Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Jumat/ 13 Mei 2022
Analisis Biokimia Waktu : 13.00-16.00
PJP : Syaefudin, PhD
Asisten : Dina Nurul Aulya Daulay
DPPH
Kelompok 3 (Grup B)
Kamilah Da’inawari G8401201060
Zaidatu Khoirun Nisa G8401201061
Fahmi Ibrahim G8401201062
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2022
PENDAHULUAN
Era modern dengan perkembangan teknologi dan ilmu pengetahuan, terjadi perubahan pola hidup masyarakat yang berdampak buruk bagi kesehatan, seperti konsumsi makanan dengan nutrisi tidak seimbang, kurang olahraga dan istirahat, kebiasaan merokok dan minum-minuman beralkohol. Selain itu, kondisi lingkungan sekitar yang memburuk seperti banyaknya polusi juga akan menyebabkan penurunan kualitas hidup masyarakat dengan adanya penurunan produksi senyawa yang menjaga kondisi tubuh, yaitu antioksidan alami yang digunakan untuk menetralisir radikal bebas yang terbentuk akibat polusi udara, sumber radiasi, zat kimia berbahaya, dan pembentukan radikal bebas lainnya.
Radikal bebas didefinisikan sebagai atom atau molekul dengan satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan dan bersifat tidak stabil, berumur pendek, dan sangat reaktif untuk penarikan elektron molekul lain dalam tubuh untuk mencapai stabilitas yang menyebabkan potensi kerusakan pada biomolekul dengan merusak integritas lipid, protein, dan DNA yang mengarah pada peningkatan stres oksidatif seperti penyakit neurodegenerative, diabetes mellitus, penyakit kardiovaskular, proses penuaan dini, bahkan kanker (Phaniendra et al. 2015). Radikal bebas cukup banyak jenisnya tapi keberadaannya paling banyak terdapat di dalam sistem tubuh adalah radikal bebas turunan oksigen atau reactive oksigen spesies (ROS) dan reactive nitrogen spesies (RNS). Radikal bebas dapat menyebabkan kerusakan sel endotel dengan cara bereaksi dengan nitrat oksida menjadi peroksinitrit (Nur’amala 2019).
Untuk mencegah terjadinya akumulasi radikal bebas yang dapat menyebabkan perkembangan penyakit kanker, diperlukan senyawa antioksidan untuk menetralkan, menurunkan dan menghambat pembentukan radikal bebas baru di dalam tubuh dengan menjadi pendonor elektron untuk radikal bebas sehingga menjadi elektron bebas dalam radikal bebas menjadi berpasangan dan menghentikan kerusakan dalam tubuh. Antioksidan dapat diproduksi secara endogen atau eksogen untuk membantu menetralkan radikal bebas yang terdapat dalam tubuh. Antioksidan endogen yang diproduksi oleh tubuh di antaranya glutation, ubiquinon, dan asam urat. Sementara antioksidan eksogen yang bersifat lebih ringan di antaranya vitamin C, E, dan beta karoten (Arnanda dan Nuwarda 2019).
Senyawa flavonoid merupakan senyawa metabolit sekunder golongan polifenol yang memiliki kemampuan berperan sebagai antioksidan dengan penangkalan senyawa radikal bebas.
Banyak penelitian yang menunjukkan kemampuan flavonoid sebagai penangkal radikal bebas.
Daun jati cina dikenal mengandung senyawa flavonoid yang tinggi sebagai antioksidan penangkal radikal bebas sehingga banyak digunakan industri sebagai obat-obatan herbal (Arnanda dan Nuwarda 2019).
Pada praktikum ini akan diuji kemampuan ekstrak daun jati cina sebagai antioksidan dalam menangkal senyawa radikal bebas dengan metode DPPH. DPPH merupakan salah satu senyawa radikal bebas yang stabil pada suhu kamar dan mempunyai panjang gelombang maksimum 515-517 nm. Tujuan praktikum ini adalah mengetahui karakteristik DPPH sebagai senyawa radikal bebas serta menganalisis kemampuan ekstrak daun jati cina sebagai antioksidan dalam menangkal senyawa radikal bebas.
METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini terdiri atas ekstrak tumbuhan, akuades, TMP, TBA 1 % ( b / v ) dalam asam asetat 50 %, trichloroacetic acid ( TCA ) 20 %, asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8 %, buferfosfat 0.1 M pH 7, dan vitamin C 200 ppm. Alat - alat yang digunakan terdiri atas tabung reaksi, gelas ukur, botol gelap, batang pengaduk, penangas air, neraca analitik, corong, spektrofotometer UV, autopipet, dan pipet kapiler.
Prosedur Percobaan
Pertama Campuran sampel terdiri atas 2 ml bufer fosfat 0.1 M pH 7 , 2 ml asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8 %, dan 1 ml larutan uji dalam akuades. Campuran kontrol tanpa perlakuan ( negatif ) dibuat sama seperti campuran sampel tetapi 1 ml larutan uji diganti dengan 1 ml akuades. Campuran pembanding ( positif ) terdiri atas 2 ml bufer fosfat 0.1 M pH 7.0, 2 ml asam linoleat 50 mM dalam etanol 99.8 % yang mengandung vitamin E sebanyak 200 ppm, dan 1 ml akuades. Semua campuran tersebut diinkubasi dalam penangas air yang bersuhu 40 ° C selama 9 hari. Pada hari terakhir inkubasi, masing - masing diambil 1 ml lalu ditambahkan 2 ml TCA 20 % dan 2 ml larutan TBA 1 % ( b / v ) dalam asam asetat 50 %. Kemudian campuran reaksi ditempatkan pada penangas air bersuhu 100 ° C selama 10 menit. Campuran reaksi didinginkan dan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit, selanjutnya diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 532 nm. Kurva standar dibuat dengan mengencerkan larutan stok pereaksi 1,1,3,3 - tetrametoksipropana ( TMP ) menjadi beberapa seri konsentrasi yaitu 1,5 ; 3 : 6 : 9 : 12 : 15 dan 18 M. Penghambatan radikal bebas ( daya antioksidan ) diukur dengan membandingkan nilai absorbansi sampel dan persamaan yang dihasilkan dari pembuatan kurva standar.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Tabel 1. Konsentrasi sampel dan kontrol dalam microplate
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0 25 25 25 1000 1000 1000 20 20 20
B 0 50 50 50 2 2 2 25 25 25
C 0 75 75 75 4 4 4
D 100 100 100 6 6 6
E 200 200 200 8 8 8
F 300 300 300 10 10 10
G 600 600 600 12 12 12
H 900 900 900 16 16 16
Tabel 2. Absorbansi sampel dan kontrol dalam microplate
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1.915 2.074 2.167 2.231 0.39 0.437 0.397 2.162 2.191 2.156 B 2.117 2.012 2.161 2.106 2.367 2.272 2.285 2.199 2.185 2.127 C 2.172 1.996 2.071 2.116 2.241 2.292 2.233
D 2.03 2.159 2.132 2.229 2.288 2.199 E 1.665 1.814 1.817 2.241 2.279 2.262 F 1.578 1.61 1.721 2.273 2.175 2.164 G 0.814 0.947 0.951 2.254 2.234 2.185 H 0.579 0.655 0.526 2.309 2.197 2.244
Tabel 2. Rerata absorbansi sampel dan kontrol dalam microplate serta persen inhibisinya
Blank Vitamin C Sampel
[Vit C] Abs Vit C % inhibisi [sampel] Abs [sampel] % inhibisi
2.068 2 2.308 -12% 25 2.157333 -4%
4 2.255333 -9% 50 2.093 -1%
6 2.238667 -8% 75 2.061 0%
8 2.260667 -9% 100 2.107 -2%
10 2.204 -7% 200 1.765333 15%
12 2.224333 -8% 300 1.636333 21%
16 2.25 -9% 600 0.904 56%
20 2.169667 -5% 800 0.586667 72%
25 2.170333 -5% 1000 0.408 80%
Gambar 1. Grafik hubungan absorbansi dengan konsentrasi sampel daun jati cina
Gambar 2. Grafik hubungan %inhibisi dengan konsentrasi sampel daun jati cina
Gambar 3. Grafik hubungan absorbansi dengan konsentrasi kontrol
Gambar 4. Grafik hubungan %inhibisi dengan konsentrasi kontrol
Gambar 5. Warna akhir sampel dan kontrol Pembahasan
DPPH (1,1-Diphenyl-2-Picrylhidrazyl) merupakan radikal bebas dengan massa molar relatif 394,33 (MrC18H12N5O6 = 394,33), bersifat stabil pada suhu kamar dan mempunyai panjang gelombang maksimum 515-517 nm. DPPH disebut radikal bebas yang stabil berdasarkan delokalisasi elektron cadangan pada molekul secara keseluruhan, sehingga molekul tidak terdimerisasi, seperti yang terjadi pada kebanyakan radikal bebas lainnya. Delokalisasi juga menimbulkan warna ungu tua, yang ditandai dengan serapan dalam larutan metanol yang berpusat pada sekitar 515-517 nm (Nur’amala 2019).
