UJI KEBERADAAN Escherichia coli DALAM SAMPEL AIR DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION MENGGUNAKAN PRIMER

RANCANGAN PENELITIAN

UJI KEBERADAAN Escherichia coli DALAM SAMPEL AIR DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION MENGGUNAKAN PRIMER

16E1 DAN 16E2

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Tugas Kelompok Mata Kuliah Mikrobiologi

Dosen mata kuliah :

Dr. Hj. Mia Nurkanti, M. Kes Mimi Halimah, S.Pd., M.Si.,

Disusun oleh :

Kelompok 8

Lusy Sucihati 205040001 Dilla Anggraeni P 205040041 Putri Marlisa 205040043 Aulia Galih R 205040050

Kelas: Biologi A

PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN UNIVERSITAS PASUNDAN

BANDUNG 2022

JUDUL

“ UJI KEBERADAAN Escherichia coli DALAM SAMPEL AIR DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION MENGGUNAKAN PRIMER

16E1 DAN 16E2.”

TUJUAN

1. Mengetahui keberadaan Escherichia coli dalam air dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction menggunakan Primer 16E1 dan 16E2.

DASAR TEORI

Menurut organisasi kesehatan dunia (WHO), kurang lebih sepertiga penduduk dunia menderita berbagai penyakit yang ditularkan melalui air minum yang terkontaminasi oleh mikroorganisme. Setiap tahun sekitar 13 juta orang meninggal akibat infeksi yang berasal dari air minum, 2 juta diantaranya adalah bayi dan anak-anak. Mengkonsumsi air yang terkontaminasi oleh mikroorganisme patogen, baik air minum atau air yang ditambahkan ke dalam makanan, dapat menimbulkan berbagai penyakit gastrointestinal. Escherichia coli merupakan bakteri indikator kualitas air minum karena keberadaannya di dalam air mengindikasikan bahwa air tersebut terkontaminasi oleh secara konvensional, yaitu cara kultur dan uji sifat biokimia. Namun demikian metode konvensional ini pada umumnya memerlukan waktu 5-7 hari untuk mendapatkan hasil yang positif. Oleh karena itu, beberapa upaya pengembangan untuk mendeteksi Escherichia coli telah dilakukan.

Pendekatan metode molekuler dengan cara mengamplifikasi gen yang spesifik yang terdapat pada genom bakteri Escherichia coli menggunakan teknik PCR telah terbukti lebih sensitif dan spesifik serta lebih cepat dalam mendiagnosis infeksi yang disebabkan oleh bakteri Escherichia coli, maupun untuk menilai kualitas air secara mikrobiologis dan untuk mendeteksi keberadaan bakteri patogen dalam air. DNA atau gen penyandi ribosomal RNA (rRNA) Escherichia coli dalam sampel air dapat diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer yang dirancang berdasarkan sekuens DNA yang mengkodekan 16S rRNA. Salah satu pasangan primer rRNA telah didesain berdasarkan sekuens daerah V3 dan V6 dari gen 16S rRNA telah digunakan untuk mendeteksi Escherichia coli. Pasangan primer 16E1 pada daerah V3 dan 16E2 atau 16E3 pada daerah V6 merupakan sepasang primer yang telah terbukti dapat mengidentifikasi Escherichia coli dan bersifat spesifik spesies terhadap galur Escherichia coli dan non-Escherichia coli.

ALAT DAN BAHAN Alat

1. Mikrosentrifus berpendingin 2. Inkubator

3. Autoklaf

4. Laminar air flow cabinet 5. Phmeter

6. Timbangan analitik 7. Deep freezer -20 oc 8. Oven

9. Vortex mixer 10. PCR master mix 11. Gelas kimia Bahan

1. 10 sempel air sumur 2. Lisozim

3. Sodium dodesil sulfat/sds 4. Proteinase-k

5. Natrium klorida 6. Aquadest 7. Aquabidest

8. Aquabidest bebas dnase dan rnase (ddh2o) 9. Tris base

10. Etylene diamine tetra acetic acid/edta 11. Kloroform

12. Isoamil alkohol 13. Loading Buffer 14. Etidium bromida 15. Reagen Ehrlich 16. Merah metil 17. Kalium hidroksida

PROSEDUR KERJA

Penyiapan template DNA dari sempel air dengan Metode Boiling

 Sempel air dikumpulkan terlebih dahulu yang di ambil dari 10 sumur di daerah

pemukiman padat penduduk dibantaran Kali Ciliwung di kawasan Bukit Duri, Jakarta.

2 diantaranya dari sumurpompa tangan, 6 sumur lainnya dari jet pump, dan 1 diantaranya sumur timba dan 1 air PAM.

