermal vent Kawio, Sulawesi

Utara. Sampel yang diamati pada penelitian ini adalah konsorsium bakteri dan

DNA genom yang diisolasi dari perairan hydrothermal vent Kawio yang dapat

ditumbuhkan dengan menggunakan medium campuran 25% BHMS + 75% LB pada suhu 60 ºC.

C. WaktuBdanBLokasiBPenelitianB

Penelitian ini dimulai bulan April sampai dengan September 2014. Penelitian dilakukan di Laboratorium Rekayasa Genetika, Pusat Antar Universitas (PAU) dan Laboratorium Genetika, Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati (SITH) Institute Teknologi Bandung (ITB). Penelitian juga dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Universitas Pendidikan Indonesia (UPI).

D. AlatBdanBBahanB

Peralatan yang digunakan pada penelitian ini terdapat di Laboratorium Rekayasa Genetika PAU ITB, Laboratorium SITH ITB, dan Laboratorium Mikrobiologi UPI. Daftar alat dan bahan yang digunakan selama penelitian ini dapat dilihat pada Lampiran 1.

(19)

35

Rizki Indah Permana Sari,2014

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu E. ProsedurBPenelitianB

1. TahapBPersiapanBAlatB

Alat-alat yang akan digunakan selama penelitian dicuci terlebih dahulu sampai bersih dan dikeringkan. Alat kemudian dibungkus dengan kertas pembungkus setelah itu dilakukan sterilisasi panas lembab dengan cara

dimasukan ke autoclave selama 15 - 20 menit pada suhu 121ºC.

2. PembuatanBMediumBCampuranB25%BBHMSB+B75%BLBB

Medium LB (Luria Bertani) Broth dan BHMS (Bushnell Haas Mineral salts) yang akan digunakan sebagai medium pertumbuhan konsorsium bakteri

dari sampel air hydrothermal vent Kawio dibuat masing-masing terlebih

dahulu secara terpisah. Medium LB cair disiapkan dengan menggunakan komposisi 5 g yeast exstract, 10 g NaCl, 10 g trypton dan ditambahakan 0,5%

MgSO4 (Restiawaty et al., 2013) kemudian ditambahkan aquades sampai 1

liter, setelah itu diaduk sampai homogen selanjutnya adjust pH sampai 7,0 ±

0,2.

Untuk membuat medium BHMS cair disiapkan dengan komposisi 1 g

KH2PO4, 0,2 g K2HPO4, 0,2 g MgSO4.7H2O, 0,02 g CaCl2, 1 g NH4NO3 dan 2

tetes FeCl3 60% kemudian ditambahkan aquades sampai 1 liter (Cappello et

al., 2012). Selanjutnya ke dalam larutan medium BHMS ditambahkan 30 mM

glukosa setelah itu, adjust pH sampai 7,0 ± 0,2.

Setelah kedua medium selesai dibuat secara terpisah, kemudian langkah selanjutnya adalah membuat medium campuran 25% BHMS + 75% LB. Untuk membuat medium campuran 25% BHMS + 75% LB sebanyak 300 ml, dilakukan dengan menyampurkan sebanyak 250 ml BHMS dan 750 ml LB. Selanjutnya medium campuran 25% BHMS + 75% LB disterilisasi dengan

(20)

36

Rizki Indah Permana Sari,2014

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu 3. TahapBPenelitianB

a. KonsorsiumBBakteriBdariBPerairanBhydrothermal vent KawioB

Sampel yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah konsorsium

bakteri dari perairan Hydrothermal Vent Kawio, Sulawesi Utara. Sampel

konsorsium bakteri yang digunakan yaitu berupa sampel air yang sudah tersedia di laboratorium PAU ITB yang disimpan dalam lemari es suhu 4 ºC.