Prinsip kerja metode DPPH adalah adanya atom hidrogen dari senyawa antioksidan yang berikatan dengan elektron bebas pada senyawa radikal sehingga menyebabkan perubahan dari
radikal bebas (diphenylpicrylhydrazyl) menjadi senyawa non-radikal (diphenylpicrylhydrazine).
Hal ini ditandai dengan perubahan warna dari ungu menjadi kuning pucat hingga tak berwarna (senyawa radikal bebas te– reduksi oleh adanya antioksidan). Semakin banyak DPPH yang diredam, warna larutan semakin berubah menjadi pucat. Jika dilakukan uji kuantitatif, maka akan diperoleh absorbansi. Absorbansi yang baik untuk larutan DPPH adalah kurang dari satu (Setiawan et al. 2018).
Gambar 6. Reaksi antara DPPH dan antioksidan menjadi DPPH tereduksi
Setiyaningrum (2013) menjelaskan bahwa antioksidan merupakan suatu senyawa yang dapat menginhibisi atau menghambat reaksi oksidasi. Antioksidan bekerja dengan mengikat radikal bebas atau molekul-molekul dengan reaktivitas yang tinggi. Secara spesifik, kerja antioksidan digolongkan menjadi tiga, yakni antioksidan primer, sekunder, dan tersier.
Antioksidan primer ialah suatu antioksidan yang bekerja dengan mencegah pembentukan radikal bebas yang baru serta mengubah radikal bebas menjadi molekul yang tida merugikan. Contoh antioksidan primer ialah BHT (Beta Hidroxy Toluene), PG (Propil Galat), dan TBHQ (tert butyl hidroxy quinone). Nurmajid (2017) menjelaskan bahwa antioksidan sekunder bekerja dengan menghambat kerja prooksidan atau faktor yang mempercepat reaksi oksidasi. Antioksidan sekunder akan menangkap radikal bebas dan mencegah reaksi oksidasi berantai. Contoh dari antioksidan sekunder ialah vitamin C, vitamin E, dan betakaroten. Adapun antioksidan tersier menurut Nurmajid (2017) ialah antioksidan yang dapat memperbaiki sel suatu jaringan yang mengalami kerusakan akibat serangan radikal bebas. Antioksidan tersier umumnya berjenis enzim, seperti metionin sulfidan reduktase yang dapat memperbaiki DNA nukleus terutama pada penderita kanker.
Antioksidan menurut sumbernya digolongkan menjadi dua, yakni alami dan sintetik.
Antioksidan alami umumnya ditemukan dalam metabolit sekunder tanaman. Antioksidan alami umumnya ialah senyawa fenolik atau polifenolik, seperti flavonoid, kumarin, tokoferol, turunan asam sinamat, dan asam organik polifungsional.
Menurut kerjanya dalam sel, antioksidan digolongkan ke dalam dua kelompok, yakni antioksidan enzimatik (primer) dan nonenzimatik (sekunder). Hermund (2018) menyebutkan bahwa antioksidan primer atau chain-breaking antioxidant akan bereaksi secara langsung dengan radikal bebas dan menjadikan radikal bebas lebih stabil atau menjadi produk nonradikal.