 Kemudian ambil sekitar 200ml dan ditampung dalam vial 250ml dan segea disimpan di lemari pendingin

 Sebanyak 10ml sampel disentrifus dengan kecepatan 10.000 x g selama 10 menit pada suhu 4^o.

 Kemudian pellet disuspensikam dalam 2ml Nutrient Broth dan di inkubasikanpada suhu 37 ^o selama 18-24jam.

 Sebanyak 1ml sampel dalam media Nutrient Broth dipindahkan ke tabung

mikrosentrifus 1,5ml dan disentriful selama 10 menit dengan kecepatan 14.000 x g.

 Supernatan dibuang dengan hati hati kemudian pelet dresuspensi dengan 300µL MilliQ dan disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 14.000 x g

 Kemudian pelet dresuspensi dengan 300µL MilliQ dan disentrifus selama 15 menit pada suhu 100^o dan segra dimasukan ke es.

 Setelah itu tabung disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan 14.000 x g pada suhu 4 ^o lalu supernatant dipindahkan secra hati hati ke tabungmikrosentrifus ang baru, diinkubasi kembali selama 10 menit pada suhu 100^o dan segera dimasukkan kedalam es, dan supernatant disimpan pada suhu -20^o

Amplifikasi template DNA dengan PCR

 Amplifikasi DNA dilakukan menggunakan PCR Master Mix (Fermentas) sesuai dengan prosedur yang dianjurkan oleh Fermentasi.

 Ke dalam tabung mikrosentrifus 0,5 mL dimasukkan 25 µl PCR mixture yang terdiri dari 25 μl PCR Master Mix (0,05 U/ml. Taq DNA polymerase, 0,4 mM masing- masing dNTP; 4 mM MgCl2), 2 μL Primer 16E1, 2 µL Primer 16E2, 1 μL MilliQ, dan 10 ul.

 Kemudian template DNA genomik, dimasukkan ke dalam mesin PCR dan diatur tahap-tahap PCR yaitu denaturasi 94°C, 20 detik; primer annealing 56°C, 20 detik, primer extension 72 °C. 30 detik, sebanyak 35 siklus,

 Tahap terakhir adalah Final extension 72 °C selama 10 menit.

Deteksi Escherichia coli secara Konvensional menggunakan Media Perbenihan.

 Dipipet 25,0 mL sampel ke dalam labu takar yang telah diisi dengan 225 mL larutan Buffered Pepton Water, dikocok dan dihomogenkan sehingga didapat pengenceran 1:

10.

 Kemudian dilakukan pengenceran bertingkat sehingga didapat seri pengenceran 1:

100 dan 1: 1000. Sebanyak 1,0 ml larutan dari pengenceran 10'' dipipet dan dimasukkan dalam masing-masing tiga tabung yang berisi Lactose Broth yang di dalamnya terdapat tabung Durham terbalik.

 Kemudian Cara yang sama juga dilakukan terhadap pengenceran 10 dan pengenceran 10 kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam.

 Setelah 24 jam, pembentukan gas dalam tabung Durham diamati. Bila belum terbentuk gas, maka diinkubasikan lagi selama 24 jam.

 Sebanyak satu sengkelit (ose) dari tiap tabung yang membentuk gas pada media Lactose Broth dipindahkan ke dalam tabung yang berisi 10 mL Brilliant Green Lactose Bile Broth 2% (BGLB) yang di dalamnya terdapat tabung Durham terbalik kemudian diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 37°C Escherichia coli dianggap positif jika di dalam tabung terdapat gas Uji konfirmasi bakteri Escherichia coli dilakukan secara biokimia dengan menginokulasikan biakan dalam BGLB yang positif kedalam media selektif yaitu media Eosin Methylene Blue (EMB) dan beberapa un reaksi fermentasi yaitu uji indol, methyl red, Voges Proskauer dan uji sitrat.

HASIL PENGAMATAN

BAHAN DISKUSI

1. Pengujian bakteri E.Coli ini menggunakan beberapa metode diantaranya ada yang memakai metode pcr, boiling method, dan menggunakan media pembenihan. Dari semua metode tersebut metode manakah yang mendapatkan hasil lebih baik? Dan jelaskan mengapa?

2. Bandingkan hasil pengamatan tersebut dengan beberapa metode yang dipakai?

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, Molecular Biology Catalog and Product Application Guide 2006-2007, Fermentas, Canada, 2006, p.221.

J. Sambrook, D.W. Russel, Molecular Cloning a Laboratory Manual, 3th Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001.

Radji Maksun dkk. 2010. DETEKSI CEPAT BAKTERI Escherichia coli DALAM SAMPEL AIR DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION MENGGUNAKAN PRIMER 16E1 DAN 16E2. Universitas Indonesia

World Health Organization (WHO), Guidelines for Drinking-Water Quality: First Addendum to Third Edition, Geneva, vol. 1, 2006.