GambarB3.1 Sampel Air Hydrothermal Vent Kawio, Sulawesi Utara (Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2014)

Berdasarkan data dari NOAA-BPPT pada INDEX SATAL (Dalam

Restiawaty et al., 2013) lokasi pengambilan sampel air di perairan

Hydrothermal vent Kawio terletak pada 5º72’ 0” Lintang Utara dan 127º14’

0” Bujur Timur, Provinsi Sulawesi Utara. Kedalaman Kawio Hydrothermal

vent yaitu berkisar 3500–4720 m (inner vent) dan berkisar 1500–3000 m

(surrounding) dengan tekanan sebesar 317 atm. Kawio Hydrothermal vent

memiliki temperatur 250–400 ºC (inner vent), 35–80 ºC (surrounding), dan 2–

4 ºC (deep water). Keadaan pH di Kawio Hydrothermal vent sekitar 2,8–6,5

dan memiliki salinitas sekitar 35–40 ppt dengan jenis sampel berupa campuran air dan sedikit sedimen.

b. LajuBPertumbuhanBKonsorsiumBBakteriB

Sebelum melakukan pengamatan laju pertumbuhan konsorsium bakteri

dari perairan hydrothermal vent Kawio, terlebih dahulu dilakukan tahap

(21)

37

memasukkan sebanyak 10 % (v/v) sampel air berisi konsorsium bakteri dari

perairan hydrothermal vent Kawio ke dalam 10 ml medium campuran 25%

BHMS+75% LB. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 60 ºC dan selama inkubasi

kultur diagitasi pada kecepatan 175 rpm dalam incubator shaker selama 18

jam. Setelah 18 jam diinkubasi, kemudian sebanyak 10% (v/v) dari hasil

enrichment diinokulasikan kedalam 50 ml medium campuran 25%

BHMS+75% LB, selanjutnya diinkubasi kembali pada suhu 60 ºC dengan

kecepatan 175 rpm pada incubator shaker selama 18 jam.

Selanjutnya untuk mengamati laju pertumbuhan konsorsium bakteri dari

perairan hydrothermal vent Kawio dilakukan dengan mengambil 10% (v/v)

hasil enrichment ke dalam 250 ml medium campuran 25% BHMS+75% LB,

kemudian diinkubasi pada suhu 60 ºC dan diagitasi pada kecepatan 175 rpm

dalam incubator shaker. Pengamatan dilakukan setiap 2 jam sekali selama 24

jam. Skema bagan alir pengamatan kinetika laju pertumbuhan konsorsium

bakteri dari hydrothermal vent Kawio daat dilihat pada Gambar 3.2 di bawah

ini

B

10 % (v/v) Sampel air hydrothermal vent dimasukkan ke dalam 10 ml

medium campuran 25% BHMS+ 75% LB

Diinkubasi pada suhu 60°C, 175 rpm, overnight

10 % (v/v) kultur sebelumnya dimasukkan ke dalam 50 ml medium campuran 25% BHMS+ 75% LB

Diinkubasi pada suhu 60°C, 175 rpm, overnight

10 % (v/v) kultur sebelumnya dimasukkan ke dalam 250 ml medium campuran 25% BHMS+ 75% LB

Diinkubasi pada suhu 60°C, 175 rpm

Pengamatan dilakukan setiap 2 jam sekali selama 24 jam: 1) Optical Density (OD) 600 nm

2) Berat basah sel (g/L) 3) Berat kering sel (g/L)

GambarB3.2 Bagan Alir Pengamatan Kinatika Laju Pertumbuhan

(22)

38

Rizki Indah Permana Sari,2014

Pengamatan pertumbuhan biomassa sel dilakukan dengan melihat nilai

Optical Density (OD) 600 nm dengan menggunakan spektrofotometer UV. Sebanyak 1 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung khusus kemudian dilihat OD sel-nya pada panjang gelombang 600 nm. Selanjutnya 1 ml kultur yang sudah dicek OD-nya, dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 ml yang sebelumnya telah ditimbang berat tabung kosongnya. Kemudian sampel disentrifugasi selama 30 menit pada kecepatan 14000 rpm. Setelah disentrifugasi, supernatan yang mengandung medium kultur dibuang, setelah itu pelet sel yang dihasilkan di bagian bawah tabung mikro ditimbang (berat basah sel).