Antioksidan primer memiliki peran penting dalam oksidasi lipid karena antioksidan primer akan
dapat bereaksi dengan radikal lipid lalu mengubahnya menjadi nonradikal sehingga mencegah dekomposisi lipid (Decker 2002 dalam Hermund 2018). Contoh dari antioksidan enzimatik ialah superoksida dismutase (SOD), catalase (COD), dan glutathione peroxidase (GSH-Px). Adapun, antioksidan nonenzimatik atau sekunder atau preventif menurut Hermund (2018) ialah antioksidan yang bekerja secara tidak langsung pada penghambatan oksidasi. Nurmajid (2017) menyebutkan bahwa antioksidan tipe ini memotong atau menangkap reaksi oksidasi berantai dari radikal bebas sehingga tidak akan bereaksi.
Gambar 7. Struktur Vitamin C (Jovic et al. 2020)
Vitamin C (Gambar 7) atau asam askorbat berdasarkan pada penelitian oleh Chambial et al. (2013) ialah suatu antioksidan yang dalam tubuh tersedia dalam bentuk tereduksi (askorbat) dan teroksidasi (asam dehidroaskorbat). Vitamin C menurut Hermund (2018) dan Nurmajid (2017) adalah antioksidan dengan mekanisme kerja sekunder. Sebagai antioksidan, vitamin C menjaga tubuh dari berbagai efek buruk radikal bebas, polutan, serta racun yang berbahaya bagi kerja tubuh. Chambial et al. (2013) menyebutkan bahwa vitamin C meningkatkan fertilitas sperma, mencegah oksidasi LDL pada media cair, membantu proliferasi sel, menghambat pertumbuhan sel enditel yang diinduksi oleh faktor nekrosis tumor alfa (TNF-alfa), dan lain sebagainya.
Sampel uji antioksidan dianalisis melalui microplate reader. Pada praktikum ini, vitamin C digunakan sebagai kontrol positif antioksidan dan daun jati cina sebagai sampel yang akan dideteksi kemampuan antioksidannya. Kontrol positif dibuat dalam 9 variasi konsentrasi, yakni 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, dan 25 ppm (Tabel 1). Di sisi lain, sampel daun jati cina juga dibuat dalam 9 variasi konsentrasi, tetapi dalam konsentrasi yang berbeda, yakni 25, 50, 75, 100, 200, 300, 600, 800, dan 1000 ppm (Tabel 1). Tabel 2 menunjukkan absorbansi microplate yang telah dianalisis menggunakan microplate reader. Niai absorbansi kemudian dirata-rata dan menghasilkan data pada tabel 3 yang selanjutnya diekstrapolasi ke dalam grafik pada gambar 1 dan 2(sampel) dan gambar 3 dan 4 (kontrol positif).
Gambar 1 atau grafik absorbansi terhadap konsentrasi sampel menunjukkan tren penurunan serta memiliki hubungan linier yang cukup kuat ditunjukkan dengan nilai regresi mendekati 1 (0,9858). Kondisi tersebut menunjukkan bahwa nilai absorbansi berbanding terbalik
dengan konsentrasi sampel. Semakin tinggi konsentrasi sampel, absorbansi akan semakin menurun. Kondisi yang demikian diperkuat dengan adanya tren kenaikan pada grafik persen inhibisi terhadap konsentrasi sampel (gambar 2) dengan regresi yang mendekati 1. Tren yang demikian menunjukkan bahwa sampel daun jati cina memiliki aktivitas antioksidan yang dapat menangkal radikal bebas. Semakin tinggi konsentrasi daun jati cina, radikal bebas DPPH yang diinhibisi juga akan semakin besar, ditunjukkan dengan penurunan absorbansi dan peningkatan persen inhibisi. Secara kualitatif, kondisi yang demikian dapat diketahui dari perubahan warna sampel yang awalnya berwarna ungu menjadi kuning (gambar 5).
Gambar 3 dan 4 atau kontrol positif pada praktikum ini diketahui cukup bertentangan dengan teori antioksidan yang dikemukakan oleh Nurmajid (2017). Grafik pada gambar 3 yang seharusnya menunjukkan tren penurunan justru menunjukkan hasil yang fluktuatif. Demikian juga dengan grafik pada gambar 4 yang seharusnya menunjukkan tren kenaikan justru menghasilkan nilai yang fluktuatif. Selain itu, regresi kurva dari gambar 3 dan 4 sama-sama jauh dari 1 yang artinya hubungan kurva tersebut tidak linear. Kurva yang seharusnya terbentuk sesuai teori ialah kurva linear dengan tren penurunan (absorbansi terhadap konsentrasi sampel) atau tren kenaikan (%inhibisi terhadap konsentrasi sampel) dan regresi mendekati 1. Sama seperti sampel daun jati cina, seharusnya semakin tinggi konsentrasi, absorbansi akan semakin rendah, persen inhibisi meningkat, dan warna akhir semakin terang karena radikal bebas yang ditangkal akan semakin besar. Kesalahan data pada grafik ini mungkin diakibatkan oleh ketidaktepatan jumlah vitamin C yang dimasukkan, DPPH yang terlalu pekat, atau human error yang tidak disadari.
Pengujian antioksidan adalah suatu uji yang aplikatif dalam berbagai bidang, baik medis, pangan, maupun industri. Antioksidan, seperti vitamin C, niacinamide, vitamin E, dan retinol kini banyak digunakan sebagai bahan skincare karena dianggap mampu mencegah atau menghambat kerusakan sel kulit. Dalam industri farmasi, antioksidan juga banyak dijual dalam bentuk vitamin yang perannya sesuai dengan jenis vitamin masing-masing. Selain itu, pada bidang medis antioksidan dianggap mampu mencegah penyakit kanker,tumor, penyempitan pembuluh darah, dan lain sebagainya (Nusantoro 2018).
SIMPULAN
DPPH merupakan senyawa radikal bebas yang stabil pada suhu kamar. Delokalisasi pada DPPH menimbulkan warna ungu tua ditandai dengan serapan metanol. Pada prinsip kerja DPPH dengan adanya atom hidrogen dari senyawa antioksidan menyebabkan perubahan warna ungu menjadi kuning pucat hingga tak berwarna yang menandakan terjadinya perubahan senyawa radikal bebas menjadi non-radikal. Senyawa antioksidan sendiri merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi oksidasi yang bekerja dengan mengikat radikal bebas.
DAFTAR PUSTAKA
Arnanda QP dan Nuwarda RF. 2019. Review article: penggunaan radiofarmaka Teknesium-99M dari senyawa glutation dan senyawa flavonoid sebagai deteksi dini radikal bebas pemicu kanker. Farmaka. 17(2): 236-243.
Chambial S, Dwivedi S, Shukla KK, John PJ, Sharma P. 2013. Vitamin C in disease prevention and cure: an overview. Indian J Clin Biochem. 28(4): 314-28. doi: 10.1007/s12291-013- 0375-3.
Hermund D. 2018. Bioactive Seaweeds for Food Applications. Cambridge (USA) : Academic Press.
Nur’amala PI. 2019. Uji aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah kecipir (Psophocarpus tetragonolobus L) dengan metode DPPH (1,1-Diphenyl-1-Picrylhidrazyl). [skripsi].
Lampung (ID): Universitas Islam Negeri Raden Intan.
Nurmajid IAP. 2017. Uji aktivitas antioksidan ekstrak etanol ubi jalar ungu (ipomoeabatatas (l.) lam) dengan metode DPPH [skripsi]. Purwokerto : Universitas Muhammadiyah Purwokerto.
Nusantoro NS. 2018. Optimasi formulasi krim kombinasi ekstrak kulit buah naga super merah (2%, 4%, 6%) (hylocereus costaricenses) dan vitamin e dengan emulgator tween 80 span 20 [skripsi]. Malang : Universitas Muhammadiyah Malang.
Phaniendra, A, Jestadi DB, Periyasamy L. 2015. Free radicals: properties, sources, targets, and their implication in various diseases. Indian J Clin Biochem. 30(1): 11-26.
Setiawan F, Yunita O, Kurniawan A. 2018. Uji aktivitas antioksidan ekdtrak etanol kayu secang (Caesalpinia sappan) menggunakan metode DPPH, ABTS, dan FRAP. Media Pharmaceutica Indonesiana. 2(2): 82-89.
Setiyaningrum Z. 2013. Aktivitas antiradikal DPPH dan kadar fenolik dari ekstrak gambir (Uncaria gambir Roxb) menggunakan metode maserasi dan soxhlet [skripsi]. Surakarta : Universitas Muhammadiyah Surakarta.