GambarB3.3 Bagan Alir Perhitungan Biomassa Sel Konsorsium Bakteri

Hydrothermal Vent Kawio

Untuk menghitung berat basah sel, berat yang ditimbang tersebut dikurangi dengan berat tabung mikro kosong yang digunakan. Setelah ditimbang berat basahnya selanjutnya dikeringkan di dalam oven selama 18– 24 jam atau sampai diperoleh berat kering yang konstan. Cara perhitungan berat kering sel dilakukan seperti pada perhitungan berat basah sel.

X (g/l) = Berat tabung berisi sel kering atau basah (g) – berat tabung kosong x 103

(23)

39

Rizki Indah Permana Sari,2014

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu c. IsolasiBDNABTotalB(Genom)B

DNA total konsorsium bakteri diisolasi menggunakan metode Kloroform

Isoamil Alkohol (CIAA) yang sudah dioptimasi (Sambrook et al. 1989).

Sampel diperoleh dari hasil panen bakteri yang menunjukkan nilai OD 600 nm tertinggi yang dicapai pada waktu pertumbuhan optimumnya. Sebanyak 3 ml

sampel dimasukkan ke dalam tabung mikro (tube) ukuran 1,5 ml kemudian

disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit untuk memisahkan pellet dengan supernatan. Selanjutnya buang supernatan sampai tidak ada lagi medium pada tabung mikro. Kemudian ke dalam tabung mikro ditambahkan larutan buffer lisis sebanyak 750 µl dan klorofom : isoamil alkohol (24 : 1) sebanyak 750 µl, selanjutnya diresuspensi menggunakan tips sampai pellet homogen. Setelah pellet homogen dengan larutan buffer lisis dan kloroform : isoamil alkohol (24 : 1), tabung mikro disimpan di dalam

freezer pada suhu –80 ºC selama 10 menit. Setelah 10 menit, kemudian tabung

mikro diambil dari freezer dan dibiarkan mencair terlebih dahulu lalu siap

untuk disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit. Setelah disentrifugasi, akan terjadi pemisahan fasa anorganik (fasa atas) dan fasa organik (fasa bawah). Kemudian fasa atas yang terbentuk dipindahkan secara hati-hati ke dalam tabung mikro yang baru ukuran 1,5 ml.

Selanjutnya setelah fasa atas dipindahkan, ditambahakan klorofom:isoamil alkohol (24 : 1) sebanyak 750 µl ke dalam tabung mikro setelah itu tabung mikro segera diinvert sebanyak 10 kali atau lebih. Selanjutnya tabung mikro disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit. Setelah itu akan terbentuk fasa atas, kemudian fasa atas yang terbentuk tersebut dipindahkan secara perlahan ke dalam tabung mikro 1,5 ml yang baru dan dihitung volume fasa atas yang diperoleh. Selanjutnya ke dalam tabung mikro ditambahkan 4M

LiCl dingin (1/10x volume fasa atas) dan ethanol absolute dingin (1x volum

atase fas), kemudian tabung mikro diinvert kurang lebih sebanyak 10 kali.

Selanjutnya tabung mikro disimpan di dalam freezer pada suhu - 20 ºC selama

(24)

40

Rizki Indah Permana Sari,2014

pada suhu -20 ºC, tabung mikro disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit. Setelah disentrifugasi akan terjadi pemisahan antara pellet DNA dengan supernatan. Supernatan yang terbentuk dibuang dan pellet dibiarkan tetap di dalam tabung mikro.

Selanjutnya ke dalam tabung mikro ditambahkan ethanol 70% dingin sebanyak 20 µl, kemudian diresuspensi menggunakan tips sampai pellet DNA larut. Setelah itu, tabung mikro disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit. Kemudian supernatan yang terbentuk dibuang, sedangkan pellet dibiarkan tetap di dalam tabung mikro dan dibiarkan kering di udara dengan cara membuka tutup tabung mikro selama 20 - 25 menit atau sampai pellet kering. Setelah pellet kering, pellet direhidrasi dengan menambahkan 10

µl buffer TE pH 8,0 kemudian simpan pada freezer suhu –20 ºC.

GambarB3.4 Bagan Alir Isolasi DNA Genom Konsorsium Bakteri

Hydrothermal Vent Kawio

d. ElektroforesisBGelBAgarosaB

(25)

41

ml buffer TAE 1x kemudian dididihkan dengan menggunakan penangas sampai agar larut. Gel agarosa yang sudah hangat-hangat kuku dituangkan ke

dalam cetakan yang dilengkapi dengan sisir (comb) dan dibiarkan mengeras

pada suhu ruang. Gel agarosa dan cetakannya direndam pada buffer TAE 1x di kolom elektroforesis. Sampel DNA Genom sebanyak 3 µl dicampur dengan 2 µl loading dye pada plastik wrap kemudian diresuspensikan sampai homogen setelah itu dimasukkan ke setiap sumur yang telah dibentuk oleh cetakan sisir

(Comb) selain itu pada tahap ini juga digunakan penanda DNA marker 1 kb.

Sampel kemudian dilakukan running gel pada alat elektroforesis pada

tegangan 100 volt selama 45 menit. Gel berisi pita DNA hasil dari elektroforesis diwarnai dengan menggunakan etidium bromida (EtBr) selama

5 menit kemudian kelebihan pewarna EtBr dibilas menggunakan aquades. Gel

yang sudah diwarnai kemudian diamati dengan menggunakan sinar UV (UV Transluminator). Fragmen atau pita DNA yang muncul di dokumentasikan dengan menggunakan kamera digital.

GambarB3.5 Bagan Alir Elektroforesis DNA

(26)

42

Rizki Indah Permana Sari,2014

Sampel DNA genom hasil isolasi diambil sebanyak 2 µl dan diencerkan dengan deion sampai 50 kali pengenceran. Sampel DNA genom yang sudah diencerkan kemudian dimasukkan ke dalam tabung kuvet khusus selanjutnya dimasukkan ke dalam alat spektrofotometer. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan Absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm (OD

260 danBOD 280). Nilai purity DNA dilihat dari nilai rasio OD 260/ OD 280.

Selanjutnya untuk nilai konsentrasi DNA dihitung dengan menggunakan rumus OD260 x konstanta dsDNA (50) x faktor pengenceran. Karena pada penelitian ini digunakan pengenceran 50x maka rumusnya adalah:

B

f. AnalisisBDataB

Laju pertumbuhan spesifik (µ) konsorsium bakteri dihitung dari data berat kering sel (g/l) yang telah diperoleh per satuan waktu pada pengamatan laju pertumbuhan konsorsium bakteri dengan menggunakan rumus sebagai berikut:

Dari nilai optical density (OD) 600 nm per jam yang diperoleh, dibuat

kurva pertumbuhannya untuk melihat fase-fase pertumbuhan konsorsium bakteri.

DNA genom hasil isolasi dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif. Secara kualitatif dilakukan menggunakan elektroforesis pada gel agarosa dan secara kuantitatif dilakukan dengan melihat rasio OD 260/ OD 280 pada alat spektrofotometer UV. Data yang diperoleh kemudian dibahas sesuai dengan acuan teori yang ada.

KonsentrasiBDNA(цg/ml)B=BODB260BxB50BxB50Bng/µl

(27)

43

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu F. AlurBPenelitianB

B B

Tahap Persiapan Alat Penyusunan Proposal

Studi literatur

Elektroforesis DNA Genom Hasil Isolasi

Kemurnian dan Konsentrasi DNA

Analisis Data

Penyusunan Skripsi

GambarB3.6 Alur penelitian

Isolasi DNA Total (Genom) dengan Metode Kloroform Isoamil alkohol (CIAA)

Kinetika Laju Pertumbuhan Konsorsium Bakteri

Enrichment Konsorsium Bakteri Tahap Pembuatan medium campuran

(28)

Rizki Indah Permana Sari,2014

BABBVB KESIMPULANB

B

A. KesimpulanB

Konsorsium bakteri dari perairan hydrothermal vent Kawio mampu hidup dan tumbuh dengan baik dalam medium campuran 25% BHMS + 75% LB pada suhu 60 ºC. Kurva pertumbuhan konsorsium bakteri menunjukkan empat fase yaitu fase lag, eksponensial, stasioner, dan kematian. Fase lag terjadi selama 2 jam inkubasi selanjutnya memasuki fase eksponensial terjadi dari jam 2 sampai jam 16 inkubasi, kemudian dari jam 16 sampai jam ke-20 inkubasi memasuki fase stasioner, setelah itu konsorsium bakteri memasuki fase kematian sel. Konsorsium bakteri mencapai nilai 2D 600 nm maksimum pada waktu inkubasi 18 jam sebesar 0,545 dengan berat basah dan berat kering biomassa sel masing-masing sebesar 56 dan 8 (g/L). Laju pertumbuhan spesifik (µ) konsorsium bakteri diperoleh selama fase eksponensial sebesar 0,18 jam-1_.B

Hasil isolasi DNA genom konsorsium bakteri dari perairan hydrothermal

vent Kawio menggunakan medium campuran 25% BHMS + 75% LB yang

diperoleh pada hasil elektroforesis menunjukkan pita DNA yang berukuran lebih besar dari 10000 bp, dan masih terdapat kontaminasi RNA. Nilai kemurnian hasil isolasi DNA genom yang diperoleh dari rasio 2D260/280 sebesar 1,385. Hal ini menunjukkan DNA genom hasil isolasi masih terdapat kontaminasi protein atau RNA. Konsentrasi DNA yang diperoleh pada penelitian ini yaitu sebesar 372,5 µg/ml.

B. SaranB

(29)

(30)

53

KINETIKA LAJU PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI DARI HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM CAMPURAN 25% BHMS + 75% LB

DAFTAR PUSTAKA

Andrade, C., Jr. pereira, N., Antranikian, G. (1999). Extremely Thermiphilic Micriirganisms and Their Pilymer Hidrilytic Enzymes. Rev de Microbiol,30, hlm. 287 - 298.

Agung M.U.K. & Mieis, M.R. (2013). Transpisin insertiin phenimenin during clining if a partial fragment derived frim metagenimic DNA isilated frim deep-sea water and sediment if Kawii Island, Nirth Sulawesi. Sequalen Bulletin if Marine & Fishries Pistharvest & Biitechniligy, 8 (3), hlm. 129-137.

Aswani, H. (2006). Keanekaragaman Bakteri Termifilik yang Terdapat Dalam Sumber Mata Air Panas Di Taman Wisata Padusan Pacet, Kabupaten Mijekerti, Jawa Timur. (Skripsi). Jurusan Biiligi FMIPA, Universitas Malang, Malang.

Atlas, R.M. (1984). Microbiology. Fundamentals and Applications(hlm. 879). New Yirk: Macmillan.

Ausubel, et al. (2003). Current protocol in Molekular Biology. Ney Jersey: Jihn Wiley & Sisns, Inc.

Badan Pengkajian dan Penerapan Tekniligi. (2010). Baruna Jaya Iv Mulai Berlayar Lakukan Index Satal. [Online]. Tersedia: http://www.bppt.gi.id/index.php/prifil/irganisasi/489-baruna-jaya-iv-mulai-berlayar-lakukan-index-satal.

Biyer, R.(1993).Modern Experimental Biocyemistry.2nd Editiin.Califirnia: Benjamin/Cummings Publishing Cimpany Inc.

Brick, T.D. (1986). Tyermopyiles: General, Molecular, and Applied Microbiology. New Yirk: Jihn Wiley & Sin.

Campbell, N.A. & Reece, J.B. (2010). Boilogy, edisi ke delapan. Jakarta: Penerbit Erlangga.

(31)

54

Rizki Indah Permana Sari,2014

Cillins, T., Meuwis, M.A., Stals, I., Claeyssens, M., Feller,G., & Gerday, C. (2002). A Nivel Family 8 Xylanase, Functiinal & Physicichemical Characterizatiin. J. Biol.Cyem., 277, hlm.35133–35139.

Demerdash, Hassan, A.M.El. (2012). ”A Simple and Inexpensive Pricedure firChrimisimal DNA Extractiin frim Strepticiccus thermiphilusStrains”.Middle-East Journal of Scientific Researcy,11 (1), hlm. 13-18.

Departemen Pertanian. (2008). Metagenimik, Era Baru Biitekniligi. Bigir: Deptan.

Dirnawan, H., Suwanti, A., & Purwadaria, T. (2000). “Penghasil Enzim Hidrilitik-Ekstraseluler dari Sumber Air PanasGunung Pancar”. Jurnal Hayati, 7 (2), hlm. 52-57

Edwards, C. (1990). Microbiology of Extreme Environments. New Yirk: Mc Graw- Hill Publishing Cimpany.

Fliidgate, G.D. (1972). Biidegradatiin if Hidricarbins in The Sea. Dalam: Water Pillutiin Micribiiligy. R. Mitchhell (ed). Jihn Wiley & Sins. Inc. hlm. 153–171.

Gaffar, S. (2007). Buku Ajar Biiligi Milekuler. Jurursan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Padjajaran, Bandung.

Ghish. (2005). ”Priductiin if Lipase and Phisphilipase Enzymes frimPseudiminas sp and Their Actiin in Phisphilipids. Journal of Oleo Science,54(7), hlm. 407-411

Gittschal, J., Harder, W., & Prins, R. (2007). Principles if Enrichment, Isilatiin, Cultivatiin, andPreservatiin if Bacteria. [Online]. Tersedia:

http://rizzi.springer-ny.cim:6336/dynaweb/verlagprik/prikbiik/IDMATCH(CHP2NDED,6/ @BriwserPrint__BiikTextView/;uf=0;ts=chapters;cs=brwprint

Haki, G.D. & Rakshit, S.K. (2005). Develipment In Industrially Impirtant Thermistable Enzymes: A Review”. Bioresource Tecynology, 89 (3), hlm. 17-34.

(32)

55

Rizki Indah Permana Sari,2014

Indrajaya, Madayanti,F., & Akhmalika. (2003). Isilasi dan identifikasi mikriirganisme termifil isilat kawah wayang. Jurnal mikrobiologi indonesia, 8, hlm. 67-71

Jenkins, R.O. (1992). The Estimatiin if Biimass. In: Cartledge TG, editir. In Vitro Cultivation of Microorganisms. Oxfird: Butterwirth – Heinemann. hlm 53-77.

Jein, J.H., Kim, J.T., Kim, Y.J., Kim, H.K., Lee, H.S., Kang, S.G., Kim, S.J., & Lee, J.H. (2009). Clining & characterizatiin if a new cildactive lipase frim a deepsea sediment metagenime. Appl. Microbiol.Biotecynol, 81, hlm. 865–874.

Kementrian Riset dan Tekniligi. (2010). Kerjasama Riset Kelautan Indonesia-Amerika Serikat melalui Index Satal 2k1k. Ristek.

Kimarawidjaja, W. (2009). Karakteristik Dan Pertumbuhan Kinsirsium Mikriba Likal Dalam Media Mengandung Minyak Bumi. Jiurnal Tekniligi dn Lingkungan, 10 (1), hlm. 114-119.

Kusnadi, Syulasmi, A., & Hamdiyati, Y. (2012). Petunjuk Praktikum Mikribiiligi. Jurusan Pendidikan Biiligi, FPMIPA UPI, Bandung. [Tidak Diterbitkan].

Linaceri, R., J. Rueda & A.M.Vazquez. (1998). Quantificatiin if DNA. hlm. 18-21 dalam, A.P.G., Isaac, & D.S., Ingram (Eds.) Milecular Tiils fir Screening Biidiversity: Plants and Animals. Chapman and Hall. Lindin, Weinheim, New Yirk, Tikyi, Melbiurne, Madras.

Madigan, M.T. Martinki, J.M. Parker, J. (1998). ”Brick Biiligy if Microorganisms”, Prentice-Hall Internatiinal (UK) Limited, Lindin.

Mathur, E.J., Tiledi, G., Green, B.D., Pidar, M., Richardsin, T.H., Kulwiec, M., & Chang, H.W. (2006). A Biidiversitybased Appriach ti Develipment if Perfirmance Enzymes. Ind. Biotecynol, 1, hlm. 283–287,

Mayende L, Wilhelmi B.S, Pletschke B.I. (2006). Cellulase (CMCase) and pilyphenil ixidase frim thermiphilic Bacillus spp. Isilated frim cimpist. Soil Biol Biocyem,38, hlm. 2963-2966.

(33)

56

Rizki Indah Permana Sari,2014

Middelbeek, E.J., Jenkins, R.O., Drijver, J.S - de Haas. (1992). Griwth in Batch Culture. In: Cartledge TG, editir. In VitroCcultivation of Microorganisms(hlm. 79-106). Oxfird: Butterwirth - Heinemann.

Middelbeek, E.J., Jenkins, R.O., Drijver, J.S. - de Haas. (1992). Nutritiin and Cultivatiin if Micriirganisms. In: Cartledge TG, editir. In Vitro Cultivation of Microorganisms. Oxfird: Butterwirth - Heinemann. hlm 21-51.

Mikkelsen, S.R & Cirtin, E. (2004). Biianalytical Chemistry. Jersey: Jihn Wiley & Sisns, Inc.

Miat, A.G. & Fister, J.W. (1995). Microbial Pyysiology(hlm. 19-97). New Yirk: A Jihn Wiley & Sins Inc.

Mirrisin, L. & Tanner, F. (1921). Studies if Thermiphilic Bacteria. (Tesis). Master if Science in Bacteriiligy, UniversitasIlliniis.

Munawar. (1999). Isilasi dan Uji Kemampuan Isilat Bakteri Rizisfir Dari Hutan Bakau Di Cilacap Dalam Mendegradasi Residu Minyak Bumi. (Tesis).Sekilah Pascasarjana, Institute Tekniligi Bandung, Bandung.

Muharni. (2010). “Isolasi dan Identifikasi Bakteri pengyasil Kitinase dariSumber Air Panas Danau Ranau Sumatera Selatan. (Skripsi).Universitas Sriwijaya, Sumatera Utara.

Nam et al. (2004). Galaktisidase gene if Tyermus tyermopyilus KNOUC 112 isilated frim hit springs if a vilcani area in New Zealand: identificatiin if bacteria, clining, and expressiin if the gene in Escyericyia coli. J. Anim Sci., 17, hlm. 1591-1598.

Nazir, M. (1988). Metode Penelitian. Jakarta: Ghalia Indinesia.

Nier, A., Saifuddin, Gustiananda, M. (1997). PCR tanpa isilasi DNAdari Sel Epitel Ringga Mulut”. J. M. S., 2(1), hlm. 35-45

Nuriniyah, T. & Putra, S.R. (2012). Identifikasi Spesies Isilat Bakteri S1 denganMetide Analisa Sekuen Fragmen Gen 16SrDNA. Jurnal Teknik POMITS, 1(1), hlm. 1-6

Nunal, S.N. (2014). Biiremediatiin if Oil-Cintaminated Seawater and Sediment by An Oil-degradatiin Bacterial Cinsirtium.

(34)

57

Rizki Indah Permana Sari,2014

thesis if Kilej University Terengganu, Universiti Putra Malaysia, Malayasia, 174 pp.

Pelczar &Chan. (1986). Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Jakarta: Universitas Indinesia Press. hlm. 131-156.

Prasetyi, A.A. (2009). Materi Asistensi Biimedik. FK UNS.

Restiawaty, E. (2013). Tiwards White Biitechniligy by Expliring if Industrial Enzymes Frim /the Metagenime if Hydrithermal Vent Micribes at Kawii Island – Indinesia. Internatiinal Sympisium if German Siciety fir Biichemistry and Milecular Science, Frankrut, Germany.

Restiawaty, E., Pertiwi, W., Ihsan, N., Aryantha, N.P., & Nathalia, D. (2013). Screening Bakteri untuk Biikinversi Limbah Biidiesel dari Diversitas Bakteri Indinesia. Seminar dan pameran inivasi dan kintribusi perempuan peneliti ITB bagi industri dan masyarakat, Bandung, Indinesia.

Sa’id, E.G. (1987). Bioindustri. Penerapan Teknologi Fermentasi. Jakarta: Mediyatama Sarana Perkasa. hlm 317.

Sambriik, J., & Russel. (2001). Molecular Cloning-A Eaboratory Manual. New Yirk: Cild Spring Harbir Labiratiry Press.

Sambriik, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989). Milecular Clining, A Labiratiry Manual. Secind editiin. Usa: cild spring harbir labiratiry press.

Schlegel, H.G., Schmidt, K. (1994). Mikrobiologi Umum. Baskiri ,T. penerjemah. Yigyakarta: Gadjah Mada Univesity Press.hlm. 202-245.

Schmeisser, C., Steele, H., Streit, W.R.(2007). Metagenimics: Biitechniligy with Nin-Culturable Micribes. J.Appl Microbiol Biotecynol, 75, hlm. 955–962

Schilass, P.D. & Handelsman, J. (2003). Biitechniligical prispects frim metagenimics. Curr. Opin. Biotecynol, 14, hlm. 303–310.

Sharma, R. (2005). Unculturable’ bacterial diversity. An untapped resource. Curr. Sci., 89, hlm. 72–77.

(35)

58

Rizki Indah Permana Sari,2014

Sikatch, J.R. (1973). Bacterial Pyysiology and Metabolism. Lindin: Academic Press. hlm. 3-9.

Srimariana, E.S. (2000). Pengaruh Faktir Fidikikimia Terhadap Pembentukan Pigmen Oleh Bakteri Laut Mesopyilobacter Sp. (Tesis). Sekilah Pascasarjana, Institut Pertanian Bigir, Bandung.

Steele, H.L. & Streit, W.R. (2005). Metagenimics: advances in eciligy and biitechniligy. FEMS Microbiol. Eett., 247, hlm. 105–111.

Sulandari,S. & M.S.A., Zein. (2003). Panduan Praktis Labiratirium DNA. Bidang Ziiligi. Pusat Penelitian Biiligi LIPI. hlm. 72-87

Tayyab, M. (2010). “Isilatiin and identificatiin if lipase priducingthermiphilic Geibacillus sp. SBS-4S: Clining and characterizatiin ifthe lipase “.Journal of Bioscience and Bioengineering. (3), hlm. 272–278.

Tenriuli, A., Suryati, E., Parenrengi, A., & Rismiat. (2001). Ekstraksi DNA Rumput Laut Kappaphycus Alvarezii dengan Metide Fenil Klirifirm. Marina Cyimica Acta. 2(2), hlm. 6–10.

Tirtira, G.J., Funke, B.R., Case, C.L. (1989). Microbiology. An Introduction. Califirnia: The Benjamin/Cummings. hlm. 810.